SU488827A1

SU488827A1 - Method for producing cytochrome c

Info

Publication number: SU488827A1
Application number: SU2052319A
Authority: SU
Inventors: Бидзина Исакович Чумбуридзе; Наили Захарьевна Шегелидзе
Original assignee: Тбилисский Государственный Медицинский Институт Грузинской Сср; Научно-Исследовательский Институт Акушерства И Гинекологии
Priority date: 1974-08-09
Filing date: 1974-08-09
Publication date: 1975-10-25

Description

1one

Изобретение относитс к медицине.This invention relates to medicine.

Известен способ получени цитохрома С, по которому дрожжевые клетки ДЕШЖДЬ} промывают и отдел ют центрифугированием . Затем их разрушают этилацетатом, после чего провод::т экстракцию водой в присутствии сульфата аммони (1О%-ного насыщени ) при рН раствора 7,0-7,5,:Уста .1{ввливаемом аммиаком.There is a known method for producing cytochrome C, in which yeast cells CHESCH} are washed and separated by centrifugation. They are then destroyed with ethyl acetate, after which the wire is: extracted with water in the presence of ammonium sulfate (1O% saturation) at a pH of 7.0-7.5,: Mouth .1 {introduced by ammonia.

После этого отдел ют взвешенные час ,тицы центрифугированием. Полученный гат диализуют, затем диализ пропускают через колонку ДЭАЭ- целлюлозы.Thereafter, the weighted particles are separated by centrifugation. The resulting gat is dialyzed, then dialysis is passed through a DEAE-cellulose column.

Полученную жидкость диализуют, под вергают повторной хроматографии на; колонкё КМ-целлюлозы, при этом цитохром С адсорбируетс в верхнюю часть колонки. Десорбцию цитохрома С и.з колонки КМ- целлюлозы осуществл ют аммиаком. диализуют и высхшивают при температуре -75 С, Выход сырого фермента цитохрома С при пересчете на высушенные дрожжи составл ет 0,03%.The resulting liquid is dialyzed, and subjected to rechromatography on; KM cellulose column, whereby cytochrome C is adsorbed to the top of the column. The desorption of cytochrome C and. From the KM cellulose column is carried out with ammonia. dialyzed and dried at -75 ° C. The yield of the crude cytochrome C enzyme when converted to dried yeast is 0.03%.

Цель изобретени - сокращение процесса и увеличение выхода продукта.The purpose of the invention is to reduce the process and increase the yield of the product.

Дл этого экстракцию цитохрома С после разрушени дрожжевых клеток ocy-i ществл ют раствором сахарозы, а очнсрку продукта провод т последовательной iсорбцией его в статических услови х на , КМ-целлюлозе и пропусканием элюата ; через колонку ДЭАЗ- целлюлозы и КМ1 целлюлозы.For this, extraction of cytochrome C after the destruction of yeast cells with ocy-i is carried out with a sucrose solution, and the product is processed by successively adsorbing it under static conditions on KM-cellulose and passing the eluate; through a DEAZ cellulose column and KM1 cellulose.

Пре алагаемый способ заключаетс в следующем.The proposed method is as follows.

Клетки дрожжей разрушают этилацетатом и центрифугируют при 5ООО об/мин в течение 10 мин. Разрушенные клетки промывают дистиллирован ; НОЙ ВОДОЙ Два раза и псшторно цевтрифуч : гируют.Yeast cells are destroyed with ethyl acetate and centrifuged at 5OOO rpm for 10 minutes. The destroyed cells are washed distilled; NOY WATER Twice and double-flush: Guy.

Из разрушенных и промытых клеток экстрагируют цитохром С раствором сахарозы (0,25 М). Причем осуществл ют этот процесс в присутствии сульфата аммони до 1О%-ного насыщени . Значений рН раствора с помощью 5%-ного раство ;ра аммиака устанавливают 7,0-7,5. За ,тем раствор оставл ют в покое при 5IJLD С в 7ечение 2,5-3,0 часов. ПослеFrom the destroyed and washed cells are extracted with cytochrome C sucrose solution (0.25 M). Moreover, this process is carried out in the presence of ammonium sulphate up to 1O% saturation. The pH of the solution with a 5% solution is set at 7.0-7.5. Over, the solution is left alone at 5IJLD C for 7–3 hours to 3–3.0 hours. After

этого его центрифуткрукхг пглг 13ООО об/мин в течение Ю мин при 1-4 С. Пол -ченн ю надосадоч гую жидкость красноватого цвета провер ют спектрефотометрически . При наличии максимумов спектропоглошенй при длинах волн 316,412,548 и 548 нм продолжают процесс.This is done by its centrifugal shrub 13OOO rpm for Yu min at 1-4 C. The reddish supernatant of the red blood is checked by spectrophotometry. In the presence of maxima of spectroplashes at wavelengths of 316.412.548 and 548 nm, the process continues.

Жидкость став т на иализ в целлофа: новых мешках против 2 О объемов 2 мМ раствора- однозвмещенного фосфата кали , i содержащего О,.-:5 М сахарозы в течение 16 час, а затем пропускают через коло: -; ку КМ-целлюлозвл, обработанной 2 мМ , раствором фосфата кали з статических услови х (т.е. в резервуарах). Адсорбиро- ванный цитохром С на КМ-целлюлозе пе ренос т на стекл нную воронку к промывают 10 ivdAI раствором с нозамегаекного фосфата кали (с применением вакуума). Элюцкю провод т буферным раствором двузамещенного фосфата натри рН 8,5 : 9,0, Элюат пропускают через копошг/The liquid is placed on the cell in celloph: new bags versus 2 O volumes of 2 mM solution of unified potassium phosphate i containing O, .-: 5 M sucrose for 16 hours and then passed through colo: -; KM-cellulose treated with 2 mM potassium phosphate solution under static conditions (i.e., in tanks). The adsorbed cytochrome C on KM cellulose is transferred to a glass funnel and washed with 10 ivdAI solution with potassium phosphate nosmegegec (using vacuum). Elutsku carried out with a buffer solution of disubstituted sodium phosphate pH 8.5: 9.0, the Eluate is passed through a pile /

ДЗАЗ целлюлозьь обработанной указанны : выше буфером.DAZ cellulose treated indicated above: buffer.

Раствор й лаллзукут в цеплофановых меjuKax против 2О объемов. 2 мМ раствора однозамешегпюго фосфата калий в присут: ствйк 0,25 Мсахарозы в течение 8 час ; затем хроматографируют на КМ- целлголозы. ггромывают и элюирую .Solution lallzukut in zelfan mejuKax against 2O volumes. 2 mM solution of potassium phosphate mono-mixed phosphate in the presence of: 0.25 MS of sucrose for 8 hours; then chromatographic on CM-cell gool. rumble and elute.

Раствор цито рома С ставит ка еиелиз против дистнллированкой воды в течениеA solution of cyto-rum C puts kaelice against distnlirovkoy water for

4four

:1О час, после чего высушива от лиофиль о при 75 С: 1O hour, after which it dries from lofil o at 75 С

Выход фермента при пересчете на высушенные дрожжи ™ 0,04% при содержанЕ и чистого цитохрома С 50-55%.The yield of the enzyme in terms of dried yeast ™ is 0.04% with the content and pure cytochrome C 50-55%.

Цитохром С, пол Т1енный по данному способу, проверен в экспериментальных и клинических услови х и дал положительные результаты при лечении патологичесних состо ний, св5{эакных с гипоксией и аноксией (различные нарушени KpOBo;i6ращени : кислородное голоданием организма , отравлени ,; мышечные и нервные заболевани , травмы мозга, ожоги).Cytochrome C, the T1 sex in this method, has been tested in experimental and clinical conditions and has yielded positive results in the treatment of pathological conditions associated with hypoxia and anoxia (various disorders of KpOBo; i6 rotation: oxygen starvation of the body, poisoning; muscle and nervous diseases, brain injuries, burns).

ОABOUT

редмет изобретени redmet invention

Способ получени цитохрома С путем экстракции разрушенных этилацетаТом дрожжевых клеток в присутствии сульфата аммони , освобождени экстракта от взвешенных частиц, диализа, последующей очистки с использованием ДЭАЭ-целлюло- зьт и КМ-целлюлозы, отличаю щий с 3 тем, что, с целью повышени выхода п-олевого продукта, экстракцию осущес твл ют раствором сахарозы, а очистку провод т по-слелователъной сорбцией целевого продукта в статических услови х на КМ-ыеллюлозе и пропусканием элюата через колошсу ДЗАЗ-неллюлозы и КМцеллюлозы .The method of obtaining cytochrome C by extracting yeast cells destroyed by ethyl acetate in the presence of ammonium sulfate, freeing the extract from suspended particles, dialysis, subsequent purification using DEAE-cellulose and CM-cellulose, which differs from 3 - a salt product, extraction is carried out with a solution of sucrose, and purification is carried out by sorption of the target product by static in static conditions on the CM cellulose and passing the eluate through the head of DAZ-nellulose and KM cellulose.