SU404348A1 - Способ получени меченного тритием гуанозин-5-трифосфата - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к улучшенному способу получени  меченного тритием биолЮгического соединени , которое может най ти применение дл  биологических и биохимических исследеваний. Известен способ получени  меченного С гуанозин-5--трифосфата, заключающийс  в том, что выращивают культуру микроорганизмов на среде, содержащей С 0.,, выдел ют из биомассы меченую РНК, гидролизуют ее до нуклеотидов, раздел ют их с последующим биохимическим фосфорилированием меченого гуанозин- 5 -монофосфата до меченого гуанозин-5 -трифосфата. Однако известный способ получени  меченого гуанозин-5 -трифосфата позвол ет получить целевой продукт только низкой удельной активности (не более 5020О м кюри/г) и с очень незначительным ходом (по суммарной активности). При этом метка по молекуле гуанозин-5 -трифосфата распределена неопределенно Целью изобретени   вл етс  повышение удельной активности и радиохимической чис тоты. Дл  этого 8-бромгуанозин, абсорбированный на палладиевом катализаторе, подвергают обработке газообразным тритием в услови х высокочастотного электрического разр да с промежуточным выделением меченного гуанозина-8-(Т) и последующей радиохимической очисткой гуанозина- 8 (Т), совмещенной со стадией фосфорилировани . Обычно гуанозин-8(Т) выдел ют на смоле Дауэкс 1x8 в формиатной форме элюапий 0,1 N растьороммуравьиной кислоты, после чего его концентрируют при помощи активированного угл . Продукты фосфорилировани  гуанозина-8 (Т) обычно раздел ют хроматографией на ионообменном сефадексе А-2 5 в бикарбонатной форме при помощи триэтиламмоний -бикарбонатного буфера. Выход гуанозин-5 -трифосфата - 8(Т) по активности составл ет 5О% (в расчете на промежуточный гуанозин - 8(Т) ). Преимуществом предложенного способа  вл етс  то, что основна  масса посторонней радиоактивности, не св занной с гуанозином , сбрасываетс  при выделении гуанозина- 8(Т). Дополнительна  радиохимическа  очистка происходит при концентрировании гуанозина-8(Т) на активированном угле . Наконец, наиболее тонка  и сложна  очистка от продуктов радиационного поврё  дени  гуанозина, хроматографически сходных с гуанозином, совмещена с процессом биохимического фосфорилировани . Благодар  высокой специфичности фермента к субстрату, радиационно-поврежден ные молекулы не фосфорилируютс  и св занна  с ними активность легко сбрасываетс  в процессе разделени  продуктов фос форилировали . Пример. 145 мг 8-бромгуанозина нанос т на 600 мг катализатора (10% Р на угле Норит). Тритирование провод т в стекл нной ампуле со впа нным электродом , вокруг которого помещают нанесенный на стекл нную вату катализатор с 8-брэмгуанозином . Продолжительностьтрити- рова и  в атмосфере 99%-го трити  в услови х высокочастотного электрического разр да составл ет 2 О мин. Температура в ам ле в процессе тритировани  12 0-130 С. По окончании процесса вещество смывают с катслизатора 60 мл спиртоаммиачной смеси (1 N раствор N Hj в 50%-м спирте) и лабильный тритий замещают на водород путем повторного изотопного уравновешивани  с водой. Сухой остаток после отгонки последней порции воды раствор ют в 20 мл дистиллированной воды и ввод т в колонку с Дауэкс 1x8 в формиатной форме (3x30 см). Колонку промывают 250 мл дистип лированной воды, а затем выдел ют гуанозин 8 (Т) в виде четкого пика при элюации - ЗОО мл 0,1 N муравьиной кислоты. Далее выдел ют 8-бромгуанозин-Т ( -У ), использу  дл  элюации 0,2 N муравьиную кислоту . В эксперименте получаетс  - 30 мг гуанозина-8(Т) с удельной активностью 10 кюри/г (т.е. 300 мкюри), и 40 мг 8-бромгуанозина-Т ( if ) с удельной активностью 1 кюри/г (т.е. - 40 мкюри). Полученный препарат гуанозина-8(Т) концентрируют при помощи активированного угл  и фосфорилируют (использу  10 мл ферментного раствора до гуанозин-5-трифосфат-8 (Т) ГТФ-8(Т)). Продукты фосфорилировани  раздел ют на колонке (1,5x21 см), заполненной сефадексом А-25 в бикарбонатной форме. Дл  элюции примен ют градиент концентрации триэтиламмоний-бикарбоната (от 0,2М до 0,6 М). Соответствующие фракции собирают , обессоливают при помощи сефадекса С-25 (в Н-форме) и концентрируют выпариванием в вакууме. В результате эксперимента получают 55 мг ГТФ-8 (Т) с удельной активностью ,8 кюри/г (т.е. -150-160 мкюри) .Проверка чистоты полученного препарата показала, что гуанозин-5 -трифосфат-8 (Т) хроматографически однороден и радиохимически чист. формула изобретени  Способ получени  меченного тритием гуанозин-5 -трифосфата биохимическим фосфорилированием меченного гуанозина с пос ледующим выделением целевого продукта известным способом, о т л и ч а ю щ и йс   тем, что, с целью повышени  удельной активности и радиохимической чистоты, . 8-бромгуанозин, абсорбированный на палладиевом катализаторе, подвергают обработке газообразным тритием в услови х высокочастотного электрического разр да с промежуточным выделением меченого гуанозина- 8 (Т) и последующей радиохимической очисткой гуанозина-8(Т), совмещенной со стадией фосфорилировани .