SU894496A1

SU894496A1 - Тушитель белковой флуоресценции

Info

Publication number: SU894496A1
Application number: SU802923582A
Authority: SU
Inventors: Эмиль Еремович Мхеян; Асмик Хачиковна Машинян; Сергей Эдуардович Акопов
Original assignee: Ереванский государственный медицинский институт
Priority date: 1980-05-05
Filing date: 1980-05-05
Publication date: 1981-12-30

Description

Изобретение относится к биофизике, а именно к методам изучения белковой флуоресценции, и может быть применено для избирательного тушения флуоресценции ионами.

Известны следующие тушители белко- ⁵вой флуоресценции: Cs⁺, N0* J,Cu^T4Fe¹*, Р0/и др.ЕТ].

Однако некоторые из них обладают способностью коагулировать белки (Си⁴⁺), другие (Fe²·*, N0j ) -- высокой ¹⁰оптической плотностью в зонах возбуждения белковых хромофоров. 3 спосо-^_ бен вступать в реакцию с белками, PQ* обладает малой эффективностью тушения. Все это может привести к искажению результатов исследования и требует внесения поправочных коэффициентов.

Цель изобретения - получение неискаженных характеристик белковой флуо- . ресценции.

Указанная цель достигается тем, что в качестве тушителя белковой флуоресценции применяют молибдат натрия.

В настоящее время молибдат натрия применяют в производстве лаков и красок, а также в химии для определения в кислой среде анионов PQj., AsO^~, S1O3 в виде гетерополисоединений.

Новое назначение вещества основано на его способности тушить флуоресценцию белковых хромофоров.

П р и м е р. Все растворы готовят на 10 мМ трис-НСI буфере (pH-6,8). Раствор молибдата натрия (1 мл в концентрации 1,5 мМ) непосредственно перед_измерением смешивают с 3 мл раствора САЧ (сывороточный альбумин человека в концентрации 100 мкг/мл) или раствором триптофана (20 мкг/мл). Полученной смесью заполняют измерительную кювету с рабочей гранью в 1 см, которую помещают в рабочий отсек спектрофлуориметра. Монохроматор длины волны возбуждения устанавливают на величину 280 нм (в случае САЧ и триптофана) или на 296 нм (гдепоглощает только триптофан). Регистрацию флуо ресценции проводят в интервале длин волн от 300 до 350 нм, максимум флуоресценции приходился на 332 и 344 нм при регистрации спектров флуоресценции САМ и триптофана. При анализе экспери- $ ментальных данных эффект внутреннего фильтра рассчитывается в тех случаях, когда оптическая плотность превышает 0,15 ед. Оптическая плотность определяется на спектрофотометре VSU-2P. Ни-to рке приведены параметры тушения флуоресценции САЧ и триптофана молибдатом и другими тушителями ( нитрат натрия и йодид калия) в равных концентрациях (1 ,5 мМ). И

Данные о концентрационной зависимости тушения флуоресценции триптофана в растворе ионами Μ_ο0^ представлены на фиг. 1 в Штерн-Фольмеровских

Jo 20 координатах: --1с- концентрация тушителя ()_о- интенсивность флуоресценции без тушителя3 - интенсивность флуоресценции с тушителем). Как следует из фиг. 1, тушение флуорес- 2S ценции триптофана полностью соответствует закону Штерна-Фольмера во всем использованном интервале концентраций (от 0,5 мМ до 1/5 мМ) ‘ Полученные величины констант тушения (К) показыва- so ют,что молибдат обладает более высокой· эффективностью тушения флуоресценции триптофана по сравнению с йодидом (для йодида к = 6,25 И'*, для молибдата К= =11,2 Н~7. Это наглядно видно на фиг. 2, на которой представлены кривые тушения флуоресценции триптофана молибдатом и йодидом (1-спектр флуоресценции триптофана без тушителя, 2 - спектр тушения йодидом, 3 - спектр тушения молибдатом).

На фиг. 3 представлен спектр флуоресценции САЧ в отсутствии (4) и в присутствии 1,5 мМ молибдата натрия (5).

Молибдат в отличие от йодида не способен вступать в реакцию с белками. Об этом свидетельствует тот факт, что молибдат не приводит к изменению формы спектров флуоресценции триптофана и САЧ и к смещению их максимумов. Молибдат в зонах возбуждения флуоресценции белковых хромофоров не обладает такой высокой оптической плотностью, как нитрат и Ее .

Так, если поглощение NOj при длине волны 296 нм условно принять за 100%, то оптическая плотность МоО,^ составляет 39%. Это позволяет й случае применения молибдата не рассчитывать поправку на эффект внутреннего фильтра, так как оптическая плотность растворов триптофана и белка не превышает 0,15 ед· При добавлении NOj”требуется внесение поправки на эффект внутреннего фильтра.

Преимущество предлагаемого тушителя заключается в том, что он обладает высокой эффективностью, не вступает в реакцию с белками, не требует внесения поправочных коэффициентов при длине (золны 296 нм.

Claims

Изобретение относитс к биофизике, а именно к методам изучени белковой флуоресценции, и может быть применено дл избирательного тушени флуоресцен ции ионами. Известны следующие тушители белковой флуоресценции: Cs, NOC J cV f , ДР.. Однако некоторые из них обладают способностью коагулировать белки (Си), другие (Fe N0 ) - высокой оптической плотностью в зонах возбуждени белковых хромофоров. З способен вступать в реакцию с белками, РО обладает малой эффективностью тушени Все это может привести к искажению ре зультатов исследовани и требует внесени поправочных коэффициентов. Цель изобретени - получение неис каженных характеристик белковой флуоресценции . Указанна цель достигаетс тем, что в качестве тушител белковой флуо есценции примен ют молибдат натри . В насто щее врем молибдат натри примен ют в производстве лаков и красок , а также в химии дл определени в кислой среде анионов . , AsO SiOj в виде гетерополисоединений. Новое назначение вещества основано на его способности тушить флуоресценцию белковых хромофоров. П р и ме р. Все растворы готов т на 10 мМ трис-HCl буфере (рН-6,8). Раствор молибдата натри (1 мл в концентрации 1,5 мМ) непосредственно перед измерением смешивают с 3 мл раствора САЧ (сывороточный альбумин человека в концентрации 100 мкг/мл) или раствором триптофана (20 мкг/мл). Полученной смесью заполн ют измерительную кювету с рабочей гранью в 1 см, которую помещают в рабочий отсек спектрофлуориметра . Монохроматор длины волны возбуждени устанавливают на величину 280 нм (в случае САЧ и триптофана ) или на 296 нм (где;поглощает только триптофан). Регистрацию флуоресценции провод т в интервале длин волн от 300 до 350 нм, максимум флуоресценции приходилс на 332 и 3+ нм при регистрации спектров флуоресценци САМ и триптофана. При анализе экспери ментальных данных эффект внутреннего фильтра рассчитываетс в тех случа х, когда оптическа плотность превышает 0,15 ед. Оптическа плотность определ етс на спектрофотометре VSU-2P. Ни е J pивeдeны параметры тушени флуоресценции САЧ и триптофана молибдатом и другими тушител ми { нитрат натри и йодид кали ) в равных концентраци х (1,5 мМ). Данные о концентрационной зависимости тушени флуоресценции триптофана 8 растворе ионами представле ны на фиг. 1 в Штерн-Фольмеровских координатах: концентраци тушител ((,- интенсивность флуоресценции без тушител J - интенсивность флуоресценции с тушителем), Как следует из фиг. t, тушение флуоресценции триптофана полностью соответствует закону Штерна-Фольмера во всем использованном интервале концентраций (от 0,5 мМ до 5 мМ) Полученные величины констант -тушени (К) показывают ,что молибдат обладает более высокой эффективностью тушени флуоресценции триптофана по сравнению с йодидом (дл йодида к 6,25 М , дл молибдата К 11,2 М. Это нагл дно видно на фиг. 2, на которой представлены кривые тушени флуоресценции триптофана молибдатом .и йодидом (1-спектр флуоресценции триптофана без тушител , 2 - спектр тушени йодидом, 3 - спектр тушени молибдатом). б б4 На фиг. 3 представлен спектр флуоресценции САЧ в отсутствии (А) и в присутствии 1,5 мМ молибдата натри Молибдат в отличие от йодида не способен вступать в реакцию с белками. Об этом свидетельствует тот факт, что молибдат не приводит к изменению форь44 спектров флуоресценции триптофана и САЧ и к смещению их максимумов. Молибдат в зонах возбуждени флуоресценции белковых хромофоров не обладает такой высокой оптической плотностью, как нитрат и Fe . Так, если поглощение NOj при длине волны 296 нм условно прин ть за 100, то оптическа плотность составл ет 39%. Это позвол ет б случае применени молибдата не рассчитывать поправку не эффект внутреннего фильтра, так как оптическа плотность растворов триптофана и белка не превышает 0,15 ед. При добавлении MOj требуетс внесение поправки на эффект внутреннего фильтра. Преимущество предлагаемого тушител заключаетс в том, что он обладает высокой эффективностью, не вступает в реакцию с белками, не требует внесени поправочных коэффициентов при длине |золны 29б нм. Формула изобретени Применение молибдата натри в качестве тушител белковой флуоресценции . Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1. Бурштейн Э.А. Биофизика, 1968, 13, 3, i«33.

f12 ,5Ю ,015

5,0

г,5

с

79

10

J amtfd

n

12

Iff

8

300 3iff 340 т 3SO ю0 y/-w

риг.1

втн fi. 16

fit 12 IB

IfffM

3W Ш 60

/f фиг.З