SU909635A1

SU909635A1 - Leykocyte osmotic resistance determination method

Info

Publication number: SU909635A1
Application number: SU802938624A
Authority: SU
Inventors: Василий Васильевич Демьяненко; Светлана Михайловна Демьяненко
Original assignee: Мордовский государственный университет им.Н.П.Огарева
Priority date: 1980-05-07
Filing date: 1980-05-07
Publication date: 1982-02-28

Description

Изобретение относитс к биологии и может быть использовано в клиниколабораторных гематологических исследовани х .The invention relates to biology and can be used in clinical and laboratory hematological studies.

Известен способ изучени осмотической резистентности лейкоцитов, заключакадийс в инкубации изолированных лейкоцитов в гипоосмол рной среде, содержащей краситель, с последуклцим подсчетом неразрушенных клеток в счетных Кс1мерах 1.There is a method of studying the osmotic resistance of leukocytes, concluded in the incubation of isolated leukocytes in a hypoosmolar dye-containing medium, with subsequent counting of intact cells in countable Xs1.

Недостатком указанного способа вл етс качественный характер реакции, длительность анализа (свыше 3ч), значительна трудоемкость (подсчет клеток осуществл етс п тикратно в течение 3ч).The disadvantage of this method is the qualitative nature of the reaction, the duration of the analysis (over 3 hours), considerable labor intensity (the cells are counted five times during 3 hours).

Известен также способ количественной регистрации реакции аллергического лейкоцитолиза, заключающийс в автоматической регистрации изменений суммарного электрического сопротивлени взвеси изолированных лейкоцитов при инкубации их с аллергеном 2.There is also known a method for quantitatively recording the reaction of allergic leukocytolysis, which consists in automatically recording changes in the total electrical resistance of a suspension of isolated leukocytes when incubating them with an allergen 2.

Недостатком известного способа вл етс применимость его. лишь дл регистрации реакции специфического аллергического лейкоцитолиза без учета уровн неспецифической резистентности лейкоцитов к гипоосмотическому фактору.The disadvantage of this method is its applicability. only to register the reaction of specific allergic leukocytolysis without taking into account the level of nonspecific resistance of leukocytes to the hypoosmotic factor.

Цель изобретени - повышение эффективности и точности определени .The purpose of the invention is to increase the efficiency and accuracy of the determination.

Указанна цель достигаетс тем, что в способе определени осмотической резистентности лейкоцитов , включающем измерение суммар10 ного электрического сопротивлени лейкоцитарной взв.еси в инк бационной среде, в качестве инкубационной среды используют гипоосмол рнук)This goal is achieved by the fact that in the method for determining the osmotic resistance of leukocytes, including the measurement of the total 10 electrical resistance of leukocyte suspension in an incubation medium, the hypo ол resin is used as the incubation medium)

., смесь, состо щую из 50 мл 1,3-10 5-10 И буферного раствора с рН 6,6 8 ,0, лейкоцитарную, взвесь внос т в количестве 100.- 250 мкл, после чего полученную среду внос т в конт2Q рольную и опытную кюветы кондукто-, метрической установки, затем в конт- рольную К1овету добавл ют 0,15,0 ,05 мл ингибитора протеолиза и измер ют изменение суммарного электрического сопротивлени лейкоцитарной ., a mixture consisting of 50 ml 1.3-10.5-10 and a buffer solution with a pH of 6.6-8, 0, leukocyte, suspension is added in an amount of 100.- 250 µl, after which the resulting medium is introduced into cont. pitch and test cuvettes of a conduct- ment, metric installation, then 0.15.0, 05 ml of a proteolysis inhibitor is added to the control board of the Council, and the change in total electrical resistance of the leukocyte is measured.

25 взвеси в опытной кювете по отношению к контрольной.25 suspended in an experimental cuvette in relation to the control.

В качестве ингибитора протеолнза используют контрикал или тразилол в 30 дозе 1000-6000 Ед. На фиг. 1 изображена осмотическа лейкограмма при граничных значени х .параметров способа; на фиг. 2 :то же, по средним значени м парамет ;ров способа. Пример. Приготовление инкубационной смеси. В пробирку, содержащую 5,0 мл 1,2510М трислимонного буфера, внос т 200 мкл лейковэвеси в аутоплазме. Полученную инкубационную смесь по 2,25 мл внос т в контрольную и опытную кюветы коцдуктометрической установки. Реакци в контрольной пробирке ингибируетс добавлением 0,05 мл контрикала . При реакци продолжаетс 45 мин (табл. i). Обработка графической записи заключаетс в количественной оценке интенсивности осмотического лизиса лейкоцитов по формуле R - BVq - t-c где в - отклонение пера самопишущего милливольтметра, мм; t - врем реакции, мин;У - объем взвеси лейкоцитов в аутоплазме, равный 200 мк q - коэффициент разведени лейко-.взвеси , равный 26; Се - содержание лейкоцитов в 1 мкл лейковзвеси; Щпоказатель интенсивности гипоосмол рного лейколизиса в условных единицах. Поскольку значени V и q вл ют с посто нными величинами, то выражение -- представл ют в виде коэф фициента значени которого измен ю с в зависимости от содержани лейкоцитов в 1 мкл лейковзвеси (С( )f а выражение,(1) представл ют в вид формулы -f4.. Значени коэффициента k в завис мости от уровн лейкоцитов в 1 мкл лейковзвеси (С) представлены в табл, 1. .О скорости лизиса лейкоцитов в гипоосмол рноЗ среде, т.е. о характере их осмотической резистентности суд т также по осмотическим лейко раммам (фиг. 1 и 2), где по оси ординат откладывают процент разрушенных клеток, а по оси абсцисс - , врем изменени реакции в минутах. Дл этого определ ют процент сдвига писчика за равные интервалы времени 40 -9 , 9 -18 , 18-27 , 27 -Зб ,. , принима максимальное откл нение писчика BZ,S за lOCI %. П р и м е р2. Концентрацию буфе ного раств.ора дл работы с серийной кондуктометрической установкой, например Фермент-1, определ ют требованием к соблюдению мийимально ро фона, т. е. обеспечением минимального вклада концентрации носителей электрических зар дов буферного раствора в суммарную электропроводность инкубационной смеси в ходе реакции субстрат - фермент. Оптимальные значени концентраций буферных растворов дл указанных целей наход тс в пределах 10 5 ,. Концентраци субстрата при кондуктометрических исследовани х лежи в диапазоне . Опытным путем нами установлено, что кинетическа крива реакции гипоосмол рного лейколизиса сохран ет линейный характер при объеме лейкоцитарной взвеси от 60 мкл до 300 мкл, однако при объеме лейковзвеси 60 - 100 мкл угол наклона кривой слишком мал. Наилучшие результаты реакциигипоосмол рного лейколизиса достигают при объеме лейковзвеси 150 250 мкл (табл. 2). Объем инкубационной смеси в измерительных кюветах (2,25 мл) кондуктометрической установки, например ФермеНт-1, определен емкостью ее кювет (2,5 мл). JJнгибитЬp протеолиза в контрольной кювете (контрикал или тразилол) .используют в концентрации 1000 бООО Ед в объеме 0,05 - 0,15 мл. Пример определени осмотической ре истентности лейкоцитов при граничных значени х параметров приведен л .в табл.. 2. Уровень электропроводности в зма- . чительной мере зависит от температуры , при которой протекает исследуема реакци . Поэтому все кондук-, тометрические измерени провод т с об зательным и строгим соблюдением посто нства значений температуры в измерительных кюветах. Предлагаемый способ в значительной мере автоматизирован, требует в 4 раза меньших затрат времени, по сравнению с известным качественным j способом обладает более высокой точностью (ошибка кондуктометрического способа не превышает 4 %, тогда как ошибка метода при подсчете лейкоцитов в камере составл ет 7 %). Таблица As a protein inhibitor, kontrakal or trasilol in 30 doses of 1000-6000 Units is used. FIG. 1 shows the osmotic leukogram with the boundary values of the method parameters; in fig. 2: the same, by the mean values of the parameters of the method. Example. Preparation of incubation mixture. 200 µl of leukovesi in autoplasma was added to a tube containing 5.0 ml of 1.2510 M trislimon buffer. The resulting incubation mixture, 2.25 ml each, is introduced into the control and test cuvettes of a co-ductometric installation. The reaction in the control tube is inhibited by the addition of 0.05 ml contrikal. When the reaction lasts 45 minutes (Table i). The processing of a graphical record consists in quantifying the intensity of the osmotic lysis of leukocytes using the formula R - BVq - tc where in is the deviation of the pen of a recording millivoltmeter, mm; t is the reaction time, min; Y is the volume of leukocyte suspension in autoplasma, equal to 200 microns; q, the dilution factor of the suspension, equal to 26; Ce is the content of leukocytes in 1 μl of leukemia; The indicator of the intensity of hypo-cosmolar leukolysis in arbitrary units. Since the values of V and q are with constant values, the expression - is represented as a coefficient whose values change with depending on the content of leukocytes in 1 µl of leukovaciu suspension (C () f and the expression, (1) are in type of formula -f4 .. The values of the coefficient k depending on the level of leukocytes in 1 µl of leuco-suspension (C) are presented in Table 1. 1. The rate of lysis of leukocytes in the hypo-osmolar environment, i.e., the nature of their osmotic resistance is judged on osmotic leuko rammam (Fig. 1 and 2), where the ordinate axis is deposited a percentage of times broken cells, and on the abscissa axis, the reaction time in minutes. To do this, determine the percentage of the shift of the scribe for equal time intervals 40-9, 9-18, 18-27, 27 -3b., taking the maximum deviation of the scribe BZ , S for lOCI%. EXAMPLE 2 The concentration of a buffered mortar for working with a serial conductometric installation, for example, Enzyme-1, is determined by the requirement of observing minimal shedding, i.e. ensuring the minimum contribution of the concentration of electrical carriers charges of buffer solution in total electrical conductivity incubation th mixture during the reaction substrate - enzyme. The optimal concentrations of buffer solutions for these purposes are within 10 5,. The concentration of the substrate in conductometric studies lie in the range. Experimentally, we found that the kinetic curve of the reaction of hypo-cosmolar leukolysis remains linear with a volume of leukocyte suspension from 60 µl to 300 µl, but with a volume of leukemia 60 - 100 µl, the slope of the curve is too small. The best results of the reaction of osmolar leukolysis are achieved with a volume of 150 to 250 μl (Table 2). The volume of the incubation mixture in measuring cuvettes (2.25 ml) of a conductometric installation, for example, FermeNt-1, is determined by the capacity of its cuvette (2.5 ml). JJ inhibitory proteolysis in the control cuvette (kontikal or trazilol). Used in a concentration of 1000 bOOO Units in a volume of 0.05-0.15 ml. An example of determining the osmotic stability of leukocytes with the boundary values of the parameters is given in the table. 2. The level of electrical conductivity in zma-. depends on the temperature at which the reaction under investigation proceeds. Therefore, all conductive and tomometric measurements are carried out with the obligatory and strict observance of the constant temperature values in the measuring cuvettes. The proposed method is largely automated, requires 4 times less time, compared with the known quality method j has a higher accuracy (the error of the conductometric method does not exceed 4%, whereas the method error in the calculation of leukocytes in the chamber is 7%). Table

Продолжение табл. 1Continued table. one

Продолжение . 1Continued. one

Claims

Claim 1. Method for determining the osmotic resistance of leukocytes | On-D5 of plates; the intent of the total electrical resistance of leukocyte Bsaedn in an incubation medium, with the fact that