SU451249A3

SU451249A3 - The method of producing penicillin acylase

Info

Publication number: SU451249A3
Application number: SU1836202A
Authority: SU
Inventors: Карл Кутбац
Original assignee: Байер Аг (Фирма)
Priority date: 1971-10-14
Filing date: 1972-10-12
Publication date: 1974-11-25
Also published as: ZA727323B; DE2151236A1; AU4779372A; DE2151236B2; CS182227B2; DE2151236C3

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗЫ(54) METHOD FOR OBTAINING PENICILLINACILASE

200 г бентонита, отдел ют аналогичным образом и вымывают 5 л 1 М ацетата натри ори рН 8,0. Элюат 51000 ед. (53%), специфическа активность 1,8 ед/мг обессоливают фильтрацией на геле и после хроматографировани на сефадексе SE получают раствор чистых энзимов , который концентрируют, смешивают с насыщенным раствором сульфата аммони и кристаллизуют пенициллинацилазу, как в примере 1.200 g of bentonite are separated in a similar manner and washed out with 5 L of 1 M sodium acetate or pH 8.0. Eluate 51,000 units (53%), the specific activity of 1.8 U / mg is desalted by filtration on a gel, and after chromatography on Sephadex SE a solution of pure enzymes is obtained, which is concentrated, mixed with a saturated solution of ammonium sulfate and penicillin acylase crystallizes, as in Example 1.

Пример 3. Переведенный в растворимую форму сырой экстракт, полученный из 2900 л культуры Е. соИ, центрифугируют при рН 5,0, 256 л чистого раствора (150000 ед., специфическа активность 0,32 ед/мг) разбавл ют водой до 920 л, добавл ют 1 кг бентонита, размешивают 1 час, отдел ют центрифугированием . Вымывают 0,5 М ацетатом натри при рН 8,0 и получают 6,9 л раствора (62000 ед., специфическа активность 1,2 ед/мг). Вторым промыванием бентонита 0,5 М фосфатом натри получают 9,8000 ед. Общий выход 47%.Example 3. The soluble extract, obtained in soluble form, obtained from 2900 l of E. coli culture, is centrifuged at pH 5.0, 256 l of pure solution (150000 units, specific activity 0.32 u / mg) is diluted with water to 920 l 1 kg of bentonite is added, stirred for 1 hour, separated by centrifugation. Wash with 0.5 M sodium acetate at pH 8.0 and obtain 6.9 liters of solution (62000 units, specific activity 1.2 units / mg). The second washing of the bentonite with 0.5 M sodium phosphate gives 9.8000 units. Total yield 47%.

Элюат (47000 ед.) обессоливают фильтрацией на геле, довод т рН до 5,0 и подают мл влажного сефадекса SE, обработанного 0,05 М ацетатом натри (рН 5,0), адсорбируют сефадекс SE, гель отфильтровывают и ввод т в колонку диаметром 5 см, содерл ащую 1600 мл свежего сефадекса SE в 0,05 М ацетата натри (рН 5,0). Затем вымывают линейным градиентом из 4 л 0,07 М и 4 л 0,25 М ацетата натри , рН 5,0. Соединенные активные фракции содержат 36000 ед. чистого энзима со специфической активностью 5,3 ед/мг.The eluate (47,000 units) is desalted by filtration on a gel, the pH is adjusted to 5.0 and a ml of wet Sephadex SE, treated with 0.05 M sodium acetate (pH 5.0) is fed, the Sephadex SE is adsorbed, the gel is filtered and introduced into the column 5 cm in diameter, containing 1600 ml of fresh Sephadex SE in 0.05 M sodium acetate (pH 5.0). Then it is washed out with a linear gradient of 4 liters of 0.07 M and 4 liters of 0.25 M sodium acetate, pH 5.0. The combined active fractions contain 36,000 units. pure enzyme with a specific activity of 5.3 units / mg.

Раствор чистого энзима концентрируют и осторожно добавл ют твердый сульфат аммони до наступлени легкого помутнени . Кристаллизаци происходит при через несколько дней.The pure enzyme solution is concentrated and solid ammonium sulfate is added carefully until a slight turbidity occurs. Crystallization takes place after several days.

Пример 4. Сырой экстракт из клеток Е. соИ концентрируют центрифугированием в густую суспензию и клетки известными способами , а в случае необходимости добавлением 3%-ного метилизобутилкетона перевод т в растворимую форму.Example 4. The crude extract from E. coli cells is concentrated by centrifuging into a thick suspension and the cells are known by methods known, and, if necessary, they are added to a soluble form by the addition of 3% methyl isobutyl ketone.

610 л сырого экстракта (1,3-10 ед.) разбавл ют деионизированной водой до 2100 л, довод т значение рН до 5,0 серной кислотой, центрифугируют и получают прозрачный раствор (1,42-10 ед., специфическа активность 0,42 ед/мг). При рН 5,0 добавл ют 13,8 кг бензонита и через 30 мин отдел ют в проточной центрифуге. Отделенный бентонит вымывают 90 л 0,5 М раствора ацетата натри , довод рН до 8,0, отфильтровывают, получа 92,5 л раствора l, ед. (86%), специфическа активность 1,64 ед/мг.610 liters of crude extract (1.3-10 units) are diluted with deionized water to 2100 liters, the pH is adjusted to 5.0 with sulfuric acid, centrifuged and a clear solution is obtained (1.42-10 units, specific activity 0, 42 units / mg). At pH 5.0, 13.8 kg of benzonite is added and after 30 min it is separated in a flow centrifuge. The separated bentonite is washed out with 90 liters of a 0.5 M solution of sodium acetate, adjusting the pH to 8.0, filtered to obtain 92.5 liters of solution I, unit (86%), specific activity of 1.64 units / mg.

1 л элюата диализируют в присутствии 0,001 М калийфосфатного буфера при рН 7,0.1 l of eluate is dialyzed in the presence of 0.001 M potassium phosphate buffer at pH 7.0.

Раствор энзима (8250 ед., специфическа активность 1,8 ед/мг) пропускают через колонку , элюируют 2 л 0,01 М и 2 л 0,1 М буфера при рН 7,0, собира фракции по 25 мл. Пенициллинацилаза содержитс во фракци х 110-170°С 1,2 л, 6760 ед. (82%), специфическа активность 6 ед/мг.The enzyme solution (8250 units, specific activity 1.8 units / mg) is passed through the column, eluted with 2 liters of 0.01 M and 2 liters of 0.1 M buffer at pH 7.0, and collecting 25 ml fractions. Penicillin acylase is contained in fractions 110-170 ° C 1.2 l, 6760 units. (82%), specific activity of 6 units / mg.

Раствор осаждают твердым сульфатом аммони (472 г/л), осадок отдел ют центрифугированием и раствор ют в воде. Часть раствора (4700 ед.) разбавл ют сульфатом аммони до 46%-иого насыщени , отдел ют цеитрифугированием до прозрачности и сохран ют при комнатной температуре. В течение недели выпадают кристаллы, их центрифугируют , раствор ют в 0,01 М фосфорного буфера и диализируют с тем же буфером 3300 ед.The solution is precipitated with solid ammonium sulfate (472 g / l), the precipitate is separated by centrifugation and dissolved in water. A part of the solution (4700 units) was diluted with ammonium sulfate to 46% saturation, separated by zeitrifugation to transparency and stored at room temperature. Crystals fall out within a week, centrifuge them, dissolve in 0.01 M phosphoric buffer and dialyze with the same buffer 3300 units.

(70%), специфическа активиость 12,45 ед/мг. Пример 5. 60 л переведенного в растворимую форму сырого экстракта довод т до рП 5,0 и центрифугируют. К отсто вшемус прозрачному раствору(70%), specific activity of 12.45 units / mg. Example 5. 60 liters of the crude extract, converted into a soluble form, are brought to RP 5.0 and centrifuged. To vsemus clear solution

(155000 ед., специфическа активность 0,3 ед/мг) добавл ют ионообмеиник и обессоливают . В этот раствор при рН 5,0 добавл ют сначала 200 г бентонита, отдел ют центрифугированием и выбрасывают, затем добавл ют(155000 units, specific activity 0.3 units / mg) are added to the ion-exchangers and desalted. To this solution at pH 5.0, first 200 g of bentonite is added, separated by centrifugation and discarded, then added

еще 800 г бентонита, центрифугируют и вымывают 20 л 0,5 М ацетата натри (рН 8,0).another 800 g of bentonite are centrifuged and washed with 20 liters of 0.5 M sodium acetate (pH 8.0).

Раствор энзима (110000 ед., специфическа активность 1,5 ед/мг) диализируют в присутствии 0,5 М натрийацетатного буфера, довоД т рН до 5,0 и подают на колонку, заполненную сефадексом SEC-50, обработанным 0,5 М ацетатом натри (рН 5,0). В качестве элюента используют 15 л 0,07 Ми 15 л 0,25 М ацетата натри , (рН 5,0). Активные фракцииThe enzyme solution (110,000 units, specific activity 1.5 units / mg) is dialyzed in the presence of 0.5 M sodium acetate buffer, adjusted to pH 5.0, and fed to a column filled with Sephadex SEC-50 treated with 0.5 M acetate sodium (pH 5.0). 15 l of 0.07 mi and 15 l of 0.25 M sodium acetate (pH 5.0) are used as eluent. Active fractions

88000 ед. (807о), специфическа активность 4,2 ед/мг (29000 ед.) этого раствора диализируют в присутствии 0,01 М. калийфосфатного буфера (рН 7,0) и подают на колонку с сефадексом А-50 в 0,01 М фосфата кали , рН 7,0.88000 units (807o), the specific activity of 4.2 units / mg (29000 units) of this solution is dialyzed in the presence of 0.01 M of potassium phosphate buffer (pH 7.0) and fed to a column with Sephadex A-50 in 0.01 M phosphate potassium, pH 7.0.

В качестве элюента используют 0,01-0,1 М фосфата кали (рН 7,0), затем вымывают пенициллинацилазу 21000 ед. (73%), 11,2 ед/мг специфическа активность. Часть раствора (6000 ед.) довод т твердым сульфатом аммони до 45%-ного насыщени . Через две недели на стенках сосуда образуютс большие кристаллы. Еще через две недели при комнатной температуре кристаллы отдел ют на центрифуге и небольшое количество раствор ют в воде 4260 ед. (71%), специфическа активность 13,1 ед/мг.0.01-0.1 M potassium phosphate (pH 7.0) is used as eluent, then 21000 units of penicillin acylase are washed out. (73%), 11.2 U / mg specific activity. Part of the solution (6000 units) is adjusted to 45% saturation with solid ammonium sulfate. After two weeks, large crystals form on the walls of the vessel. After another two weeks at room temperature, the crystals were separated in a centrifuge and a small amount of 4260 units of water was dissolved in water. (71%), specific activity of 13.1 units / mg.

Пример 6. Элюат бентонита, полученный как в примере 4 (4100 ед., 2,0 ед/мг) диализируют в присутствии 0,05 М ацетата натри (рН 5,0) и подают на колонку с Lewatit SP-100---Na+.Example 6. A bentonite eluate prepared as in Example 4 (4100 units, 2.0 units / mg) was dialyzed in the presence of 0.05 M sodium acetate (pH 5.0) and fed to a column with Lewatit SP-100 --- Na +.

В качестве элюента используют 0,05-0,5 М ацетата натри , (рН 5,0). Активные фракции0.05-0.5 M sodium acetate (pH 5.0) is used as eluent. Active fractions

2020 ед. (56%), специфическа активность 6,6 ед/мг энзима довод т с едким натром до рН 6,5, насыщают твердым сульфатом аммони до 48% и кристаллизуют чистый энзим 1250 ед. (62%), специфическа активность2020 units (56%), the specific activity of 6.6 units / mg of the enzyme is adjusted to pH 6.5 with caustic soda, saturated with ammonium sulfate to 48% and the pure enzyme crystallizes 1250 units. (62%), specific activity

12,1 ед/мг. 5 Предмет изобретени Способ получени пенициллинацилазы путем разрушени клеток Е. соИ, выделени целевого продукта из сырого экстракта и очи-5 стки хроматографическими методами, от л ичающийс тем, что, с целью повышени 6 : выхода и качества целевого продукта рН экстракта довод т до 3,5-5,5, отдел ют осадок , хроматографируют на силикатах алюмини , например на бентоните, и кристаллизуют целевой продукт в присутствии сульфата аммони . 12.1 units / mg. 5 The subject of the invention. A method for producing penicillin acylase by destroying E. coli cells, isolating the target product from the raw extract and purification using chromatographic methods, which is based on the fact that the pH of the extract is adjusted to 3 to increase the yield and quality of the target product. , 5-5.5, the precipitate is separated, chromatographed on aluminum silicates, for example bentonite, and the desired product crystallizes in the presence of ammonium sulfate.