SU649435A1

SU649435A1 - Method of preparing erythrocyte

Info

Publication number: SU649435A1
Application number: SU772500570A
Authority: SU
Inventors: Галина Николаевна Старухина
Original assignee: Уфимский Научно-Исследовательский Институт Вакции И Сывороток Им. И.И.Мечникова
Priority date: 1977-06-24
Filing date: 1977-06-24
Publication date: 1979-02-28

Description

1one

Изобретение относитс к области медицинской нромьпиленности, а именно к пронзводству вирусных препаратов.FIELD OF THE INVENTION The invention relates to the field of medical criminality, namely to the introduction of viral preparations.

Р1звестен способ приготовлени эритроцитов дл адсорбции вируса гриппа путем отмывани эритропитов кур физиологическим раствором с последующей формалинизацней , пов.орным отмыванием и приготовленнем сусиепзии эритроцитов .A method of preparing erythrocytes for the adsorption of the influenza virus by washing the chicken erythrophytes with physiological saline followed by formalization, routine laundering and prepared erythrocyte susiese is known.

Однако известный снособ не обеспечивает высокой адсорбционно-элюирующей снособностн эритроцитов.However, the known snozob does not provide a high adsorption-eluting erythrocyte capacity.

Целью изобретени вл етс новышение адсорбционно-элюирующей способности эритроцитов.The aim of the invention is to increase the adsorption-eluting ability of red blood cells.

Эта цель достигаетс тем, что формалипизированные эритроциты отмывают двукратно боратно-фосфатпым буферным раствором хлористого натри при рН 9,0-9,2 и однократно фосфатным буферным раствором хлористого натри при рН 5,5-5,7 и суспензию эритроцитов готов т в этом же растворе.This goal is achieved by the fact that formally erythrocytes are washed twice with a borate-phosphate buffer solution of sodium chloride at pH 9.0-9.2 and once with a phosphate buffer solution of sodium chloride at pH 5.5-5.7 and the suspension of erythrocytes is prepared in the same way. solution.

Способ осуп1ествл ют следующим образом .The method is described as follows.

Свежие отмытые эритроциты кур, разведенные 1:1 физиологическим раствором, выдерживают с 20% ио объему раствором формалина в течение 3 суток в обычном холодильнике. Затем приетупают к отмывке их па лабораториой рефрижераторной центрифуге ЦЛР- в стекл нных центрифужных стаканах емкостью 250 мл. Центрифугирование на всех этапах провод т соFresh washed chicken erythrocytes, diluted 1: 1 with saline, are incubated with a 20% volume of formalin solution for 3 days in a conventional refrigerator. Then they are applied to washing them in a laboratory using a CLR-refrigeration centrifuge in 250 ml glass centrifuge cups. Centrifugation at all stages is carried out with

скоростью 1000 об/мин не более 4-5 мин. Эти услови выбирают дл того, чтобы не дои}стить попадани в осадок формалинизированных эритроцитов разрушенных клеток и прочих примесей, оседающих ириspeed of 1000 rpm no more than 4-5 minutes. These conditions are chosen in order to prevent the formalinized erythrocytes from destroying cells and other impurities from falling into the sediment.

длительном и скоростном центрифугировании и способных загр знить вируссодержащий материал на этапе элюцнн.long and high-speed centrifugation and capable of contaminating vaccinated material at the stage of the eluted process.

Последовательность промывани формаЛ1 низированных эритроцитов следующа .The sequence of washing the forma l1 erythrocytes is as follows.

После удалени формалина эрптроциты дважды промывают физиологическим раствором рП 7,0. Затем дважды их центрифугируют в п;елочном боратно-фосфатномAfter removal of formalin, the erprocytes are washed twice with physiological saline pp 7.0. Then they are centrifuged twice in n; fir-tree borate-phosphate

растворе хлористого натри рН 9,0. При этом в промывной жидкости методом онределени белка по Лоури обнаруживаетс от 0,8 до 1,1 мкг его в 1 мл, тогда как после отмывки эритроцитов обычным физиологнческим раствором рН 7,0 примесей белка ие обиаружено.sodium chloride solution pH 9.0. In this case, in the washing liquid, the method of protein distribution according to Lowry reveals from 0.8 to 1.1 µg of it in 1 ml, whereas after washing the erythrocytes with a usual physiological solution of pH 7.0, protein impurities are not discharged.

Далее осадок формалинизированных эритроцитов промывают на центрифуге ЦЛР-1 однократно фосфатно-буферным растворомNext, the precipitate of formalinized erythrocytes is washed in a CLR-1 centrifuge once with phosphate buffer solution

хлористого натри рП 5,6 и ресуснендируют их в равтюм количестве того же раствора до по.р.чски 50% по объему взвеси. Дл получс1 и очищенного и концептрированного вируссодержащего материала на каждые 100 мл аллангоисной жидкости добавл ют 6 мл 507о-ной сзвееи эритровдтов и оставл ют дл адсорбции вируса в холодильнике ирн на ночь. На другой день осадок формалинизированных эритроцитов с нагруженным вирусом центрифугируют на ЦЛР-1 цри 1000 об/мин в течение 5 мин, затем однократно иромывают охлал денным до 4-6°С физиологическим раствором рН 7,0 и номещают на элюцню вируса в вод ную баню ири 38°С в физиологическом растворе, объем которого в 10 раз меньше объема исходной аллантоисной жидкости (дес тикратный элюат). Через 4 ч выдерживани в вод ной бане взвесь эритроцитов центрифугируют на ЦЛР-1 ири 2000 об/мин в течение 15-20 мин, надоеадочную жидкость (1 элюат) сливают и повтор ют цикл элюцпи в течение 3 ч в таком же объеме физиологического раствора . Степень элюции определ ют в реакции гемагглютинации (РГА) с 1%-иой взвесью свелснх эрнтроцитов кур на илекснглазовых дон1,ечках. Объем реакщи; в каждой лунке составл ет 1 мл. Дл сравнени ироцесе адсорбции н два цикла элюции того же вируса провод т с формалинизированными эритроцнтадШ, нриготовленнымн общеизвестным способом (без промывани их щелочным и кислым буферными растворами). Как показали результаты опытов, цри использовании очищенных формалинизированкых эрнтроцитов, приготовленных по нредлагаемому способу, процесс десорбции вируса нроисходнт быстрее. Так, уже через 2 ч выдерживани в вод ной бане вируса А (Виктори ) 75 элюировало в физиологический раствор от 76 до 81% по сравнению с гемагглютинируюихей активностью в аллантоиеной жидкости с учетом небольших потерь после адсорбции вируса ца эритроцитах . При использовании формалинизированных эритроцитов, ириготовленных общеизвестным способом, за этот период элюнровало от 22 до 30%. Через 4ч (1 цикл элюции) в нервом случае освобождалось от 83 до 85%, аво втором - от 40 до 43%. В конечном итоге за два цикла элюции (7 ч выдерживани в вод;1ной бане) очищенные формалиннзироваиные эритроциты освобо кдали о7-89% адсорб 1роваццого вируса , а эритроциты, приготовленные но общеизвестному способу, - 43-46% но сравнению е содержаиием гем:-1Г1Лютинииов аллагггоисиой жидкости, вычисленных на обн ,ий объем матер 1ала. Дл сн ти оставщегое вируса во втором случае нотребовалось нроведенне третьего н четвертого этанов элюировани вируса, т. е. дополнительное выдерживание в вод ной бане 6- 7 ч, что удлин ло нроцесс нриготовлени очищенного вируесодержащего материала, привод к потер м гемагглютинируюи1,ей активности на этапах. Использование предлагаемого способа обеспечивает зскорение. ироцееса приготовлени элюатов вируса гринна е высокой адсорбциоццо-элюирующей способностью, что очень важно дл сокращени технологического нроцесса изготовлени инактивированной грипиозиой вакцины, а также сниж .ение нотерь гемагглютинирующей активиости при очистке вируса методом адсорбции-элюции с эритроцитов кур, что имеет особое значение прп иснользованиц в про;:зводетве вакцины гитаммов с низкой репродуцирующей сиособиостью и низким выходом гемаг1 тют - нинов. Фор м у ,ч а изобретен и Способ приготовлени эритроцитов дл адсорбции вируса гриппа путем отмывани эритроцитов кур физиологическим раствором с последуЮЩей формалинизацией, повторным отмыванием и приготовлением суспензиц эритроцитов, о т л и чающийс тем, что, с целью иовыщени адсорбционно-элюирующей епособностн эритроцитов, формалииизирован)ые эритроциты отмывают двукратно боратно-фосфатным буферным раствором хлориетого натри при рН ,2 и однократно фосфатным буферным раствором хлористого натри при рН 5,5--5,7 и суспензию эритроцитов готов т 15 этом же растворе. Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1. Регламеит производства противогриппозной сыворотки с сульфаниламидами. ЛенНИИВС им. Мечникова, 1966.sodium chloride RP 5.6 and resuspendyd them in equal quantities of the same solution to p. 50 50% by volume of suspension. To obtain 1 and purified and conceptual vaccinated material, for every 100 ml of allangoic fluid, 6 ml of 507 ° C erythrovdts are added and left to adsorb the virus in the fridge for overnight. The next day, the precipitate of formalinized erythrocytes loaded with virus was centrifuged at CLR-1 at 1000 rpm for 5 minutes, then once and spayed with physiological solution pH 7.0 cooled to 4-6 ° C and put into a water bath for elute virus At 38 ° C in physiological solution, the volume of which is 10 times less than the volume of the initial allantoic fluid (tenfold eluate). After 4 hours, the suspension of erythrocytes in a water bath is centrifuged at CLR-1 or 2000 rpm for 15–20 minutes, the supernatant (1 eluate) is drained and the elution cycle is repeated for 3 hours in the same volume of saline. The degree of elution is determined by the haemagglutination reaction (DSA) with a 1% suspension of overweight chicken erntrocytes on the leech eye glands. The volume is reactive; each well is 1 ml. For comparison, the adsorption process and two elution cycles of the same virus are carried out with formalized erythrocytes prepared using a well-known method (without washing them with alkaline and acidic buffer solutions). As shown by the results of the experiments, when using purified formalin erntrocytes prepared according to the proposed method, the desorption process of the virus develops faster. So, already after 2 hours, virus A (Victory) 75 was eluted in a water bath 75 from 81% to 81% in physiological saline as compared with the hemagglutinating activity in the allantoic fluid, taking into account small losses after adsorption of the virus erythrocytes. When using formalized erythrocytes, irifted in a well-known way, eluted from 22 to 30% during this period. After 4 hours (1 elution cycle), in the nerve case, 83 to 85% were released, and the second, from 40 to 43%. In the end, in two elution cycles (7 hours of incubation in water; 1st bath), purified formalin-nizirovanny erythrocytes released about 7–89% of the adsorption of the Rivine virus, and erythrocytes prepared using the well-known method — 43-46% compared to the heme: - 1G1 luginii of alaggoisii liquid, calculated on the basis of the volume of the material, 1a. In order to remove the remaining virus in the second case, the third and fourth ethanol was required to elute the virus, i.e., additional curing in the water bath for 6-7 hours, which lengthened the process of preparation of the purified virus-containing material, leading to loss of hemagglutination and its activity on stages. Using the proposed method provides zkorenie. In order to reduce the technological process of manufacturing the inactivated flu vaccine, as well as reducing the hemagglutinating activity of the viral erythrocytes, as well as reducing the hemagglutinating activity during the purification of the virus by the method of adsorbing erythrocytes to the hemgglutinating activity of the virus in the eryos pro;: zvitetve vaccine gitammy with low reproduction capacity and low yield of hemaglutus - nins. The form for preparing the erythrocytes for the adsorption of the influenza virus by washing the erythrocytes of chickens with physiological saline followed by formalization, rewashing and preparing erythrocyte suspensions, is also invented by us, and it was created by using a cell that was used for the synthesis of the erythrocytes and for the purpose of gaining the use of erythrocytes. Formalized red blood cells are washed twice with sodium phosphate borate buffer solution at pH 2 and once with sodium chloride chloride phosphate buffer solution at pH 5.5-5.7 and erythro suspension Oocytes are prepared 15 of the same solution. Sources of information taken into account in the examination 1. Reglameit anti-influenza serum production with sulfonamides. LenNIIVS them. Mechnikov, 1966.