SU999595A1

SU999595A1 - Method of preparing sample of vegetable tissue culture for cytometric analysis

Info

Publication number: SU999595A1
Application number: SU792862138A
Authority: SU
Inventors: А.В. Данилов; А.Н. Данилина; И.В. Александрова
Original assignee: Всесоюзный Научно-Исследовательский Биотехнический Институт
Priority date: 1979-12-19
Filing date: 1979-12-19
Publication date: 1986-07-07

Abstract

СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПРОБЫ КУЛЬТУРЫ РАСТИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ К ЦИТОМЕТРИЧЕСКОМУ АНАЛИЗУ путем обработки пробы мацерирующим раствором с последующим окрашиванием мацерата метипе о- вым синим, отличающийс .тем, что, с целью предотвращени повреждени клеток и повышени степени сохранени их жизнестойкости, исполь зуют мацерирующий раствор следующего состава, мае. %: 1,95-2,05 Кальций хлористый 2,45-2,55 Пектиназа Г10Х 4,95-5,05 Целлокандин ГЗХ Остальное Вода дистиллированна причем обработку пробы мацерирующим раствором ведут при температуре 26±1&deg;С в течение 4-5 ч при объемном соотношении пробы и мацерирующего раствора 1:1. (Л с О, со ;о со ел со (J о - о о Оо О СП а- упрощенные дзигурь 5- марообразные фигурыThe method of preparing plant tissue culture for cytometric analysis by treating the sample with a macerating solution followed by staining with matyrate blue type differs from that with the aim of preventing cell damage and increasing their survival rate. . %: 1.95-2.05 Calcium chloride 2.45-2.55 Pectinase G10X 4.95-5.05 Cellokandin GZH Else Distilled water and the sample is treated with a macerating solution at 26 ± 1 ° C for 4 -5 h at a volume ratio of sample and macerating solution of 1: 1. (L with O, co; o co; co (J o - oo Oo O JV a - simplified jigur 5 - marzoi figures

Description

1 Изобретение относитс к области технологии вьфащивани пересадочных культур растительных тканей, исполь зуемых в качестве продуцентов биоло гически активных веществ в различны отрасл х промышленности: пищевой, п фомерной, медицинской, в частности способам подготовки проб к цитометр ческому анализу. Под цнтометрическим анализом кул тур растительных тканей обычно пони мают: подсчет числа клеток или плотнос клеток в суспензии,, полученных в ре зультате мацерации ткани; подсчет живых и мертвых клеток в результате витального окрашивани ткани; приготовление микропрепаратов дл определени размеров клеток, Все перечисленные составл ющие цитометрического способа альтернативны . Наиболее близким по технической оснащенности вл етс способ подготовки пробы культур растительной тк ни к цитометрическому анализу, вклю чающий обработку пробы мацерирующим раствором - 20%-ным раствором хромо вой кислоты при 60 С в течение 1520 мин (соотношение ткани и мацерирующего раствора 1:3) дл определени плотности клеток. Подготовленную пробу подвергают цитометрическому исследованию. В камере Фукса-Розентал подсчитывают среднее (из шести повторностей ) число клеток в 1 мл. суспензии Затем вычисл ют среднее число клеток на 1 мг сырого веса ткани и на всю ткань в пробирке. Жизнеспособность клеток оценивают по прижизненному окрашиванию пробы метиленовым синим (0,01%), приготовленным на растворе макросолей. Определ ют среднее значение из трех повторностей (в сумме не менее 1000 кле ток) . Дл измерени размера клеток готов т давленые или резаные микропрепараты , их окрашивают ацетоорсеином или реактивом Шиффа. Наиболее существ%нными недостатками известного способа вл ютс жесткие услови мацерации, привод щие к тому, что часть клеток полностью разрушаетс или деформируетс последнее ведет к значительной ошиб5 ке при подсчете числа клеток и делает невозможной точную оценку жизнеспособности и размеров клеток; некоторое количество клеточных агрегатов остаетс неразмацерированным , что также затрудн ет точный подсчет числа клеток; субъективность .оценки живой и мертвой клетки. Таким образом, из-за жесткого, недостаточно избирательного эффекта воздействи на ткани, подвергаемые цитометрическому анализу, последний характеризуетс значительными ошибками в определении, а также определенной сложностью, так как он фактически состоит из трех отдельных операций . Определение жизнеспособности, числа и размера клеток требует применени различ шх, взаимоисключающих друг друга методов, дл которых необходимо использовать различные пробы . Целью изобретени вл етс обеспечение более щад щего и м гкого воздействи на клетки исследуемой ткани , т.е. предотвращение повреждени клеток и повьш1ение степени сохранени их жизнеспособности, в результате чего повышаетс степень точности определений при цитометрическом анализе и упрощаетс проведение анализа. Указанна цель достигаетс описываемым способом подготовки пробы культуры растительной ткани к цитометрическому анализу, заключающемс в обработке пробы мацерирующим раствором с последующим окрашиванием мацерата метиленовым синим, причем используют мацерирующий раствор следующего сотава, мае. %: Кальций хлористый 1,95-2,05 Пектиназа Г10Х 2,45-2,55 Целлокандин ГЗХ 4,95-5,05 Вода дистиллированна Остальное а обработку пробы мацерирующим раствором ведут при 2611 С в течение 45 ч при объемном соотношении пробы и мацерирующего раствора 1:1. Способ обычно осуществл ют следуюим образом. Исследуемую культурную жидкость оедин ют в равных количествах с маерирующим раствором. Инкубацию проод т при в течение 4 ч на каалке . После обработки суспензи остоит преимущественно из одиночных 3 сферических протопластов клеток, из небольшего числа мелких (не более 2-}О клеток) агрегатов, где можно легко проанализировать все клетки, а также из некоторого количества бе форменных мертвых клеток. Перед анализом материала в мацерирующую жидкость добавл ют метиленовой синий так, чтобы концентраци его составл ла 0,01%. Анализируемую суспензию помещают в гемоцитометр Фукса-Розентал и од новременно подсчитывают жизнеспособ ность кдеток, их число (плотность суспензии) и размеры.. Описываемый способ опробован на культурах тканей корн женьшен , листа родиолы розовой и листа лука репчатого. Пример 1. Цитометрический анализ культуры ткани по известному способу. Цитометрический анализ культуры ткани включает р д отдельных анализов . Мацераци ткани дл подсчета чис ла клеток (определение плотности су пензии) . Готов т раствор хромовой кислоты в концентрации 20%. I В пробирку помещают 100 мг каллусной ткани и добавл ют 20%-ную хромовую кислоту в объеме 1:3. Мацерат помещают в термостат при температуре 60 С на 15-20 мин. Вьшув пробирку из термостата, ее несколько раз энергично встр хивают и содержимое перемешивают стекл нно палочкой. Дл определени плотности суспен зии 1 мл размацерированного материа ла помещают в гемоцитометр Фукса-Ро зентал . Под микроскопом просчитывают коли чество клеток. Плотность расчитывают по формуле 1000.у V -- - - - -- 3,2 где X - плотность суспензии; у - среднее число клеток на камеру из 6 повторностей; 3,2 - объем камеры. Определение живых и мертвых клеток . Определение жизнеспособности клеток провод т, примен витальные красители. Краситель митиленовый синий гото в т в концентрации 0,01%-ного раств 5 а, в качестве растворител используют раствор макроэлементов той среды , на которой выращивают культуру. Используемую суспензию клеток помещают в раствор красител на 5 мин. Окрашенную суспензию помен ют на предметное стекло и просчитывают под микроскопом количество живых клеток (анализируют не менее 1000 клеток). Определ ют из них процент живых клеток. В клеточных агрегатах определ ют жизнеспособность. Определение размера клеток. Пробу ткани фиксируют в смеси абсолютный спирт: уксусна кислота.(3:1) Провод т гидролиз 0,1 н. НС1 при температуре 60 С в течение 10 мин и окрашивают по Фельгену. Готов т давленые препараты и окрашивают ацетоорсеином. Препарат закрьшают покровным стеклом , материал слегка дав т. Под микроскопом измер ют два диаметра клеток. Площадь клетки определ ют перемножением большого и меньшего диаметра. П р и м е р 2. Цитометрический анализ культуры ткани женьшен по эписьшаемому способу. Готов т мацерирующий раствор следующего состава, мае. %: Хлористый кальций 2 Целлокандин Г-Зх С,(-600 (Рассказовский БХЗ)5 Пектиназа Г-10х 70 ед. (Вьшшеволочский завод ферментных препаратов) 2,5 Дистиллированна вода рН 5,0-6,0ОстальСмешивают 1 мл исследуемой культуры с мацерирующим раствором в равных объемах. Перемешивают в течение 1-2 мин дл обеспечени лучшего контакта клеточной поверхности с ферментами. Пробу инкубируют в течение А ч при на качалке. Добавл ют 0,1%-ный метиленовый синий в мацерат так, чтобы концентраци краски была 0,01%. Помещают полученный мацерат в ге-моцитометр Фукса-Розентал дл определени жизнеспособности, количестваи размера клеток. Определение жизнеспособности провод т путем раздельного подсчета живых неокрашенных клеток сферической формы и мертвых бесформенных, окрашенных метиленовым синим клеток. Таким образом, в анализе используютс два четко регистрируемых параметра: форма клеток и их окраска, что обеспечивает его надежность. Количество клеток определ ют, суммиру живые и мертвые клетки (см. табл. 1, 2 , 3). Размер клеток провод т, измер диаметр протопласта, расчет ведут по формуле объема шара: R Вли ние концентр компонентов маце жизнеспособность клеток (культура1 The invention relates to the field of technology for attaining transplant cultures of plant tissues used as producers of biologically active substances in various industries: food, p dimensional, medical, in particular, methods of preparing samples for cytometric analysis. Under the methometric analysis, the cultures of plant tissues are usually understood: counting the number of cells or density of cells in suspension, obtained as a result of tissue maceration; counting live and dead cells as a result of vital tissue staining; preparation of microscopic preparations for determining cell size. All listed components of the cytometric method are alternative. The closest in technical equipment is the method of sample preparation of cultures of vegetable TK or to cytometric analysis, which includes processing the sample with a macerating solution — a 20% solution of chromic acid at 60 ° C for 1520 minutes (the ratio of tissue and macerating solution is 1: 3) to determine cell density. The prepared sample is subjected to cytometric research. In the Fuchs-Rosenthal chamber, the average number of cells per ml is calculated from six replications. suspensions. Then the average number of cells per mg of wet weight of the tissue and the total tissue in the test tube is calculated. Cell viability is assessed by the in vivo staining of the sample with methylene blue (0.01%) prepared on a solution of macroli. The mean value of three replications (in the amount of at least 1000 cells) is determined. To measure the size of the cells, crushed or cut micropreparations are prepared; they are stained with acetoorcein or Schiff's reagent. The most significant drawbacks of the known method are severe maceration conditions, which lead to the fact that a part of the cells are completely destroyed or the latter is deformed leads to a significant error in counting the number of cells and makes impossible an accurate assessment of cell viability and size; a number of cell aggregates remain unmetered, which also makes it difficult to accurately count the number of cells; subjectivity. Evaluation of living and dead cells. Thus, due to the hard, insufficiently selective effect on the tissues subjected to cytometric analysis, the latter is characterized by significant errors in the definition, as well as a certain complexity, since it actually consists of three separate operations. Determining the viability, number and size of cells requires the use of different shh, mutually exclusive methods for which different samples are to be used. The aim of the invention is to provide a more gentle and gentle effect on the cells of the tissue studied, i.e. preventing cell damage and increasing the degree of viability of their viability, resulting in an increased degree of accuracy of determinations in cytometric analysis and simplified analysis. This goal is achieved by the described method of preparing a sample of a plant tissue culture for cytometric analysis, which consists in treating the sample with a macerating solution followed by staining with macerate with methylene blue, using the macerating solution of the next sample, May. %: Calcium chloride 1.95-2.05 Pectinase G10X 2.45-2.55 Cellokandin GZH 4.95-5.05 Water is distilled Else and the sample is treated with a macerating solution at 2611 C for 45 hours at a volume ratio of sample and macerating solution 1: 1. The method is usually carried out as follows. The culture liquid to be examined is combined in equal amounts with the bulk solution. Incubation is carried out for 4 hours in a bowl. After treatment, the suspension is predominantly from single 3 spherical protoplasts of cells, from a small number of small (no more than 2–} O cells) aggregates, where all cells can be easily analyzed, as well as from a certain number of dead dead cells. Before analyzing the material, methylene blue is added to the macerating fluid so that its concentration is 0.01%. The analyzed suspension is placed in a Fuchs-Rosenthal hemocytometer and at the same time the viability of the kit, their number (suspension density) and dimensions are calculated .. The described method was tested on tissue cultures of ginseng roots, a leaf of Rhodiola rosea and a leaf of onion. Example 1. Cytometric analysis of tissue culture by a known method. Cytometric analysis of tissue culture includes a number of individual analyzes. Maceration of tissue for counting the number of cells (determining the density of the suspension). A solution of chromic acid at a concentration of 20% is prepared. I Place 100 mg of callus tissue in the tube and add 20% chromic acid in a volume of 1: 3. Macerat is placed in a thermostat at 60 ° C for 15-20 minutes. Removing the tube from the thermostat, shake it vigorously several times and mix the contents with a glass rod. To determine the suspension density, 1 ml of the disintegrated material is placed in a Fuchs-Rosent hemocytometer. Under the microscope, count the number of cells. Density is calculated according to the formula 1000.у V - - - - - 3.2 where X is the density of the suspension; y is the average number of cells per chamber of 6 replications; 3.2 - the volume of the camera. Definition of living and dead cells. The determination of cell viability is carried out using vital dyes. The dye methylen blue is ready in t at a concentration of 0.01% solution 5 a, and the solution of macronutrients of the medium on which the culture is grown is used as a solvent. The cell suspension used is placed in a dye solution for 5 minutes. The colored suspension is exchanged on a glass slide and the number of living cells is counted under a microscope (at least 1000 cells are analyzed). Of these, the percentage of living cells is determined. Viability is determined in cell aggregates. Determination of cell size. A tissue sample is fixed in a mixture of absolute alcohol: acetic acid. (3: 1). Hydrolysis is carried out with 0.1 N. HC1 at a temperature of 60 ° C for 10 minutes and stained according to Felgen. Prepared crushed preparations and stained with acetoorcein. The preparation is covered with a cover glass, the material is slightly pressed. Two cell diameters are measured under a microscope. The cell area is determined by multiplying a large and a smaller diameter. PRI mme R 2. Cytometric analysis of tissue culture of ginseng by the writing method. A macerating solution of the following composition is prepared, May. %: Calcium chloride 2 Cellokandin G-3x C, (- 600 (Rasskazovskiy BKhZ) 5 Pectinase G-10x 70 units (Vshevolochinsky plant of enzyme preparations) 2.5 Distilled water pH 5.0-6.0 OstS Mix 1 ml of the studied culture with with a macerating solution in equal volumes. Mix for 1-2 minutes to ensure a better contact of the cell surface with enzymes. Samples are incubated for A h on a rocking chair. Add 0.1% methylene blue to the macerate so that the ink concentration is 0.01%. Place the obtained macerate in a Fuchs-Rosenthal hemocytometer for determination of viability, cell number and size The viability determination is carried out by separately counting live unstained cells of spherical shape and dead, shapeless, stained with methylene blue cells.Thus, the analysis uses two clearly recorded parameters: the shape of the cells and their color, which ensures its reliability. The number of cells is determined by summing the living and dead cells (see tab. 1, 2, 3). The size of the cells is carried out by measuring the diameter of the protoplast, the calculation is carried out according to the ball volume formula: R

Концентраци компонентов , мае. %Concentration of components, May. %

Кальций Пекти-,Целлохлорис- наза |кандинCalcium Pekti-, Cellochlorisanase | Candin

тый ; tyy

0,5 1,00.5 1.0

0,50.5

Выход кле- I Жизнеспоток , %Yield of glue- I Lifetime,%

собность, %property,%

88,2 На чертеже изображены формы изме р емых клеток, получаемых известным (а) и предлагаемым (б) способами. Таким образом, описьшаемый способ позвол ет получать полностью размацерированную ткань и проводить точный подсчет числа клеток; одновременно с мацерацией витально окрашивать клетки дл определени жизнеспособности, использу при этом два четко регистрируе1 1х параметра, форму клеток и их окраску; проводить весь анализ на одной пробе, полученные данные характеризуют параметры живых клеток в абсолютных значени х. Т а б л и ц а Г исоотнощёни ющей смеси на ыход отдельных ни женьшен )88.2. In the drawing, the forms of the measured cells obtained by the known (a) and proposed (b) methods are shown. Thus, the described method allows to obtain a fully macerated tissue and to carry out an accurate count of the number of cells; simultaneously with maceration, vital staining of cells to determine viability, using two clearly recorded 1x parameters, the shape of the cells and their color; carry out the entire analysis on a single sample, the obtained data characterize the parameters of living cells in absolute values. T a l and c a G of the beneficial mixture for the exit of individual or ginseng)

X Нормальна жизнеспособность культуры находитс в пределах 70-90%.X The normal vitality of the culture is in the range of 70-90%.

Статистический анализ данньрс, полученных известным и описываемым способами по определению жизнеспособности клеток (культура ткани женьшен )Statistical analysis of danrs obtained by known and described methods for determining cell viability (tissue culture of ginseng)

99959589995958

Таблица 2 Статистический анализ данных,Table 2 Statistical data analysis

полученных известным и описываемым способами по определ(ению количества клеток (культура ткани женьшен )obtained by known and described methods to determine (the number of cells (tissue culture ginseng)

Данные по количеству клеток х10Data on the number of cells x10

,8 271 ,74 Gil 11,42 272 ,97 ,95 270 ,95, 8 271, 74 Gil 11.42 272, 97, 95 270, 95

таблица 3 table 3

274274

270270

268268

271271

270270

Claims

METHOD FOR PREPARING A VEGETABLE CULTURE SAMPLE FOR A CYTOMETRIC ANALYSIS by treating the sample with a macerating solution followed by staining the macerate with methylene blue, characterized in that, in order to prevent damage to the cells and increase the degree of preservation of their viability, they use macea. %:

Calcium chloride

Pectinase G10X

Cellocandin GZH Distilled Water Following

1.95- 2.05

2.45-2.55

4.95-5.05. The rest, moreover, the sample is treated with a macerating solution at a temperature of 26 ± 1 ° C for 4-5 hours at a volume ratio of the sample and macerating solution of 1: 1.

cg - simplified figures b ~ spherical figures

SU, .. 999595>