SU979508A1

SU979508A1 - Process for preparing immobilized plasminogene

Info

Publication number: SU979508A1
Application number: SU802960037A
Authority: SU
Inventors: Станислав Александрович Кудинов; Ирина Михайловна Бабенко; Светлана Петровна Мацуй
Original assignee: Ордена Трудового Красного Знамени Институт Биохимии Им.А.В.Палладина
Priority date: 1980-07-23
Filing date: 1980-07-23
Publication date: 1982-12-07

Description

(54)) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ПЛАЗМИНОГЕНА.(54)) A METHOD FOR OBTAINING AN IMMOBILIZED PLASMINOGEN.

Изобретение относитс к технологии получени шммобилизёванных препаратов и может быть использовано S фермептней пр(.- г/ышленности и медицине , а именно в медицине в терапевтических цел х, поскольку целый р д заболеваний человека обуслевлен специфической ферментной недостаточностью .The invention relates to the technology of obtaining mobile mobilized preparations and can be used by S farm companies (medicine and medicine, specifically in medicine for therapeutic purposes, since a number of human diseases are caused by specific enzyme deficiency).

Иммобилизаци биологически активных соединений, в частности ферментов , широко используетс дл их МОДИImmobilization of biologically active compounds, in particular enzymes, is widely used for their MODIs.

фикации.--Таким способом повышак1Т температурную стабильность ферментов, устойчивость к действию денатурирующих агентов, продлевают врем действи ферментов.fakatsii .-- In this way, the temperature stability of enzymes, resistance to the action of denaturing agents, increases, the duration of enzymes is prolonged.

Плазминоген - профермент основного компонента противосверты заю1цей системы крови плазмина, основна физиологическа роль которого - лизис образовавшихс фибриновнх сгустков (тромбов ).Plasminogen is the proenzyme of the main component of the anticoagulants of the borrowed system of plasmin's blood, the main physiological role of which is the lysis of fibrin clots (thrombus) formed.

Известны способы иммобилизащии плазминогена с помощью ковалентного св зывани с носителем. Например, способ иммобилизации плазминогена на активированной бромцианом сефарозе С13.Methods are known for immobilizing plasminogen by covalent binding to a carrier. For example, the method of immobilization of plasminogen on activated cyanogen bromide Sepharose C13.

Наиболее близким к предлагаемому вл етс способ иммобилизации плазминогена на активированной, бромцианем с,ефарозе. Полученные по этому способу препараты иммобилизованного плаз1 многена содержат 0,7 - 1,3 мг белкг на 1 г сухой сефарозы, а удельна активность препарата после активации составл ет 1,5-3,1 каарлнолитн10 ческих единиц на 1 мг белка 2 .The closest to the proposed method is the immobilization of plasminogen on activated bromine c, eparose. The preparations of immobilized plasti polypea obtained by this method contain 0.7–1.3 mg proteing per 1 g of dry sepharose, and the specific activity of the preparation after activation is 1.5–3.1 karlolitol units per 1 mg of protein 2.

Недостатком указанных способов вл етс то, что иммобилизацию плазминогена осуществл ют путем ковалентного св зывани , в результате чего The disadvantage of these methods is that the immobilization of plasminogen is carried out by covalent bonding, as a result of which

15 снижаетс фибринолитическа активность и ПОЭТОМУ препараты не могут испЬльзеватьс в медицинских цел х.Fibrinolytic activity decreases and, therefore, drugs cannot be used for medical purposes.

Цель изобретени - повышение удельной активности целевого продукта.The purpose of the invention is to increase the specific activity of the target product.

2020

Поставленна цель достигаетс тем, что согласно способу получени иммобилизованного плазминогена с использованием в качестве носител активированной бромицианом сефарозы, The goal is achieved by the fact that according to the method of obtaining immobilized plasminogen using activated bromician sepharose as a carrier,

25 в качестве носител используют св занную с фибриногеном активированную бромцианом сефарозу, а иммобилизацию провод т в 0,1 М фосфате натри рН 7,6 с последующим удалением не30 специфически сорбированного плазминогена промывкой тем же буфером с добавлением 0,5 М хлористого натри При услови х аффинной иммобилизации происходит сорбционное св зывание фермента с носителем на основ естественного биоспецифического сре ства, что позвол ет получить препар ты с регулируемой способностью эк тивироватьс в плазмин. Аффинное св зывание плазминогена, а после его активации и плазмина, с фибрино геном реализуетс не через активный центр, а через лизин-св зывающие /частки. Активный центр плазмина при соединении с фибриногеном остаетс свободным-и способен взаимодействовать с белковыми субстрами, в частности с.казеином. Пример 1, Активацию сефаро осуществл ют по обычной методике, Бычий фибриноген подвергают диализу против ОД М фосфатного буфера при рН 7,8 на колоде в течение 24 ч против 10 л буфера. Затем к 16 мп активированной сефарозы добавл ют 71 мл отдиализированного фибриногена, Реак ци св зывани протекает при 4°С под аргоном в течение 19 ч-. Несв завший с фибриноген отмывают последователь но 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,8 (2-3 л), 0,1 М трис-фосфатным буфером , рН 8,6;1 М хлористым натрием, 0,025 И Е-аминокапроновой кислотой (3 л), 0,1 М трис-фосфатным буфером рН 4,1 ; 1 М хлористым натрием и 0,025 М 8-аминокапроновой кислотой, рН 7,6 (2 л;, 0,1 М НзРО4 и 0,2 М глицерином (2 л) 0,05 М трис-НзРО4 0,1 М хлористыгл натрием 0,025 М б-аминокапроновой кислоты рН 7,6 12л Отмытую фибриноген-сефарозу хран т при 4°С с МаМОз, Эффективность св зывани - 0,150 г фибриногена на 1 г сефарозьи (сухой) или 40 мг на 1 мл серофазы, 4 мл плазминогена в 0,1 М фосфатном буфере, рН с концентрацией белка 1 мг/мл и удель В 1 и 2 опыте исходна активность 10 ке/мг; в 3-6 опытах исходна активность. С, 5 ке/мг. ной активностью 10 ке/мг медленно пропускают через 1 мл ( осевшей ) фибриноген-сефарозы , упакованной в капилл рную колонку. Неспецифически сорбированный плазМиноген удал ют промыванием колонки этим же буфером,. а затем буфером с добавлением 0,5 М хлористого натри до исчезновени белка в промывных водах. На геле иммобилизуетс 2 мг плазминогена. удельна активность плазминоген-фибриноген-сефарозы после активации стрептокиназой 10 ке/мг сорбировавиюгос профермента. Через этот плазмино- гвн-фибриноген-гель таким же способом пропущено 2 мл раствора плазминогена, содержащего 2 мг белка. После удалени неспецифически сорбировавшегос плаз№1ногена на геле иммобилизовалось еще 2 мг белка, удельна активность гел ке/мг, Пример 2, Через колонку, заполненную 2 г-ет фибриноген-сефарозы пропущено ( как описано в примере I) 2 мл плазминогена с концентрацией 5 мг/мл- и удельной активностью 6,5 ке/мг. Затем удал ют неспецифически св завшийс белок (как описано в примере 1), На фибриноген-сефарозе им1 1обилизовапось 3,8 мг белка на 1 мл гел , Удельна активность гел 5,6 ке/мг,. Через полученную плазминоген-фибриноген-сефарозу тризиды пропускают по 2 мл раствора плазминогена, содержащего 15 мг белка. После каждого пропускани гель отмывают от неспецифически св завшегос белка(пример 1), После 1,2 и 3-го пропускани плазмн л ногена содержание плазминогена в препарате составл ет соответственно 15,4; 22,4 и 30,0 мг белка,, а удель-7 на активность снижаетс до соответственно 2,3/ 1,5 и 0,8 ке/мг. Результаты испытаний приведены в таблице .25, activated with cyanogen bromide-activated sepharose coupled with fibrinogen, immobilization is carried out in 0.1 M sodium phosphate pH 7.6, followed by removal of non-specifically sorbed plasminogen by washing with the same buffer with 0.5 M sodium chloride. Under conditions By affinity immobilization, sorption binding of the enzyme to the carrier occurs on the basis of a natural biospecific medium, which makes it possible to obtain preparations with a controlled ability to be enhanced into plasmin. The affinity binding of plasminogen, and after its activation and plasmin, with the fibrino genome is not realized through the active center, but through lysine-binding / fragments. The active center of plasmin, when combined with fibrinogen, remains free and is able to interact with protein substrates, in particular with casein. Example 1 Sepharo activation is carried out in the usual manner. Bovine fibrinogen is dialyzed against OD M phosphate buffer at pH 7.8 on the deck for 24 hours against 10 liters of buffer. Then, 71 ml of dialyzed fibrinogen is added to 16 mp of activated sepharose. The coupling reaction proceeds at 4 ° C under argon for 19 hours. Withered with fibrinogen, sequentially washed with 0.1 M phosphate buffer, pH 7.8 (2-3 l), 0.1 M tris-phosphate buffer, pH 8.6; 1 M sodium chloride, 0.025 And E-aminocaproic acid (3 l), 0.1 M Tris-phosphate buffer pH 4.1; 1 M sodium chloride and 0.025 M 8-aminocaproic acid, pH 7.6 (2 l ;, 0.1 M HzRO4 and 0.2 M glycerol (2 l) 0.05 M Tris-HzRO 0.1 M sodium chloride 0.025 M b-aminocaproic acid pH 7.6 12L Washed fibrinogen-sepharose is stored at 4 ° C with MAMOZ. Binding efficiency is 0.150 g of fibrinogen per 1 g of sepharose (dry) or 40 mg per 1 ml of serophase, 4 ml of plasminogen in 0 , 1 M phosphate buffer, pH with protein concentration 1 mg / ml and specificity in 1 and 2 experiments initial activity 10 ke / mg, in 3-6 experiments initial activity C, 5 ke / mg activity of 10 ke / mg slowly passed through 1 ml (settled) f ibrinogen-sepharose, packed in a capillary column. Nonspecifically sorbed plasminogen is removed by washing the column with the same buffer, and then with buffer with 0.5 M sodium chloride until the protein disappears in the wash water. On the gel, 2 mg of plasminogen is immobilized. -fibrinogen-Sepharose after activation with streptokinase 10 ke / mg sorption of pro-enzyme. Through this plasmin-gvn-fibrinogen-gel, 2 ml of plasminogen solution containing 2 mg of protein was passed in the same way. After removal of non-specifically sorbed plasmogen, another 2 mg of protein was immobilized on the gel, the specific activity of the gel / mg, Example 2, 2 ml of plasminogen with a concentration of 5 g were passed through a column filled with 2 g of fibrinogen-sepharose. mg / ml - and specific activity of 6.5 ke / mg. The non-specifically bound protein was then removed (as described in Example 1), Fibrinogen-Sepharose imi-1 was expanded, 3.8 mg of protein per 1 ml of gel, the specific activity of the gel was 5.6 ke / mg. Through the obtained plasminogen-fibrinogen-sepharose trizida miss 2 ml of plasminogen solution containing 15 mg of protein. After each pass, the gel is washed from non-specifically bound protein (example 1). After the 1.2 and 3rd passes of plasma nogene, the content of plasminogen in the preparation is respectively 15.4; 22.4 and 30.0 mg of protein, and the specificity-7 per activity decreases to 2.3 / 1.5 and 0.8 ke / mg, respectively. The test results are shown in the table.

Таким образом, плаэминоген при св зывании с фибриноген-.офароэой в количестве 2 мг на мл гел полностью сохран ют свою активность после активации стрептокиназой. Посл активации стрептокиназой активность: плазмина обнаруживаетс только в фракции гел и гель может быть многократно использован дл определени активности. Это указывает на то, что после активации плазминогена в плазмин он остаетс в св занном с носителем состо ний.Thus, the plaminogen when bound to fibrinogen-α. Pharoeoy in an amount of 2 mg per ml of gel completely retains its activity after activation by streptokinase. After activation by streptokinase activity: plasmin is detected only in the gel fraction and the gel can be repeatedly used to determine activity. This indicates that after activation of plasminogen to plasmin, it remains in a carrier-related state.

Активность полученных препаратов иммобилизованного плазминогена после активации стрептокиназой близко к исходной активности растворимого плазминогена и значительно превышает удельную активность препаратов, полученных при ковалентной иммобилизации плазминогена 2 3,The activity of the obtained preparations of immobilized plasminogen after activation by streptokinase is close to the initial activity of soluble plasminogen and significantly exceeds the specific activity of preparations obtained by covalent immobilization of plasminogen 2 3,

Использу предлагаемый способ иммобилизации, можно достигнуть полного сохранени активности плазминогена при иммобилизации,- создавать препараты, обладакицие большой емкостью по отношению к плазминогену дл обеспечени организма тромболитическим агентом в случае его дедостаточности; целена5травленр создаватЬ лекарс твенныепрепарйы с заданными свойствами п 5 количеству иммобилизованного плазминогена и активности.Using the proposed method of immobilization, it is possible to achieve complete preservation of the activity of plasminogen during immobilization — to create drugs with a high capacity in relation to plasminogen to provide the body with a thrombolytic agent in the case of dehydration; Tselena5travlenr create drugs preprepary with the given properties n 5 the number of immobilized plasminogen and activity.

Этот способ может быть использован в медицинских цел х дл созданн лекарственных препаратов тромболитического действи .This method can be used for medical purposes to create drugs of thrombolytic effect.

В отличие от ковалентного св зывани , иммобилизацию плазминйгена осуществл ют сорбционно на основе естественного бирспецифического срод .ства, что позвол ет получить препараты с регулируемой способностью активироватьс в плазми.In contrast to covalent bonding, immobilization of plasminigen is sorbed on the basis of natural cyrspecific affinity, which makes it possible to obtain drugs with adjustable ability to be activated in plasmas.

Claims

1.HasaakI Horoi.Nobuo Aoki Isolation and Characterization of "SjPI InhIЫtor from Human Plasma, Joftrnaf of Bfotogical Chemlctry,

0 1376, V, 25t, p. 5956-5965.

2. KUDINOV. C.A., Eretska, E.V.Plasminogen activation with itsFlobilization. Ukrainian Biochemical Journal. T. 51 1979, 4, pp.340-344.