SU913254A1

SU913254A1 - Способ выделения нейронов из нервной ткани моллюсков

Info

Publication number: SU913254A1
Application number: SU792742214A
Authority: SU
Inventors: Marina A Kostenko; Tatyana I Smolikhina
Original assignee: Inst Biologicheskoi Fiz
Priority date: 1979-03-27
Filing date: 1979-03-27
Publication date: 1982-03-15

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к нейрофизиологии и нейрофармакологии для исследования действия физиологически активных соединений на различные функциональные и электрофизиологические параметры нейронов.

Известен способ выделения нейронов из нервной ткани моллюсков путем обработки нервной ткани раствором проназы, приготовленном на физиологическом растворе, содержащем хлорис· тый натрий, хлористый калий, хлористый кальций, хлористый магний, с пос

ледующей дезагрегацией ткани на отдельные нейроны ИЗ.

Однако этот способ не обеспечивает высокой жизнеспособности нейронов, что ведет к получению малого количества выделяемых нейронов, пригодных к исследованию.

Целью изобретения является повышение жизнеспособности нейронов.

Цель достигается тем, что при осуществлении способа выделений нейронов из нервной ткани моллюсков путем обработки нервной ткани раствором проназы, приготовленном на фи⁵ зиологическом растворе, содержащем хлористый натрий, хлористый калий, хлористый кальций, хлористый магний, с последующей дезагрегацией ткани на отдельные нейроны, физиологический

⁰ раствор для проназы дополнительно содержит кислый углекислый натрий, а компоненты раствора взяты в следующем соотношении, мМ:

Хлористый	натрий	90-11	Ι0
Хлористый	калий	4 - 6
Хлористый	кальций	1,8 - 2;	>2
Хлористый	ма гний	0,8 - 1,	,5
Кислый углекислый
натрий		3 - 5

при этом перед дезагрегацией ткань выдерживают при рН 7,5 - 7,8 в 4θ°ί~ ном растворе среды Игла, разведенной физиологическим раствором при рН 5,5.

3 913254

4

Способ осуществляют следующим образом.

Окологлоточные нервные кольца моллюсков помещают на 1 ч в физиологический раствор с компонентами в следующем соотношении, мМ:

Хлористый натрий 90 - 110

Хлористый калий 4-6

Хлористый кальций 1,8 - 2,2

Хлористый магний 0,8 - 1,5

Кислый углекислый

натрий 3 “ 5

при рН 7.5 ’ 7,8 среды и содержащий 0,5% проназы из расчета по 2 мл раствора 2 мг нервной ткани при 18-20*С. Затем нервную ткань споласкивают чистым солевым раствором и на 1-2 ч помещают в промежуточный раствор слё-

дующего состава, мМ:
Хлористый	натрий	80
Хлористый	калий	1
Хлористый	кальций	0,5
Хлористый	магний	1,5
при рН 5,5 и	содержащий 40%	амино-

кислот и витаминов среды Игла, но без бикарбоната, фосфатов и других буферов, по 2 мл раствора на одно нервное кольцо. Затем нервную ткань ₍переносят в бессывороточную питательную среду для культивирования и пипетируют ткань до полной дезагрегации клеток.

,0

15

20

25

30

Пример 1. Для получений изолированных нейронов окологлоточные нервные кольца моллюсков Лутпаеа зРад-³⁵паПз (прудовик большой)» помещают на 1 ч в солевой раствор следующего ионного состава, мМ: ИаС1 100; КС1 5; СаС1_г 2; МдС1_г13; КаМСОд 5; рн 7,8, содержащий 0,5% проназы из рас- ⁴⁰чета по 2 мл раствора,на 2 мл нервной ткани, при 18-20°С-. Нейроны при этом остаются внутри ганглиев, так как оболочки нервного кольца при действии фермеИта_>не разрушаются. Затем ⁴⁵нервные кольца споласкивают от фермента чистым солевым раствором и на 1 ч помещают в промежуточный раствор следующего ионного состава, мМ: №аС1 10; КС1 0,5; СаС1₂0,1; М§С12.0,5; рН ⁵⁰5,3, содержащий 40% аминокислот и витаминов среды Игла, но без бикарбоната и фосфата, по 2 мл раствора на одно нервное кольцо. После этого нервные кольца переносят в бессывороточ- ⁵⁵ную питательную среду для культивирования и пипетируют ткань до полной дезагрегации клеток. Количество выделенных таким образом нейронов составляет 1000 на 1 нервное кольцо.

Пример 2. Выделяют нейроны из окологлоточных нервных колец .Тутпаеа зРадпаНз (прудовик большой) или ПапогЬагриз сотпеиз (катушка роговая), при этом нервные кольца помещают на 1 ч в солевой раствор следующего ионного состава, мМ: МаС1 100; КС1 5; СаС1_г2; МдС!^ ,2; МаНСО 4,0; рН 7,70 содержащем 0,5% проназы из расчета по 2 мл на одно нервное кольцо, при 18-20^гС. Затем нервные кольца споласкивают от фермента чистым солевым раствором и на 1,5 ч помещают в промежуточный раствор следующего ионного состава, мМ: МаС1 75; КС1 0,75; СаС1_х 0,3; МдС1^ 1,0; рН 5,4, содержащий 40% аминокислот и витаминов среды Игла. После этого нервную ткань переносят в бессывороточную питательную среду для культивирования ₍и пипетированием выделяют нейроны. Количество выделенных нейронов составляет 900 на 1 нервное кольцо.

Пример 3· Выделяют нейроны из окологлоточных нервных колец моллюсков Дутпаеа зРадпаПз (прудовик большой) или Р1алогЬаг1из сотеиз (катушка роговая). Для этого нервные кольца помещают на 1 ч в солевой раст вор следующего ионного состава, мМ: МаС1 110; КС1 6; СаС1^ 2^2; ЧдСХд.

1,5;'Ъ1аНС0з 5,0; рН 7,8, содержащий 0,5% проназы по 2 мл раствора на одно нервное кольцо при 18-20°С. Затем нервные кольца споласкивают от фермента чистым солевым раствором и на 2 ч помещают в промежуточный раствор следующего ионного состава, мМ: ЫаС1 80; КС1 1; СаС1₂ 0,5; МдС1_г 1,5; рН 5,5, содержащий 40% аминокислот и витаминов среды’ Игла. После этого нервную ткань переносят в бессывороточную питательную среду для культивирования и пипетированием выделяют нейроны. Количество выделенных нейронов составляет 800 на 1 нервное кольцо.

I

Пример 4. Выделяют нейроны из окологлоточных нервных колец НеНх ротарра (виноградная улитка). У£ловия выделения те же, что и в примере 1. Выход составляет 800 нейронов на 1 нервное кольцо.

Пример 5. Выделяют нейроны из окологлоточных нервных колец Ηεϋχ ротаРРа (виноградная улитка). Условия выделения те же, что в примере 2. Вы5 9

ход составляет 900 нейронов на 1 нервное кольцо»

Пример 6. Выделяют нейроны из окологлоточных нервных колец ίίβΐΐχ рошаНа (виноградная улитка). Условия аналогичные примеру 3. Выход составляет 1000 нейронов на 1 нервное кольцо.

Таким образом, предложенный способ позволяет повысить жизнеспособность нейронов,' что увеличивает количество получаемых нейронов до 800-1000 на одно нервное кольцо, тогда как при использовании известного способа только 100-150 на одно нервное кольцо, 15 при этом время жизни нейронов в культуре увеличивается с 2 недель (известный способ) до 1 ,5-2 месяцев и все жизнеспособные нейроны способны регенерировать аксоны. 20

Claims

Формула изобретения

Способ выделения нейронов из нервной ткани моллюсков путем обработки

нервной ткани раствором проназы, при1

3254 6

готовленным на физиологическом растворе, содержащем хлористый натрий, хлористый калий, хлористый кальций, хлористый магний с последующей дезаг

5 регацией ткани на отдельные нейроны, отличающийся тем, что, с целью повышения жизнеспособности нейронов, физиологический раствор для проназы дополнительно содержит ^,0 кислый углекислый натрий, а компонен· ты раствора взяты в следующем соотношении , мМ:

Хлористый натрий 90 " ИО

Хлористый калий 4-6

Хлористый кальций 1,8— 2,'2

Хлористый магний 0,8 - 1,5

Кислый углекислый

натрий 3-5

при этом перед дезагрегацией ткань выдерживают при рН 7,5-7,8 в 40%-ном растворе среды Игла, разведенной физиологическим раствором при рН 5»5.