SU810815A1 - Способ иммобилизации транскортина - Google Patents

Description

стероид, агарозу и транскортин берут в соотношении 1:0,002-1:0,03, инкубируют смесь в течение 3-24 ч при 4-23°С, а иммобилизированный транскортин промывают фосфатным буфером при рН 6-8, содержаш .им стероид в концентрации, равной его содержанию при иммобилизации транскортина.

В качестве стероида используют кортизол в мольном соотношении с траискортином 1:0,5-1:3 или кортиокостерон в мольном соотношении с транскортином 1:0,5- 1:2, или прогестерон в мольном соотношении с транскортином 1:0,5-1:1.

Способ заключаетс  в следующем.

Гомогенный транскортин, выделенный из плазмы ретроплацентарной крови человека аффинной хромотографией, раствор ют в фосфатном буфере рН 8,0. Дл  предотвращени  инактивации транскортииа в процессе иммобилизации его св зывают со стероидом, имеюшим высокое сродство к этому белку. Полученный комплекс смешивают с активированной бромцианом агарозой . Процесс иммобилизации провод т нри непрерывном перемешивании в течение 3-24 ч при 4-23°С. Нековалеитно св занный с агарозой траискортин удал ют путем последовательных про.мывок транскортин-агарозы фосфатным буфером, содержашим 0,5 М NaCI, трис-ПС1 буфером рН 8,0 (дл  блокировани  остаточных активных групп агарозы) и фосфатным буфером рН 8,0. Все промывающие буферы содержат растворенный стероид дл  предотвраш.ени  диссоциации обратимого комплекса транскортин - стероид, им .юбилизованного на агарозе. В результате получают стабильную трехкомпонентную систему агароза-транскортин-стероид. Ковалентна  св зь .между первыми двум  компонентами устойчива к физическим воз действи м, а стероид легко переходит в раствор при повышении температуры до 35-40С. При необходимости удал ют определенную часть стероида, варьиру  тем самым в широких пределах (от 10 до 90%) стерондосв зывающую емкость иммобилизованного транскортина.

Пример 1. Иммобилизаци  транскортина нри о.хлаждении.

10 мг (2, моль) транскортииа раствор ют в 5 .мл 0,1 М натрийфосфатного буфера рН 8,0, содержащего 0,5 М NaCI и охлажденного до 4-6°С. В полученный раствор добавл ют 144 мкг (4- 10 моль) кортизола в 0,2 мл абсолютного этанола. 1 г агарозы, активированной бромцианом, промывают на пористом стекл нном фильтре последовательно 200 мл 0,001 М HCI. 50 мл воды, 10 .мл ОЛ М натрийфосфатного буфера рН 8,0, содержащего 0,5 М NaCI. Все растворы имеют температуру 4-6°С. К гелю промытой активированной агарозы приливают полученный, как описано выше, раствор комплекса транскортии-стероид . Суспензию перемешивают на магнитной мешалке нри 4-6°С в течение 24 ч. Гель перенос т в стекл нную колонку , снабженную пористым стекл нным фильтром, и нро.мывают последовательно 40 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера, содержащего 0,5 М NaCI, 40 мл 0,01 М трисHCI буфера рН 8,0 и 20 мл 0,1 М иатрийфосфатного буфера рН 8,0. Все промывающие буферы имеют температуру 4-6°С и содержат кортизол в концентрации 29 мкг/мл. Химический анализ и определение стероидсв зывающей способности (см.

пример 6) показывают, что Б препарате иммобилизованного трапскортина 1 г агарозы ковалеитно св зан с 9,2 мг белка и стероидсв зываюша  способность составл ет 85% от стероидсв зывающей способцости того же количества нативного (неиммобилизованного ) транскортина.

Пример 2. Иммобилизаци  транскортииа при комнатной температуре.

Используют все те реагенты и реактивы , что и в примере 1, в тех же количествах . Проделывают все те операции, что и в примере 1, в той /ке последовательности, но при температуре 20-23°С. Врем  пе| )емешиваци  суспензии 3 ч. Проведенный

анализ показывает, что 1 г агарозы ковалентно св зан с 9,0 мг траискортина, а стероидсв зывающа  способность сохран етс  на 81%.

Пример 3. Вли ние исходного соотношени  транскортина и агарозы на количество иммобилизованного белка и его стероидсв зывающую способность.

В цел х подбора оптимального соотношени  количеств белка и активированной

агарозы к шести пробам активированной агарозы (по 0,1 г) добавл ют различные количества транскортипа, растворенного в 0,5 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера, содержащего 0,5 М NaCI. Кал{да  проба раствора транскортииа, как и в примере 1, содержит двойное количество кортизола в мольно.м отношении к количеству белка. Процесс дл  пробы провод т, как описано в примере 1, но объемы промывающих буферов уменьшают в 10 раз. Результаты анализа полученных нрепаратов транскортин-агарозы представлены в табл. 1.

Как видно из данных табл. 1, наиболее

эффективно иммобилизаци  транскортина проходит при таком соотношении количеств активированной агарозы и белка, когда на 0,1 г матрицы вз то 1,0 мг транскортина . При указанном соотношении реагентов сохран етс  иммобилизованным транскортином высока  стероидсв зываюП1а  активность.

Пример 4. Стабилизирующее ьли ние различных количеств стероида на активность иммобилизованного транскортина.

Таблица 1

Стероидсв зьшающа  способность иммобилизованного транскортина приведена в процентах от св зыв.ающей способности нативного белка (то же в соответствующих графах табл. 2 н 3).

Дл  подбора оптимального мольного соотношени  транскортина н стабилизирующего стероида к п ти пробам по 1,0 мг белка, растворенного в 0,5 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера рН 8,0 и содержащего 0,5 М NaCI, добавл ют различные количества стероида. Процесс дл  каждой пробы провод т, как описано в примере 1, использу  0,1 г активированной агарозы и у.меньн1а  объемы промывающи.х буферов в 10 раз. Каждый промывающий буфер содерл ит стероид в той же концентрации, кака  была создана в данной нробе транскортина . Результаты анализа полученны.х препаратов транскортин-агарозы представлены в табл. 2.

Таблица 2

Стерондсв зывающа  способность, %

Из данных табл. 2 следует, что наибольшее стабилизирующее вли ние оказывает стероид Б мольном отношении к белку 2:1 ( 14,4 мкг кортизола на 1,0 мг транскортина). Другие стероиды, имеющие средство к транскортину одного пор дка с кортизолом - кортикостерон и прогестерон - также стабилизируют транскортин в процессе его иммобилизации. Используют мольные соотношени  кортикостерон:транскортин 2:1 и прогестерон:транскортин 1:1. Стабилизирующее вли ние обоих стероидов равно вли нию эквивалентного количества кортизола.

Пример 5. Вли ние рН промывающего буфера на стероидсв зывающую способность иммобилизованного транскортина м на количество белка, св занного активированной агарозой.

От значени  рН промывающего буфера завис т, во-первых, полное удаление нековалентно св занного с матрицей трапскортина и, во-вторых, сохранение при этом высокой стероидсв зывающей способности белка. С этой целью провод т иммобилпзацию п ти проб по 1 мг транскортина иа п ти пробах по 0,1 г активированной агарозы в соответствии с примером 1. По окончании реакции данную пробу промывают буфером с исследуемым значением

рН. Затем промывку ведут, как в примере 1, уменьща  объемы в 10 раз. Результаты анализа полученных препаратов транскортин-агарозы приведены в табл. 3.

Т а б л н ц ,ч о

Из данных табл. 3 видно, что промывка

транскортин-агарозы буферами с низким значением рН (4,0) существенно инактивирует белок. Химический анализ полученных препаратов показывает, что все пробы содержат одинаковое количество

белка (в пределах ошибки эксперимента). Следовательно, нет необходимости понижать рН дл  увеличени  десорбирующей силы промывающего буфера (как рекомендует унифицированна  методика иммобилицации белков).

При.мер 6. Химический анализ иммоби лизации белков).

Суспензию транскортин-агарозы в воде лиофильно высущивают и определ ют сухой вес црепарата. Пробу 0,02 г сухого препарата подвергают полному кислотному гидролизу в 6 н. НС1 при 110°С в течение 48 ч. В контрольном опыте 0,02 г неактивированной агарозы и известное количество транскортина гидролизуют в идентичных услови х. Состав гидролизата определ ют на аминокислотном анализаторе в стандартных услови х. Количество иммобилизованного транскортина определ ют

сопоставлением количеств глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, глицина и аланина, высвободившихс  при гидролизе в опытной и контрольной пробах.

Определение стероидсв зывающей сиособности иммобилизованного транскортина

провод т по предлагаемому способу. Стероидсв зывающую способность пативного трапскортпна измер ют по общеприн той методике с применепием твердофазной адсорбции дл  разделени  свободной п св занпой трапскортнном форм стероида.

Предлагаемый способ обеспечивает высокую эффективность {92--95%) иммобилизации транскортпна на нерастворимой матрице и позвол ет сохранить высокую стероидсв зывающую активность белка (81-85%). Такое сочетание названных параметров необычно даже дл  достаточно стабильных белков.

В получаемом по предлагаемому способу препарате иммобилизованного трапскортина отсутствуют примесные белки, конкурирующие с транскортином за стероид. Это обусловливает более высокое специфическое сродство транскортина к стероидам и большую удельную стероидсв зывающую способность по сравнению с целевым продуктом, полученным по известному способу. Иммобилизованный гомогенный транскортин может хранитьс  при 4-б°С по меньшей мере в течение 8 мес цев без изменени  стерондсв зывающей способности . При получении препарата провод т на всех стади х процесса иммобилизации операции по стабилизации белка.

Примепенпе в. предлагаемом способе фосфатного буфера с рН 6-8 дл  растворени  гомогенного транскортина, дл  промывки транскортин-агарозы и дл  последующего хранени  препарата основано, во-первых, на известном факте стабильности гомогенпого транскортина в этом буфере и, во-вторых, на том, что этот буфер используют при очистке транскортина до гомогенного состо ни . Св зывание со стероидом обеспечивает высокую стабильность белка в процессе иммобилизации, а диссоциаци  лиганда предотвращаетс  введением стероида в промывающие буферы.

Использование равных концентраций стероида в растворе транскортина и промывающих буферах обеспечивает ту же концентрацию (известную) стероида в полученном препарате. Это облегчает количественные расчеты при работе с иммобилизованным гомогенным транскортином.

Форм у л а и 3 о б |) е т с п и  

Claims (4)

1.Способ пммобплизапии транскортпна путем его растворени  с последующим добавлением в раствор активпровашюй нерастворимой агарозы, инкубацией полученной смеси и промывкой образовавшегос  иммобилизованного трапскортина, отличающийс  тем, что, с целью получени  стабильного гомогенпого препарата п повышени  его св зующей емкости, в раствор транскортина перео; добавлением aiapO3bi ввод т стероид, агарозу и транскортин берут в соотпошенпп 1:0,002-1:0,03, инкубацию смеси ведут в течение 3--24 ч прп 4-23°С, а нммобилизованный транскортин промывают фосфатным буфером при рН 6-8, содержащим стероид в копцентрапли, равной его содержанию прп иммобилизации транскортипа.

2.Способ по п. 1, от л п ч а Сущ и йс  тем, что в качестве стероида используют кортизол в мольном соотношении с транскортином 1:0,5-1:3.

3.Способ по п. 1, отличающийс  тем, что в качестве стероида используют кортикостерон в мольном соотношении с транскортином 1:0,5-1:2.

4.Способ по п. 1, отличающийс  тем, что в качестве стероида используют прогестерон в мольном соотношении с транскортином 1:0,5-1:1.

Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе

1. За вка Великобритании N° 1348935, кл. С 07 G 7/00, 1974.