SU1742328A1

SU1742328A1 - Способ активации галактозооксидазы

Info

Publication number: SU1742328A1
Application number: SU904844241A
Authority: SU
Inventors: Людмила Владимировна Кондакова; Виктор Васильевич Янишпольский; Валентин Анатольевич Тертых; Татьяна Трифоновна Буглова
Original assignee: Институт Химии Поверхности Ан Усср
Priority date: 1990-06-25
Filing date: 1990-06-25
Publication date: 1992-06-23

Abstract

Использование: пищева промышленность и медицина. Сущность изобретени : дл повышени активности галактозоокси- дазы готов т растворы этого фермента в 0,05М фосфатном буферном растворе (рН 7,0), содержащем в качестве активатора эти- лендиаминтетраацетатный комплекс меди (Cu-ЭДТА) в концентрации - моль/л. В пределах данного интервала концентрации Cu-ЭДТА в растворе фермента коэффициент повышени активности последнего превышает известный в 1,5 - 2,0 раза. В присутствии Cu-ЭДТА фермент сохран ет активность при комнатной температуре в течение 2-3 сут. Предлагаемый способ позвол ет повысить точность и достоверность определени галактозы в биологических жидкост х. 1 табл.

Description

(Л

С

Изобретение относитс к биохимии, в частности к способам активировани ферментов , и может быть использовано в пищевой промышленности и медицине.

Известно активирующее воздействие на галактозооксидазу феррицианида кали .

Известен способ активации фермента галактозооксидазы в растворе, при котором в качестве активирующих агентов используют NaJOs, KaCraO, NaJ04, (М02)б и Na2Mo04 2H20 и дополнительно и&ны меди. При этом наблюдаетс повышение активности фермента галактозооксидазы в растворе относительно исходной в 3 раза.

Известны способы активации галактозооксидазы в растворе, включающие введение в раствор фермента трилона Б, или смеси феррицианида кали с каталазой, или смеси фзррицианида кали с ЭДТА.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому вл етс способ активации галак- тозооксида зы раствором хлороиридата натри . К раствору галактозооксидазы в фосфатном буферном растворе (рН 7,0) при- бавл ют раствор хлороиридата натри (NaalrCle). Полученный раствор обладает повышенной ферментативной активностью. В интервале концентраций хлороиридата 1 моль/л в растворе активность фермента увеличиваетс в 30,7 - 32,1 раз. Этот коэффициент повышени активности галактозооксидазы вл етс максимальным дл известных активаторов галактозооксидазы.

Недостатком известного способа вл етс небольшой коэффициент повышени активности галактозооксидазы.

Целью изобретени вл етс повышение активности галактозооксидазы.

Поставленна цель достигаетс тем, что согласно способу активации галактозооксидазы , включающему введение в буферный

2 ю со ю

00

раствор фермента добавки, в качестве добавки берут этилендиаминтетраацетатный комплекс меди с концентрацией 4.10 -4-Ю 4моль/л в активируемом растворе галакто- зооксидазы.

Дл реализации способа используют CuCl2 2H20 квалификации х.ц., этилендиа- минтетраацетат натри (трилон Б), ЭДТА квалификации х .ч , галактозу квалификации х.ч. , фермент галактозооксидазы, вы- деленный из Fusarlum graminearum ИМВ-Р-1060, в качестве буферного раствора испольауют 0,05 М Na фосфатный буфер (рН 7,0);

Фермент галактозооксидаза получен по известному методу.

Активность лиофильно высушенного порошка фермента составл ет 0,1 ед/мг. Активность раствора фермента регистрируют по про вл емой активности. Активность галактозооксидазы определ ют в растворе галактозы с концентрацией 0,1 моль/л в 0,05 М фосфатном буферном растворе (рН 7,0). Дл этого в термостатированную при 25°С чейку с кислородным электродом Кларка помещают 5,5 мл соответствующего раствора галактозы. После термостатирова- ни прибавл ют 0,5 мл раствора фермента и регистрируют на ленте самописца кинетику потреблени кислорода (1 ед, активности соответствует количеству фермента, катализирующего окисление 1 мкмоль субстрата за 1 мин).

Активность фермента в присутствии солей меди (II) осуществл ют следующим об- разом.

Готов т растворы галактозооксидазы в 0,05 М фосфатном буферном растворе (рН 7,0), дополнительно содержащие этилендиаминтетраацетатный (ЭДТА) комплекс меди с различными концентраци ми ( - 1 моль/л). К 5,5 мл 0,1 М. раствора галактозы в термостатируемой чейке с кислородным электродом Кларка прибавл ют 0,5 мл раствора фермента с добавкой. Активность оп- ре дел ют как и дл раствора без добавок. Дл характеристики эффекта повышени активности фермента с активирующими добавками в растворе по отношению к активности исходного раствора используют коэффициент повышени активности (К), который равен отношению активности фермента в активируемом растворе к исходной активности фермента в растворе.

Пример 1. В термостатированной при 25°С чейке определ ют активность галактозооксидазы в буферном растворе, который содержит 0,1 моль/л галактозы и 1- моль/л ЭДТА комплекса медиДл расчета коэффициента повышени активности параллельно определ ют активность галактозооксидазы в 0,1 моль/л растворе галактозы без добавки ЭДТА комплекса меди .

Примеры 2-7. Провод т по примеру 1, но измен ют концентрацию ЭДТА комплекса меди в растворе фермента.

Пример 8. В термостатированной чейке к 5,5 мл раствора галактозы прибавл ют 0,5 мл раствора фермента с добавкой хлороиридата натри .

Данные вли ние ЭДТА комплекса меди на активность галактозооксидазы по примерам 1 - 8 приведены в таблице.

Приведенные в таблице данные показывают , что в пределах предлагаемого интервала концентрации ЭДТА комплекса меди в растворе фермента коэффициент повышени активности фермента выше, чем у известного (примеры 2 - 4). За пределами предлагаемого интервала (примеры 1, 5 и 6) цель не достигаетс .

Дополнительными опытами, в которых Cu-ЭДТА добавл ют непосредственно в раствор галактозооксидазы обнаружен неожиданный эффект повышени стабильности раствора фермента в присутствии Си-ЭДТА. Если раствор фермента без добавки Си-ЭДТА тер ет свою активность за 7 - 8 ч, то в присутствии Си-ЭДТА фермент сохран ет активность при комнатной температуре в течение 2-3 сут.

Таким образом, предлагаемый способ активировани галактозооксидазы позвол ет получить высокоактивный фермент в растворе . Применение предлагаемого способа позволит повысить точность и достоверность определени галактозы в биологических жидкост х.

Claims

Формула изобретени

Способ активации галактозооксидазы введением активатора в раствор фермента в 0,05 М фосфатном буфере с рН 7,0, отличающийс тем, что, с целью повышени активности целевого продукта, в качестве активатора используют этилендиаминтетраацетатный комплекс меди в концентрации 4-105 - 4 моль/л.

Хлороиридат натри