SU794071A1 - Способ определени активностиНАдН- и НАдфН-гЕНЕРиРующиХ дЕгидРОгЕНАз - Google Patents

Description

Это позвол ет проводить спектрсфотометрический контроль дегидрог-еназнсй реакции на максимуме поглощени  х нона. Легко осуществим также пол рографический контроль скорости дегидрог&члзной реакции по поглощению кислорода, пошедшего на окисление аутоксидабельной дифенольной формы анилинолроиззодн -.1х, котора  возаикает в системе при налитг.и дегидрогеназиой активности.

В силу высокой активности анилИ1;оироИЗВОД .НЫХ о-бензохинона их приме}; ют в коПЦентрации в 10-100 раз ниже, чем л-бензохинон, что исключает побочные эффекты хипонов.

На фиг. I приведены кривые определени  активности алкогольдегидрогеназы (а), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (б) и  зо-ц.-тратдегидрогеназы (-в); па фиг. 2 - график зависимости скорости .потреблени  кислорода в среде от количества препарата изоцигратдегидрогеназы при измерении ее активности по предлагаемому способу.

Измерени  активности изоцитратдегидрогеназы экстракта печени крысы по предлагаемому способу ,в сравпении с другимл способами приведены в таблице.

Сущность изобретени  по сн етс  схемой;

(Дегидрогеназа)

Субстрат восстановленный +НАД(Ф) j;i +. Субстрат окисленный +НАД(Ф)Н + Н+ ( Менадионредуктаза)

НАД (Ф) Н + Н+о-хинон -5-НАД (Ф) +

Н-о-дифенол(2)

На приведенной схеме о-хинон представл ет одно из анилинопроизводных о-бензохинона, а о-дифенол - восстановленную форму этого хнно а. Реакци  (1) проводитс  в оптимальных услови х дл  изучаемой дегидрогеназы. Скорость этой реакции лимитирует скорость реакции (2). Как видно из схемы, реакци  (2) выступает как система, акцептирующа  водород, по вл ющийс  в основной дегидрогеназной реакции (1) ,в результате окислени  конкретного субстрата. Физико-химические свойства анилинопроизводных о-бензохинона позвол ют контролировать активность дегидрогеиазной реакции (1) по последовательной реакции (2), включающей а илинопроизводные о-бензохинола.

Способ определени  акти;знасти НАД (Ф) Н-генерирующих дегидрогеназ осуществл етс  следующим образом. Готов т среду, содержащую субстрат, НАД или НАДФ   другие компоненты, необходимые дл  про влени  активности конкрет.1ой дегидрогеназы , в которую добавл ют 4-анилино-5-метокси-1 ,2- бензохинон (АМОБХ) в количестве 1. мкмоль или какое-либо

другое анилинопроизводное о-бе.нзохино.на, а та|Кже препарат менадио.нредуктазы, вз той в относительном избытке с тем, чтобы ее активность не лимитировала а.кг.ивность изучаемой дегидрогеназы. Полную реакционную среду перенос т в закрытую кювету спектрофотометра, предназначемного дл  автоматической записи результатов из .мерений, или в пол рографическую  чейку.

В процессе измерений инкубадио.нную смесь принудительно перемешивают. В среду внос т исследуемый образец .и фиксируют кинетическую кривую активноеги дегидрогеназы (записывают изменение оптической ПЛОТНОСТИ на максимуме поглоще .ни  анилиноироизводного о-бензохинона, или регистрируют кинетическую кривую поглощени  кислорода в пол рографических опытах).

При измерени х по оптической плотности из среды удал ют кислород пропусканием азота или дожидаютс  естесгвенного истощени  кислорода в .кювете, что св зано с быстрым окислением дифенольной

формы производных.

Актив.ность дегидрогеназ выражают в общеприн тых единицах с учетом сгехиоМбтрии реакции.

Пример 1. Определение активности

алкогольдегидрогеназы (КФ 1.1.1.1.).

Готов т реакционную среду следующего состава: этанол 60 ммоль, НАД 350 у)«л:.иолб, АМОБХ 15 мкмоль, менадионредуктаза 0,5 мг, фосфатный буфер 0,08 М, рН 7,6.

(1)

Среду перенос т в пол рографическую  чейку и автоматически регистрируют К|Инетическую кривую поглощени  кислорода. Далее в пол рографическую  чейку нвод т 180 мкг очищенного препарата фермента,

продолжа  измерение скорости поглощени  кислорода (см. фиг. 1 а).

Пример 2. Определение активности глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (КФ 1.1.1.48).

В пол рографическую  чейку внос т среду следующего состава: глюкозо-6-фосфат 550 мкмоль, НАДФ 360 мкмоль, АМОБХ 150 мкмоль, ЭДТА 3,3 ммоль, менадионредуктаза 0,5 мг, триэтаноламиновый буфер 33 ммоль, рН 7,6 и регистрируют поглощение кислорода .после введен.и  25 мкг фермента (см. фиг. I б).

Пример 3. Определение активности изоцигратдигидрогепазы (КФ 1.1.1.27).

В пол рограф.ическую  чейку внос т реакционную среду следующего состава: ДЛизоцитрат 6 ммоль, АМОБХ 150 мкжлль, НАДФ 300 мкмоль, менадионредуктаза 0,6 мг, трис-НС1 буфер 0,08 М, рН 7,6, поглощение к-ислорода регистрируют после введени  320 мкг фермента и 1 ммоль MnSO (см. ф.иг. 1 IB).

Внесение дегидрогеназы в полную реакционную среду приводит к установлению

стацио.нарного режима в системе, при кото;ром скорость поглощени  кислорода посто нна и дегидрогеназна  актпив ость олисываетс  кинетической кривой нулевого пор дка . Цифры на линейных участках графиков соответствуют измеренным активност м дегидрогеназ.

Таблица Среднее ±S- Как видно из таблицы, определение активности изоцитратдегидрогеназы по нред .лагаемому способу в сравнении с другими независимыми способами дает оов падаю:щие результаты. На фиг. 2 приведен график, из которого следует, что при измерении активности дегидрогеназ (на примере изоцитратдегидрогеназы ) по предлагаемому способу наблюдаетс  линейна  зависимость между количеством фермента и скоростью изменени  окончательного параметра, которым в данном случае  вл етс  кислород.

Claims (2)

1. Таким образом, использование предлагаемого способа определени  активности НАДН- и НАДФН-генерирующих дегидрогеназ позвол ет в течение короткого периода времени получить точные данные об активности дегидрогеназ )В ходе самой реакции . Формула изобретени  Способ определени  активности НАДНи НАДФН-генерирующих дегидрогеназ, предусматривающий приготовление реакционной смеси, включающей хиноны в качестве акцептора водорода, инкубацию ее и определение остаточного количества акцептора , отличающийс  тем, что, с пелью расщирени  диапазона исследуемых объектов и осуществлени  непрерывного контрол  скорости дегиДрогеназной реакции , в реакционную смесь дополнительно ввод т менадионредуктазу, и в качестве акцептора водорода из р да хинонов используют анилинопроизводные о-бензохинона . Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе: 1.Franke W. Thunberg - Methodik und Verwandte Acceptor - Methoden. - Handbuch der Physiologich- und Pathologish - Chemischen Analyse, 2 Bd, 1955, 339-340, Springer - Verlag.
2. 2.Bertho A. and Grossman W. Laboratory Methods in Biochemistry. London, 1938, p. 166-169 (прототип).

   0,20,O.S

   . .()

   препарата u.,c -rгf amдcгu Уcгeftaз (г.2