SU1747072A1

SU1747072A1 - Средство дл реконструкции мембран IN VIтRо

Info

Publication number: SU1747072A1
Application number: SU904832451A
Authority: SU
Inventors: Абдумалик Нигматович Арипов; Тургунпулат Абидович Даминов; Арибджон Шукурович Исамухамедов; Галина Ивановна Бачманова; Людмила Михайловна Фесенко; Масрура Абдурауфовна Абдугафурова; Наталья Викторовна Домбровская; Лола Лазизовна Ахунджанова
Priority date: 1990-04-02
Filing date: 1990-04-02
Publication date: 1992-07-15

Abstract

Изобретение относитс к биохимии и касаетс средств дл реконструкции мембран In vitro. Цель изобретени - повышение специфической активности. Предлагаемое средство состоит из фосфатидилхолина хлопчатника и тринатриевой соли глицирри- зиновой кислоты при соотношении 1,0:0,1- 0,2. Полученное средство примен етс как реактив дл реконструкции мембран при биохимических исследовани х. 4 табл.

Description

Изобретение относитс к биохимии и касаетс реактива - средства дл реконструкции мембран in vitro.

Цель изобретени - повышение специфической активности.

П р и м е р 1. В круглодонную колбу объемом 500 мл помещают 2 г фосфатидилхолина хлопчатника, добавл ют 20 мл диэ- тилового эфира, закрывают колбу пробкой и перемешивают содержимое до полного растворени фосфадилхолина (ФХхл). Диэтило- вый эфир упаривают досуха на роторном испарителе при , приливают к содержащемус на станках колбы ФХхл 100 мл 0,2%-ного раствора тринатриевую соль гли- цирризиновой кислоты (ЫазГК) в 130 мм трио-буфера (рН-7,4), содержащего 200 мг ЫазГК. Интенсивно перемешивают содержимое до полного отделени ФХхл от стенок колбы и его солюбилизации. Образовавшуюс мутную жидкость перенос т порци ми по 4,0 мл в стекл нные стаканы , помещают их в емкость со льдом и воздействуют ультразвуком с частотой 44

кГц на ультразвуковом дезинтеграторе до получени прозрачной опалесцирующей жидкости. Общее врем воздействи ультразвука составл ет 15 мин. Полученную жидкость центрифугируют при 30 000 об/мин в течении 15 мин, Центрифугат использовали дл репарации поврежденных мембран клеток печени. Получивша суспензи содержит 20 мг ФХхл и 2 мг ЫазГК в 1 мл, рН суспензии 7,4; размерчастиц 36-40 нм, осмол рность 210 мосмоль, оптическа плотность при нм составила 0,057. адсорбции суспензии при Я 660 нм - 91 %, прозрачность максимальна ,

П р и м е р 2. По примеру 1 в круглодонную колбу внос т 2 гр, ФХхл и раствор ют его в 20 мл органического растворител . После полного растворени ФХхл диэтиловый эфир упаривают на роторном испарителе при . Затем к ФХхл, выкристаллизовавшемус на стенках колбы, приливают 100 мл 130 мМ трис-HCI буф.раствора, содержащего 300 мг №зГК. Интенсивно перемешивают до его полной солюбилизации,

сл

с

2

XJ

о XJ

ю

Образовавшуюс мутную жидкость в стака ны дл ультразвукового озвучивани и на холоду воздействуют ультразвуком с частотой 44 КГц в течении 15 мин Полученную прозрачную жидкость центрифугируют при 30000об/мин втечение 15мин. Полученна суспензи содержала 22 кг Фххл и 3 кг мг МазГК в 1 мл и имела следующие физико-химические свойства, рН-7,38, размер частиц 35-40 нм, осмол рность 210 мосмоль, опти- ческа плотность при Я-660 не 0,06; адсорбци суспензии при Я 660 нм составила 89,0%, прозрачность максимальна .

П р и м е р 3. По примеру 1, 2, 5 г ФХхл раствор ли Q20 мл органического растворител , высушивали его на роторном испарителе и солюбилизировали в 100 мл 130 мм TDvic-HCI буф. раствора, содержащего 400 мг ЫазГК. При выборе оптимальных кон- центраций составных частей суспензии испытаны следующие концентрации тринатриевой соли глицирризиновой (ЫззГК):0,05; 0,1; 0,15; 0,2: 0,25 мас.ч. на 1,0 мае,ч. фосфатидилхолина.

Об эффективности действи препарата судили по замедлению инактивации цитох- рома Р-450 в поврежденных микросомах после инкубации их с суспензией (повреждение микросом вызывали введением кры- сам гепатотоксинов ССЦ и гелиотрина). Количественно замедление инактивации цитохрома Р-450 определ ли по времени полуинактивзции его t v:

Результаты исследований представлены в табл. 1.

Из таблицы видно, что концентраци МазГК 0,05 мас.ч. недостаточна дл максимального про влени репарирующей спо- собности препарата, при концентрации №зГК от 0,1 до 0,2 мас.ч. наблюдали максимальный репарирующий эффект препарата, а при концентрации 0,2 и выше эффективность препарата оставалась без изменений, что вилось обоснованием дл выбора концентрации ЫазГК: 0.1-0,2 мае.ч. на 1,0 мае ч. фосфатидилхолина хлопчатника

Конкретные примеры применени средства.

Об эффективности реконструкции мембран микросом печени в экспериментах in vitro суд т по скорости инактивации циотох- рома Р-450 скрининг тесту, специфичному дл повреждени эндоплазматического ре- тикулума печени.

Острые токсические повреждени печени вызывали введением гепатотропных

агентов: четыреххлористый углерод и гелиотрина

Фосфолипидными препаратами вз тыми дл сравнительного изучени их эффективности вились; 1) фосфотидилхолин хлопчатника с тринатриевой солью глицирризиновой кислоты (по предлагаемой суспензии дл реконструкции мембран) ФХхл+ЫазГК; 2) фосфадилхолин хлопчатника с солодковым пенообразователем ФХхл+ГК; препарат Эссенциале-фирмы На- ттерман, ФРГ.

С целью репарации мембран микросхем , а также сравнени эффективности фосфолипидных препаратов фракцию мембран микросом выдел ли из печени крыс с острым токсическими гепатитами, затем инкубировали их с препаратами фосфолипи- дов и регистрировали скорость инактивации цитохрома Р-450.

Инактизацию цитохрома Р-450 использовали как тест дл определени состо ни мембран Инактивацию регистрировали в течение 20 мин при 37°С.

Из таблицы видно, что врем полуинак- тивэции фермента при острых токсических воздействи х на печень резко снижаетс (5- 8 мин). О хорошем репарирующей действии препаратов ФХхл+№зГК и ФХхл+СП можно судить по возрастанию времени полуактивации цитохрома Р-450, тогда как препарат эссенциале не оказывал репарирующего действи на поврежденные микросомы печени .

Репараци мембран эндоплазматического ретикулума печени крыс, поврежденных фосфолипазой А2.

В опытах in vitro использовали фосфо- липазу ) из пчелиного да (ех Вге venum) фирмы Caltiochem (США) удельна активность которой равн лась 1000 ед. в мг, фосфолипаза А2 - фермент, гидрализующий фосфолипиды (в основном фосфатидилхо- лин в /8 -положении). Микросомы в этой серии выдел ли из печени здоровых крыс. Микросомы инкубировали с . В табл. 3 определено врем полуинактивации (t 1/2 цитохрома Р-450 в микросомах, поврежденных фосфолипазой А2.

Предлагаемое средство позвол ет повысить уровень времени полуинактивации цитохрома Р-4500, что свидетельствует о репарационной активности предлагаемого средства.

Изучение восстановлени функциональной активности поврежденных мембран .

О состо нии функциональной активности поврежденных мембран судили по скорости окислени субстратов цитохрома Р-450 анилина и аминопирина. Дл изучени включени предлагаемого средства на скорость гидроксилировани анилина и ди- метилировани аминопирина использовали микросомы, поврежденные ф Аа.

Из табл. 3 видно, что в поврежденных микросомах скорость окислени обоих субстратов снижена. Инкубаци поврежденных ФА2 микросом с указанным средством приведена к увеличению скорости окислени субстратов, что свидетельствует о восстановлении функциональной активности поврежденных мембран эндоплазматического ретикулума.

Скорость окислени анилина и аминопирина в микросомах печени крыс, поврежденных фосфолипазой Аа и инкубированных с суспензией ФХхл f ГК (нмоль) образовавшегос продукта в мин, белка приведена в табл.4.

Claims

Формула изобретени Средство дл реконструкции мембран tn vitro, содержащее фосфатидилхолин хлопчатника и детергент, отличающее- с тем, что, с целью повышени репарационной активности, в качестве детергента используют тринатриевую соль глицирризи- новой кислоты при соотношении фосфатидилхолин: детергент 1-0,1-0,2.

Таблица 1

Врем полуинактивации цитохрома Р-450 в поврежденных микросхемах печени крыс и проинкубированных с суспензией

Примечанием /2 цитохрома Р-450 в поврежденных микросхемах без инкубации с суспензией при СС Ц гепатите 5 мин., при гелиотриновом 8 мин.

Реконструкци поврежденных мембран эндоплазматичег.кого ретикулума фосфолипидными препаратами

Таблица 2

Примечание: Инкубацию микросом, обработанных ФА2, с

суспензией проводили на 3 мл фосфолипидной суспензии на 1 нмоль цитохрома Р-450 в течение 1 чпри4°С.

Таблица 3

Таблица 4