(54) ШТАММ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS 17 - ПРОДУЦЕНТ БАКТЕРИОЦИНА А 17 Изобретение относитс к микробиологии и касаетс получени нового штамма - продуцента антибиотика бактериоцина, который может быть использован дл бактериоцинотипировани и бактериоциногенотипировани лактобацилл, а также в ис , следовани х дл излучени генетических элементов, детерминирующих синтез бактериоцина , их функциональных особенностей, химического состава, ,механизма действи . Известен штамм L. piaretarum 109-продуцент бактериоцина 1. Однако спектр действи этих бактериоцинов ограничиваетс подавлением роста р да культур L. acidophilus, L. salivarins, L. jugurti, L helveticus, Llactis, L.delerueckii , L.fermenti и L.Buchneri. Целью изобретени вл етс новый штамм LactoBacillus acidophilus 17, продуцирующий бактериоцин активный и против других видов лактобацилл. Предложенный штамм выделен из слюны человека. Штамп LactoBacillus acidophilus 17-продуцент бактериоцина А 17 депонирован в Музее культур промышленных микроорганизмов института «ВНИИ генетика под номером ЦМПМ В-1826. Морфологические признаки. На среде МРС-1 (48-часова культура): умеренно полиморфные палочки 3-5 X 0,6-0,8 мкм, располагающиес поодиночке, с закругленными концами. Волютиновых зерен не образуют , грамположительны. Спор и капсул не имеют. Неподвижны. Культуральиые признаки. Ацетатный агар. Через 72 ч роста при 37° в атмосфере углекислого газа образует до 2 мм в диаметре круглые, серовато-беловатого цвета колонии с выпуклой, гладкой, блест щей поверхностью, полупрозрачные, с волнистым краем, зернистой структурой, м гкой консистенции. Среда МРС-1. Через 24 ч при 37 равномерное помутнение и небольшой аморфный осадок. Состав среды МРС-. 1. Дистиллированна вода 200 мл, MnSOi,-4HiO 50 мг, цистеин 200 мг, Мд SOi,- 7Н,О 200 мг, KHiPO, 2 г, цитрат аммони 2 г, ацетат иатри 5 г, глюкоза 20 г. 2. Дистиллированна вода 100 мл, пептон 10 г, твин 80 1 мл, дрожженой автолизат 50 мл, печеночный экстракт 100 мл. 3. Гидролизованиое молоко до I л; рН 6,2-6.6 1,5% агарова скошенна среда МРС-1. Через 48 ч роста при 37° налет сероватобеловатого цвета с гладкой блест щей поверхностью , г(олупрозрачный, м гкой консистенции , располагающийс на поверхности среды. Среда МРС-5 (среда МРС-1 без цитрата аммони и ацетата натри ). Через 24 ч при 37° равномерное помутнение и небольшой аморфный осадок. Среда МРС-2 (среда МРС-1 с 0,150/0 агара). Не растет при 50 и 15°. Среда МРС-2 с 0,4% типол . Рост отсутствует . Обезжире И)ое молоко с 5% дрожжевого автолизата и 1% глюкозы. Створаживание на 2 ; сутки. Среда Дейвиса (глюкоза 10 г, дрожжевой автолизат 50 мл, мел 100 г, хлорфениловый красный 40 мг, обезжиренное молоко до 1 л). Створаживание и пожелтение среды на 2 3 сутки. Молоко. Створаживание на 3 сутки. Физиологические и биохимические признаки . Факультативный анаэроб. Оптимальный РОСТ при 32-37°. Желатину не разжижает . Нитраты в нитриты не восстанавливает . Каталазу не образует. Среда Гибсона и Абд-эль-Малека. Ферментирует глюкозу без образовани газа. Ферментирует целлобиозу, галактозу, мальтозу, сахарозу, маинозу, лактозу и салицин с образованием кислоты. Не рас (цепл ет рамнозу, крахмал, сорбит и маннит. Молоко. Через 14 сут. содержание кислот достигает 0,65%. Антагонистические свойства. Образует бактериоцин А 17 на 1,5% агаровой среде МРС-1 и жидкой среде МРС-1. Получение бактериоцина на 1,5% агаровой среде МРС-1. Суточную культуру L.acidophilus 17 засевают уколом на чашку с 1,5% агаровой средой МРС-1 и выращивают 3 сут при 37° в вакуум-эксикаторах, в которых воздух заменен углекислым газом . Выращенную макроколонию стерилизуют парами хлороформа, после чего поверхность среды заливают вторым слоем (4 мл) 0,8% агаровой среды МРС-1, расплавленной и охлажденной до 46, смешанной с 0,5 мл 4 часовой индикаторной культуры Ljugurti NC3B 2889. После застывани среды посевы выращивают при 37° в течение 2 сут. Вокруг макроколонии L.acidophilus 17 наблюдаетс прозрачна с нечетк .м краем зона подавлени роста индикаторного штамма (18 мм в диаметре). Получение бактериоцина А 17 на жидкой среде МРС-1. Культуру L.acidophilus 17 засевают на жидкую среду МРС-1 и выращивают при 37° за 4 сут. Дл стерилизации к культуре добавл ют 10% хлороформа , перемешивают и выдерживают при 37° в течение 30 мин, после чего жидкость отдел ют от хлороформа и центрифигуруют . Из насадочной жидкости готов т двукратные серийные разведени . По одной петле каждого разведени нанос т на поверхность чашки с 1,5% агаровой средой МРС-1, засе нной 4-часовой индикаторной культурой L.jugurti NC3B 2889. После выращивани при 37° в течение 2 сут производ т учет. Титр бактериоцина А 17 на жидкой среде МРС-1 1:16. Спектр действи бактериоцина А 17. Подавл ет рост р да культур L.acidophilus, L.saiivarius, L.helveticul L.jugurti, L.lactis, L.deleruecKii, L.fermenti. L.BUchneri, L.leichmannii и L.celloBiosus. He ингибируют рост культур L.casei, L.plantarum, L.Brevis и L.Viridescens. Бактериоцин A 17 инактивируетс трипсином и химатрипсином, но резистентен к действию папанна, ДНК-азы, РНК-азы, и лизоцима. При 60° разрушаетс в течение 30 мни. Бактериоцин А 17 не реплицируетс на индикаторном, штамме L.jugurti NC3B 2889 и хорошо диффундирует в агар. Не диффундирует через целлофан. Предлагаемый штамм L.acidophilus 17 по сравнению с известными продуцирует бактериоцин , который активен против р да других видов лактобацилл, что может быть использовано дл бактериоцинотипировани не только культур L.acidophilus, L.salivarins, L.helveticus , L.jugurti, L.lactis, L.delBruecKii, L.fermenti и L.BUchneri, но и культур L.leichmannii и L.celloeiosus. По чувствительности к бактериоцину AI7 (бактериоцинотипирование) культуры Lacidophitus, L.saiivarius, L.helveticus, L.jugurti, L.lactis, L.deiBruecKii, L.fermenti и L.BUchneri, a также L.leichmannii и L,celloBiosus подраздел ютс на два бактериоцинотипа: чувствительный к бактериоцину А17 (1) и устойчивый к бактериоцину А17 (2). При бактериоцинотипировании 588 культур лактобацилл разньГх видов получены следующие данные: из 187 культур L.acidophilus 9 культур относились к (I) и 178 - к (2); из 65 кyльтyp°L.salivaгins 4 относились к (1) и 61 --ко (2); из 16 культур L.jugurti 6 относились к (I) и 10 - ко (2); из 4 культур L.helveticus 3 относились к (1) и I - к (2); из 84 культур L.fermenti 1 относилась к (I) и 83 - к (2); из 13 культур L.BUchneri 2 относились к (1) и 11 - к (2); из 2 культур L.leichmannii 1 относилась к (1) и 1 - ко (2); из 3 культур L.celloBiosus 2 относились к (1)(54) LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS 17 - PRODUCT BACTERIOCIN A 17 bacteriocin, their functional characteristics, chemical composition, mechanism of action. A known strain of L. piaretarum 109 is a producer of bacteriocin 1. However, the spectrum of action of these bacteriocins is limited to suppressing the growth of a number of cultures of L. acidophilus, L. salivarins, L. jugurti, L helveticus, Llactis, L.delerueckii, L.fermenti and L.Buchneri . The aim of the invention is a new strain of LactoBacillus acidophilus 17, producing a bacteriocin active against other types of lactobacilli. The proposed strain isolated from human saliva. The stamp of LactoBacillus acidophilus 17, a producer of bacteriocin A 17, was deposited at the Museum of Cultures of Industrial Microorganisms of the Institute “VNII Genetics under the number of CMPM B-1826. Morphological signs. On medium MPC-1 (48-hour culture): moderately polymorphic sticks 3-5 X 0.6-0.8 µm, located one by one, with rounded ends. Volyutin grains do not form, gram-positive. Dispute and capsules do not have. Motionless. Cultural signs. Acetate Agar. After 72 hours of growth at 37 ° in an atmosphere, carbon dioxide forms up to 2 mm in diameter round, grayish-white colony with a convex, smooth, shiny surface, translucent, with a wavy edge, granular structure, soft consistency. Medium MPC-1. After 24 h at 37, a uniform turbidity and a small amorphous precipitate. The composition of the medium MPC-. 1. Distilled water 200 ml, MnSOi, -4HiO 50 mg, cysteine 200 mg, MD SOi, - 7H, O 200 mg, KHiPO, 2 g, ammonium citrate 2 g, and acetate of sodium 5 g, glucose 20 g. 2. Distilled water 100 ml, peptone 10 g, tween 80 1 ml, yeast autolysate 50 ml, liver extract 100 ml. 3. Hydrolyzed milk up to I l; pH 6.2-6.6 1.5% mrs-1 agar skewed medium. After 48 h of growth at 37 °, a greyish-white-colored plaque with a smooth shiny surface, g (translucent, soft consistency, located on the surface of the medium. MPC-5 medium (MPC-1 medium without ammonium citrate and sodium acetate). After 24 h at 37 ° uniform turbidity and a small amorphous precipitate. MPC-2 medium (MPC-1 medium with 0.150 / 0 agar). Does not grow at 50 and 15 °. MPC-2 medium with 0.4% tipol. No growth. Degrease I) Boiled milk with 5% yeast autolysate and 1% glucose. Stabilization by 2; day. Davis medium (glucose 10 g, yeast autolysate 50 ml, chalk 100 g, chlorophenyl red 40 mg, skimmed milk up to 1 l). Fermentation and yellowing of the environment for 2 3 days. Milk. Stabilization for 3 days. Physiological and biochemical signs. Optional anaerobic. Optimum GROWTH at 32-37 °. Gelatin does not dilute. Nitrates in nitrites do not restore. Catalase does not form. Wednesday Gibson and Abd-el-Malek. Ferments glucose without gas formation. Ferments cellobiose, galactose, maltose, sucrose, mainozu, lactose and salicin to form acid. Not races (clings rhamnose, starch, sorbitol and mannitol. Milk. After 14 days. Acid content reaches 0.65%. Antagonistic properties. Forms bacteriocin A 17 on 1.5% MPC-1 agar medium and MPC-1 liquid medium Production of bacteriocin on 1.5% MPC-1 agar medium. The daily culture of L.acidophilus 17 is inoculated onto a plate with 1.5% MPC-1 agar medium and grown for 3 days at 37 ° in a vacuum desiccator in which air is replaced. Carbon dioxide. The grown macrocolony is sterilized with chloroform vapor, after which the surface of the medium is poured with a second layer (4 ml) of 0.8% agar Medium MPC-1, melted and cooled to 46, mixed with 0.5 ml of 4 hour indicator culture Ljugurti NC3B 2889. After solidification of the medium, the crops are grown at 37 ° for 2 days. Around the macrocolony L.acidophilus 17 it is observed transparent with fuzzy. At the edge of the growth zone of the indicator strain (18 mm in diameter). Preparation of bacteriocin A 17 in MPC-1 liquid medium. L.acidophilus 17 culture is seeded on MPC-1 liquid medium and grown at 37 ° for 4 days. For sterilization, 10% chloroform is added to the culture, stirred and maintained at 37 ° for 30 minutes, after which the liquid is separated from chloroform and centrified. Twice serial dilutions were prepared from the nozzle. One loop of each dilution was applied to the surface of a plate with 1.5% MPC-1 agar medium, seeded with a 4-hour L.jugurti NC3B 2889 indicator culture. After growing at 37 ° for 2 days, a record was taken. Bacteriocin A 17 titer in MPC-1 liquid medium 1:16. Spectrum of bacteriocin A 17. Suppresses the growth of a number of cultures of L. acidophilus, L..saiivarius, L.helveticul L.jugurti, L.lactis, L.deleruecKii, L.fermenti. L.BUchneri, L.leichmannii and L.celloBiosus. He does not inhibit the growth of cultures L.casei, L.plantarum, L..Brevis and L.Viridescens. Bacteriocin A 17 is inactivated by trypsin and chymatrypsin, but is resistant to papanna, DNase, RNAase, and lysozyme. At 60 °, it is destroyed within 30 minutes. Bacteriocin A 17 does not replicate on the indicator strain L.jugurti NC3B 2889 and diffuses well into the agar. Does not diffuse through cellophane. The proposed L.acidophilus 17 strain produces bacteriocins, which are active against a number of other types of lactobacilli, as compared to the known ones, which can be used for bacteriocinotyping not only cultures of L.acidophilus, L..salivarins, L.helveticus, L.jugurti, L.lactis , L.delBruecKii, L.fermenti and L.BUchneri, but also cultures of L.leichmannii and L.celloeiosus. According to sensitivity to the bacteriocin AI7 (bacteriocinotyping), cultures of Lacidophitus, L..saiivarius, L.helveticus, L.jugurti, L.lactis, L.deiBruecKii, L.fermenti and L..BUchneri, as well as L.leichmannii and L, celloBiosus are subdivided two bacteriocotypes: sensitive to bacteriocin A17 (1) and resistant to bacteriocin A17 (2). When bacteriocinotyping 588 cultures of lactobacilli of various species, the following data were obtained: from 187 cultures of L.acidophilus, 9 cultures belonged to (I) and 178 - to (2); out of 65 kilyp ° L.salivaгins 4 belonged to (1) and 61 - to (2); of the 16 L.jugurti cultures, 6 were related to (I) and 10 to ko (2); from 4 cultures of L.helveticus 3 were related to (1) and I - to (2); out of 84 cultures L.fermenti 1 belonged to (I) and 83 - to (2); of the 13 cultures of L.BUchneri, 2 belonged to (1) and 11 to (2); from 2 cultures L.leichmannii 1 belonged to (1) and 1 - ko (2); from 3 cultures L.celloBiosus 2 were related to (1)
и I ко (2); 2 культуры L.lactis и I культура LdelemecKii относились к (I). 211 культур Lcasei, L.plantarum, L.Brevis и L.Videsceus были устойчивыми и к бактериоцину А17.and I co (2); 2 cultures of L. lactis and I cultures of LdelemecKii were related to (I). 211 cultures of Lcasei, L.plantarum, L..Brevis, and L.Videsceus were also resistant to bacteriocin A17.
По способности продуцировать бактериоцин AI7 (бактериоциногенотипирование) культуры лактобацилл указанных выше видов подраздел ютс на два бактериоциногенотипа: продуцирующий бактериоцин AI7 и не продуцирующий бактериоцин А17.According to their ability to produce bacteriocin AI7 (bacteriocinogenotyping), the lactobacillus cultures of the above species are divided into two bacteriocinogenotypes: bacteriocin-producing AI7 and non-bacteriocin-producing A17.
Штамм L.acidophilus 17 может использоватьс в исследовани х по генетике и физиологии бактериоциногении лактобацилл при изучении химического состава бактериоцина AI7, механизма действи на чувствительные бактерии.The L.acidophilus 17 strain can be used in studies on the genetics and physiology of the bacteriocinogeny of lactobacilli in studying the chemical composition of the bacteriocin AI7, the mechanism of action on sensitive bacteria.
Применение предлагаемого штамма дает возможность по генетическим меткам (чувствительность или устойчивость к бактериоцину А17, наличие или отсутствие способности продуцировать бактериоцин А17) проводить дальнейшее, более глубокое и детальное внутривидовое подразделение неThe use of the proposed strain allows for genetic labels (sensitivity or resistance to bacteriocin A17, the presence or absence of the ability to produce bacteriocin A17) to carry out further, deeper and more detailed intraspecific subdivision not
только культур L.acidophilus, Lsalivarius, L.helveticus , L.jugurti, L.lactis, L.deleweckii ,L.fermenti и L.eachneri, но н культур L.leichmannli и L.cellobiosus, обладающих одинаковыми биохимическими и физиологическими свойствами, на бактериоцинотипы и бактериоциногенотипы (бактериоцинотипирование и бактерноцнногенотипирование ).only L.acidophilus, Lsalivarius, L.helveticus, L.jugurti, L.lactis, L.deleweckii, L.fermenti and L.eachneri cultures, but L.leichmannli and L.cellobiosus cultures with the same biochemical and physiological properties, on bacteriocinotypes and bacteriocinogenotypes (bacteriocinotyping and bacterocin genotyping).