SU1718058A1 - Эталон дл калибровки спектрофлуорометра - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к технике оптических измерений. Цель изобретени  - повышение точности. Эталон представл ет собой монокристаллический иттрий-алюминиевый гранат, активированный примесью цери , дл  которого характерны следующие особенности: строго одноэкспоненциаль- ный закон затухани  флуоресценции в диапазоне двух пор дков; отсутствие перекрыти  спектров поглощени  и люминесценции; высока  термическа  и фотохимическа  стабильность; высокий квантовый выход люминесценции, не завис щий от длины волны возбуждени ; высока  степень сохран емости и удобство в эксплуатации.3 ил. fe

Description

Изобретение относитс  к технике оптических измерений, в частности к методам поверки и метрологической аттестации систем регистрации длительности оптических импульсов в наносекундном диапазоне длительностей и в видимой области спектра электромагнитного излучени .

Известны кристаллические этанолы уровн  рассе нного света, величины коэффициента поглощени , длины волны испускани  и возбуждени .

Однако известные этанолы не позвол ют проводить калибровку систем измерени  длительности импульсов флуоресценции. Между тем надежность и правильность флу- орометрических измерений определ ютс  двум  основными услови ми: качеством конструкции прибора и качеством метрологического обслуживани  при проведении измерений. Первое условие определ ет стабильность работы самого прибора и зависит от его основных параметров. Второе условие включает в себ  обеспечение сохранности показаний прибора, единства и точности измерений, что составл ет основную метрологическую задачу эксперимента. В св зи с этим перед измерени ми прибор необходимо стандартизировать, т.е. приводить к одной и той же чувствительности. Без проверки прибора незадолго до измерений и сразу после них трудно приписать определенный физический смысл параметрам наблюдаемого закона затухани . Это справедливо как дл  импульсных, так и дл  фазово-модул ционных измерений. Наиболее надежным методом, позвол ющим судить о качестве аппаратуры,  вл етс  исследование соединений с известным временем затухани , дл  которых закон затухани  можно описать одной экспонентой. Дл 

00

о ел со

таких соединений импульсна  аппаратура должна дать только одно врем  затухани , дл  фазово-модул ционной аппаратуры должны получатьс  одни и те же значени  фазовых и модел ционных вре- мен затухани  независимо от частоты модул ции . Если это не так, регулируют оптику и (или) электронные устройства, включа  ФЭУ таким образом, чтобы результаты измерений удовлетвор ли ука- занным требовани м.

Кроме того, как дл  импульсных, так и дл  фазово-модул ционных измерений необходимо точно определ ть зависимость интенсивности возбуждающего света от времени с целью учета вли ни  аппаратной функции. Дл  импульсных измерений это временна  зависимость интенсивности лампы, дл  фазово-модул ционного метода необходимо определ ть фазу возбуждаю- щего света и степень его модул ции. Такие измерени  дл  возбуждающего света обычно провод т, использу  рассе нный свет (нулевое врем  затухани ), а не отраженный , поскольку временные характеристики ФЭУ завис т от геометрии засветки фотокатода . Дл  этого на месте образца помещают рассеиватель и все измерени  провод т в тех же услови х, что и дл  образца, однако регистрацию провод т не при длине волны испускани , а при длине волны возбуждени . Вследствие этого из-за зависимости временных характеристик ФЭУ от длины волны излучени  могут возникнуть ошибки, св занные с различием длин волн при реги- страции флуоресценции образца и лампы. Величина этих ошибок определ етс  как зависимостью временной характеристики фотокатода от длины волны света, так и оптическими факторами, св занными с тем, что рассе нный свет и излучение флуоресценции дают различные изображени  на фотокатоде.

В импульсных измерени х по измеренному с помощью данной аппаратуры времени жизни т эталона и известному его действительному значению провод т обратные расчеты по определению вли ни  аппаратной функции.В фазово-моду- л ционных измерени х эталоны позвол ют получать сигналы, дл  которых известны соотношени  между фазой и степенью модул ции возбуждающего пучка света. Флуоресценцию как стандарта , так и образца наблюдают через интерференционный фильтр или через монохроматор, благодар  чему сравнение этих двух сигналов проводитс  при одинаковой геометрии, если оптические плотности D эталона и объекта примерно

одинаковы (в этом случае изображени  на фотокатоде в обоих случа х однотипны), и при близких длинах волн, если свечение эталона расположено в той же или в близкой спектральной области, что и флуоресценци  эталона, При этом необходимо иметь ввиду следующее.

При расчете действительной функции высвечивани  (исключение вли ни  аппаратной функции) в расчет закладываетс  одно- или многоэкспоненциальна  модель и рассчитываютс  отклонени  между этой моделью и полученной чистой функцией высвечивани , Вначале используетс  простейша  одноэкспоненциальна  модель , а затем двух-или п-экспоненциальна . Дл  более сложной модели расчетные отклонени  всегда меньше, чем дл  более простой , однако если усложнение модели не дает заметных уменьшений систематических изменений и флуктуации отклонений , считаетс , что действительный спад описьшаетс  более простой моделью. Следовательно , если эталон имеет одноэкепо- ненциальный спад известного значени , то при закладке в расчет модели с этим значением т должны быть получены минимальные значени  отклонений рассчитанных значений от полученных в эксперименте. Иными словами, одноэкспоненциальный спад,  вл  сь наиболее жестко детерминированным во всем диапазоне спада, позвол ет наиболее полно устранить вли ние аппаратной функции, поскольку он в наименьшей степени подвержен произволу при выборе модели.

Таким образом, как дл  метрологического обслуживани  флуорометров, так и дл  учета вли ни  аппаратной функции необходимы эталоны моноэкспоненциального высвечивани  флуоресценции.

Известны растворы, которые могут быть использованы в качестве эталонов квазизк- споненциального высвечивани . Наблюдае- ма  интенсивность, длительность и спектральное распределение интенсивности флуоресценции могут зависеть от оптической плотности образца и условий его освещени . Оптимальным  вл етс  наблюдение флуоресценции под пр мым углом к середине центрально освещенной кюветы. Фронтальное освещение (флуоресценци  поступает с той же поверхности, на которую налравл етс  излучение возбуждени ), во- первых, увеличивает веро тность попадани  на детектор флуоресценции отраженных фотонов возбуждени , что уменьшает измер емое значение т по сравнению с действительным. Во-вторых, уменьшаетс  чувствительность вследствие того, что больша  часть возбуждающего света отражаетс  от поверхности образца. Однако при наблюдении флуоресценции ортогонально к направлению возбуждени  за счет поглощени  возбуждающего света при прохождении им образца его интенсивность уменьшаетс , а следовательно, уменьшаетс  и интенсивность флуоресценции. В св зи с этим фокусировку возбуждающего света необходимо проводить в центр кюветы, с тем, чтобы наиболее интенсивна  флуоресценци  наблюдалась в центре кюветы, т.е. из области, котора  оптической системой отображаетс  на катоде фотоприемника, а оптическую плотность D раствора выбирать не более 0,2 - 0,3.

Кроме того, при перекрытии спектров поглощени  и флуоресценции наблюдаетс  вторичное поглощение (реабсорбци ) света флуоресценции. В этом случае свечение коротковолновой части спектра, которое попадает в область перекрыти , выходит из толщи образца ослабленным по сравнению с длинноволновой частью, котора  не мен - етс . В результате наблюдаемый спектр оказываетс  существенно искаженным за счет вторичного поглощени  в его коротковолновой части. Вследствие зависимости посто нной времени ФЭУ от спектрального состава флуоресценции этот эффект может вносить погрешность в измерени  т, поэтому дл  эталона должно иметь место минимальное перекрытие спектров поглощени  и испускани .

Поглощенный веществом свет флуоресценции может вновь возбуждать его молекулы , привод  к возникновению вторичной флуоресценции. Вторичное свечение также может быть поглощено веществом прежде, чем оно выйдет из исследуемого образца, что может вновь привести к возникновению флуоресценции, и т.д. Спектры флуоресценции вторичных и последующих свечений также могут быть искажены вторичным по- глощением. На опыте наблюдаетс  суммарный спектр флуоресценции всех возникших в растворе свечений, вследствие чего наблюдаетс  и суммарное врем  высвечивани , которое, во-первых, больше действительного, и, во-вторых, может значительно отличатьс  от одноэкспоненци- ального. Отсутствуют достаточно надежные методы учета указанных факторов, кроме выбора D раствора не более 0,1 - 0,5 и использовани  в качестве эталонов растворов с минимальным перекрытием спектров поглощени  и испускани ,

Выбор размеров кюветы со стандартным раствором проводитс  следующим образом . С учетом абераций приемной оптической системы, которые дл  простых оптических систем в длинноволновом участке спектра достигают 1 мм, запаса на неточность наведени  и угловую расходимость пучка флуоресценции, излучение флуоресценции редко собираетс  с площадки диаметром более 3 мм, а излучение лампы - в площадку диаметром менее 3 мм. С учетом удобства использовани  флуорометра необходим допуск на неточность наведени  оптической системы на флуоресцирующий объем. Следовательно, дл  уменьшени  веро тности сбора оптической системой возбуждающего излучени , рассе нного на входной и выходной гран х образца, при одновременном обеспечении возможности получени  максимального сигнала диаметра флуоресцирующего объема должен быть не менее 5 мм, а диаметр граней, входных и выходных дл  возбуждающего излучени , не менее 5 мм. Общеприн тым международным стандартом во флуоресцентной спектроскопии  вл етс  применение кювет размером 10x10 мм. Держател ми таких кювет снабжаютс  все приборы дл  измерений флуоресценции.

При выборе длины волны возбуждени  она должна быть наиболее близка к длине волны самой интенсивной линии источника возбуждени  и одновременно быть близкой к длине волны максимума спектра поглощени . Длина волны возбуждающего света и область флуоресценции должны быть спектрально разделены 30 - 50 нм). Это св зано с тем, что в приемник вместе с исследуемым излучением (флуоресценцией) частично попадает и рассе нный свет (входна  и выходна  грани образца, рэлеевское и комбинационное рассе ние растворител  или матрицы). Рассе нный свет уменьшает измер емое значение г по сравнению с действительным . Причем эти погрешности будут возрастать дл  веществ с малым квантовым выходом флуоресценции и дл  регистрирующих систем с высокой чувствительностью . Так, при возбуждении водных растворов сложных органических соединений светом длиной волны 365 нм (лини  спектра ртутной лампы) пик рэлеевского рассе ни  будет на длине волны 365 нм (первый пор док) и 730 нм (второй пор док решетки монохроматора), при этом будет одновременно наблюдатьс  пик комбинационного рассе ни  на длине волны 416 нм. В том случае, когда длины волн возбуждени  и люминисценции близки одна к другой, искажени  из-за рассе ни  не позвол т точно измерить т.

Рассе нный свет можно отличить от флуоресценции по степени пол ризации, т.е. его можно отсечь пол ризационными фильтраци ми. Однако такие фильтры, отлича сь сложностью, сильно снижают величину сигнала и тем самым понижают точность измерений. Дл  уменьшени  вли ни  рассе нного света регистрируют интен- сивность люминесценции через светофильтр, пропускающий длины волн, отличающиес  от длин волн возбуждени  (метод скрещенных фильтров). Однако светофильтр может неравномерно поглощать излучение в зависимости от его спектрального пропускани , что будет вызывать искажение формы спектра флуоресценции и, как следствие, искажение измер емой величины г вследствие зависимости посто нной времени ФЭУ от спектрального состава излучени . В св зи с этим дл  эталона необходимо задавать спектральный диапазон возбуждени  и регистрации. Третьим правилом при выборе длины волны возбуждени   вл етс  использование длинноволновой полосы поглощени , поскольку веро тность фотохимического разложени  образца возрастает с уменьшением длины волны возбуждени .

Таким образом, основными требовани ми к эталону т  вл ютс  следующие: возможность наблюдени  флуоресценции ортогонально направлению возбуждени ; размер входной и выходной граней дл  излучени  возбуждени  флуоресценции и грани , с которой производитс  наблюдение флуоресценции, ЮхЮмм ; в св зи с возможной необходимостью ежедневного использовани  эталон должен быть механически и фотохимически стабилен; D должна находитьс  в диапазоне 0,1 - 0,5; слабое перекрытие спектров поглощени  и флуоресценции; наличие интенсивной полосы поглощени  в диапазоне А, 300 нм; высокий квантовый выход дл  получени  уровн  сигнала, достаточного дл  проведени  точных измерений т в большом динамическом диапазоне спада интенсивности и значительно превышающего уровень рассе нного света.

Однако примен емые в известном способе жидкие стандарты вследствие старени  требуют периодического приготовлени , отличающегос  сложностью процедуры . Кроме того, предложенные стандарты имеют двухэкспоненциальное затухание, сильную зависимость времени жизни от температуры и длины волны регистрации , отсутствуют данные об их долговременной стабильности (в течение года и более).

Целью изобретени   вл етс  повышение точности калибровки системы регистрации длительности световых импульсов при одновременном упрощении процедуры калибровки .

Цель достигаетс  тем, что в качестве эталона дл  калибровки системы регистрации по форме импульса флуоресценции используют монокристаллический иттрий-алюминиевый гранат, активированный примесью цери  (Y3AlsOi2:Ce ) с концентрацией цери 

0,05 - 0,3 весовых процента и оптической плотностью 0,1 - 0,3.

Предлагаемый эталон отличаетс  от известного тем, что в нем вместо раствора применен кубический кристалл иттрий-алюминиевого граната, активированный примесью цери  с концентрацией (0,05 - 0,3)% и D 0,1 - 0,3. Поскольку использование монокристалла, в том числе кристалла иттрий-алюминиевого граната с примесью цери , в том числе с концентрацией цери  (0,05 - 0,3)% в качестве эталона времени высвечивани  не обнаружено. Известно применение кристалла иттрий-алюминиевого граната с примесью цери  в  дерной физике в качестве сцинцилл торов и сцинцилл ционных экранов с максимально достижимой концентрацией цери , котора , как правило, составл ет 1%. Однако в этом случае указанный кристалл используетс  дл  визуализации излучени  и изображений , а не в качестве эталона времени высвечивани , причем с концентрацией цери  1%.

Нафиг.1 приведена функци  высвечивани  предлагаемого эталона при концентрации цери  0,1 % и размерах кристалла 1x1x1 см3, измеренна  на приборе PRA (D 0,2). Точность измерени  времени жизни составл ла 1 % при значении т 59 не. Длина волны возбуждени  Яв 525 нм, длина волны регистрации Яр 400 нм. Наблюдение флуоресценции ортогонально к направлению возбуждени ; на фиг.2 и 3 - спектры погло- щени  и флуоресценции, измеренные на

приборе Spex. Точность измерений интенсивности в приведенных спектрах не хуже 1%, Длина волны возбуждени  при измерении спектра флуоресценции Ав 400 нм. Исследовани  зависимости формы импульса флуоресценции от концентрации цери , оптической плотности, длины кристалла вдоль направлени  возбуждени , времени и температуры проводились в течение четырех лет. Рефлектор импульсной

лампы фокусирует ее излучение в п тно с минимальным диаметром 7 мм, в св зи с чем размер граней эталона, входной и выходной дл  возбуждающего излучени , составл л 1 см. Этот размер соответствует стандартному держателю образцов, которыми снабжаютс  все флуорометры, и позвол ет с учетом неточности наведени  излучени  лампы на объект надежно охватить весь поток возбуждающего флуоресценцию излучени . Длина эталона вдоль направлени  возбуждени  0,5 - 1 см выбиралась из услови , что с учетом аберраций оптической системы и неточности ее наведени  на флуоресцирующий объем вс  апертура сбора флуоресценции должна быть заполнена излучением флуоресценции. Это требование объ сн етс  тем, что как эталон, так и исследуемый образец должны дать однотипные изображени  на фотокатоде фотоприемника. Исход  из необходимости удовлетворени  этому требованию выбиралс  и диапазон значений D эталона, кото- рый должен был соответствовать диапазону, наиболее часто используемому во флуорометрии и ограниченный значени ми D 0,1 - 0,5. Несмотр  на то, что перекрытие спектров поглощени  и флуоресценции (фиг.2 и 3) незначительно, однако при толщине кристалла 0,5 см и концентрации цери  более 0,40% (D 0,4) наблюдалось многоэкспоненциальное затухание. В св зи с этим диапазоне допустимых значений D эталона составл ет 0,1 - 0,3, что при длине эталона 1 см соответствует диапазону значений концентрации цери  0,05-0,15% при длине 0,5 см-0,1 -0,3%.

В течение четырех лет в пределах погрешности измерений прибора PRA не было обнаружено зависимости гот длины волны возбуждени  при изменении ее в диапазоне 350 - 540 нм, от длины волны регистрации при изменении ее в диапазоне 500 - 650 нм, от температуры в диапазоне ее изменений 10 - 50°С, D 0,1 - 0,3, от толщины в диапазоне 0,5 - 1 см и концентрации в диапазоне 0,1-0,3%./

П р и м е р 1. После проведени  указа- ных исследований был изготовлен эталон с размером поверхности, на которую поступает излучение возбуждени  флуоресценции , 10x10 мм при концентрации цери  0,1%. Толщина эталона равна 10 мм и выбиралась из услови , чтобы D составл ла (0,20 ± 0,01)- наиболее часто используемое значение плотности. Поверхности, через которые проходит излучение возбуждени , полировались по 14 классу с целью сведени  к минимуму уровн  рассе ни  возбуждающего излучени . Наблюдение флуоресценции проводитс  со стороны одной из боковых поверхностей перпендикул рно направлению возбуждени . Сами боковые

поверхности могут быть неполированными, поскольку интенсивности флуоресценции вследствие высокого квантового выхода достаточно дл  надежных измерений. Поскольку кристалл кубический, нет

зависимости коэффициента поглощени  от состо ни  пол ризации излучени , вследствие чего ориентаци  граней эталона относительно вектора пол ризации излучени  может быть любой. На фиг.1 в логарифмическом масштабе по шкале интенсивно- стей представлена функци  высвечивани  предлагаемого эталона.

П р и м е р 2. Второй образец имел размер 10x10x10 мм3, концентраци  цери  - 0,05%, ,1. Функци  высвечивани  дл  данного образца идентична представленной на фиг.1, услови  наблюдени  те же.

П р и м е р 3. Третий образец имел

размер 10x10x10 мм3, концентраци  цери  - 0,15%, D 0,3. Функци  высвечивани  дл  данного образца идентична представленной на фиг.1. Услови  наблюдени  те же.

Уменьшение D менее 0,1, во-первых, увеличивало врем  измерений.более чем в 2 раза по сравнению с D 0,2, во-вторых, не соответствовало диапазону значений D, наиболее часто исследуемых во флуорометрии

(что может приводить к неидентичности геометрии засветки фотокатода фотоприемника при измерени х т эталона и объекта). Увеличение D более 0,3, во-первых, приводило к неодноэкспоненциальному затуханию , во-вторых, не соответствовало диапазону значений D, наиболее часто используемых во флуорометрии; в-третьих, приводило к неоправданному расходу цери ; в-четвертых, увеличивало веро тность

возникновени  дефектов решетки.

При калибровке системы регистрации на место исследуемого объекта квазиортогонально к направлению возбуждени  полированными поверхност ми

устанавливаетс  эталон. Через центр полированных граней пропускаетс  излучение возбуждени  с длиной волны 350 - 450 нм. Квазиортогонально направлению возбуждени , через центр одной из боковых

граней проводитс  наблюдение излучени  флуоресценции системой регистрации, позвол ющей измер ть форму импульса флуоресценции в спектральном диапазоне 500 - 650 нм. Отладка и настройка системы регистрации и (или) системы цифрового расчета

импульса флуоресценции проводитс  до тех пор, пока не будет получена одноэкспонен- циальна  форма среза импульса флуоресценции с величиной посто нной времени спада интенсивности флуоресценции ве разт 59 нм,

По сравнению с известным предлагаемый эталон обладает одноэкспоненциаль- ным законом затухани  флуоресценции; высокой термической и фотохимической стабильностью; высоким квантовым выходом люминесценции, не завис щей от дли- ны волны возбуждающего света. В предлагаемом эталоне отсутствует перекрывание спектров поглощени  и люминес- ценции.

Таким образом, предлагаемый эталон, который может быть изготовлен в виде твердого образца необходимого размера, среди известных эталонов обладает наиболее вы- сокой степенью близости функции высвечи- вани  к моноэкспоненциальной при посто нстве г и спектров поглощени  и испускани  в течение не менее четырех лет и в диапазоне температур 10-50°С при неза- висимости тот длины волны возбуждени  и регистрации флуоресценции. Положение полосы поглощени  эталона совпадает с положением наиболее интенсивных линий в спектре излучени  импульсных наносекунд- ных ламп, работающих в воздухе или в азоте и  вл ющихс  основным источником возбуждени  практически во всех спектрофлу- орометрах, что позвол ет проводить,

эффективное возбуждение свечени  эталона , Полоса излучени  эталона расположена вблизи максимума спектральной чувствительности подавл ющего большинства фотоумножителей , вследствие чего имеет место высокий уровень сигнала, необходимый дл  измерений длительности светового импульса в широком диапазоне изменений интенсивности. Кроме того, высока  степень спектрального разделени  спектра поглощени  и флуоресценции обеспечивает возможность надежной спектральной фильтрации излучени  флуоресценции от излучени  лампы и тем самым повышение точности измерений (наличие в сигнале рассе нных фотонов импульса лампы уменьшает измер емое г по сравнению с действительным). Эталон удобен в обращении и обладает большим сроком службы, поскольку  вл етс  кристаллом.

Claims (2)

1. Формула изобретени 

   Эталон дл  калибровки спектрофлуоро- метра по форме импульса флуоресценции, отличающийс  тем, что, с целью повышени  точности калибровки при одновременном упрощении процедуры калибровки , в качестве эталона используют монокристаллический иттрий-алюминиевый гранат, активированный церием (Y2AlsOi-2:Ce ) с концентрацией цери  0,05 - 0,3 весовых процента и оптической плотностью 0,1 - 0,3.

   СТАНДАРТНО отклонение

   -7%

   А

   ю

   б

   о 1 «

   Зюв

   I

   i

   ю

   2.ОО400
2. ЬРЕНЯ, НС

   Риг. 1

   .о7г±о..

   о

   еоо

   4.О

   Л

   8 -7

   .С

   P

   2 .v Ј

   г .3

   1 л

   л

   2ОО

   ЗОО ДАИИА ВОЛКИ, ИМ

   Фиг.2

   f-О

   9 -7

   -6

   -8

   -3

   .г

   Л

   SOO

   55

   4 DO

   50С

   «ю

   оо