SU1711080A1 - Способ получени твердофазного носител дл иммунохимического анализа - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к,медицине, а именно к иммунохимии. Целью изобретени   вл етс  упрощение способа. Способ осуществл етс  посредством обработки полимерной матрицы метанолом или диметилсульфоксидом при комнатной температуре в течение 24-48 ч. 2 ил.

Description

Изобретение относитс  к медицине, а именно к иммунохимии.

Целью изобретени   вл етс  упрощение способа.

Прим ер 1. Полимерные шарики из полистирола помещают в 150 мл растворител  (диметилсульфоксид) и выдерживают 48 ч при 20°С. Затем шарики отфильтровывают и остатки растворител  удал ют.

Применение твердофазного носител .

На фиг. 1 показана проверка твердофазных носителей с адсорбированным белком в радиоиммунологическом тесте: крива  1 - полистирольные носители, необработанные растворителем; крива  2 - обработанные диметилсульфоксидом.Используют твердофазные носители с поверхностью 0,90-0,95 см2 без обработки и обработанные диметилсульфоксидом. В качестве белка дл  адсорбции используют ферритин селезенки человека. Адсорбцию белка провод т в 0,01 М натрийфосфатном буфере (рН 7,2) с последующей промывкой этим же буфером, содержащим 0,1% Твин- 20. Твердофазные носители с адсорбированным ферритином инкубируют в растворе 0.05 М натрий фосфатного буфера (рН 7,4) с

1% бычьего сывороточного альбумина и 0,15 М №С1, содержащем различные концентрации антител к ферритину, меченных йодом-125. Фракци  J-антител имеет удельную активность 5 мкКи/мкг (185 ГБк/г) и радиохимическую чистоту 92%. Инкубацию продолжают 3 ч при комнатной температуре при посто нном перемешиваний. Затем раствор удал ют отсасыванием, и твердофазные носители промывают дистиллированной водой, после чего измер ют ра- диактивность твердофазных носителей с адсорбированным ферритином.

Как следует из представленных данных на фиг. 1, величина сигнала.св зывани  в 2-3 раза ниже и наклон кривой доза-эффект значительно меньше при использовании носителей , полученных контрольным способом , что не позвол ет точно дискриминировать близкие концентрации определ емого вещества.

На фиг. 2 показана проверка твердофазных носителей с адсорбированным белком в двухцентровом иммуноферментном тесте: крива  1 - полистирольные носители необработанные растворителем; крива  2 - обработанные диметилсульфоксидом.

сл С

о

00

о

Используют твердофазные носители с поверхностью 0,90-0,95 см , обработанные диметилсульфоксидом. В качестве белка дл  адсорбции примен т антисыворотку барана против иммуноглобулинов G кролика. Адсорбцию белка провод т по вышеуказанному . Твердофазные носители с адсорбированным белком инкубируют в растворе 0,05 М нэтрийфосфатного буфера (рН 7,4) с 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,15 М NaCI содержащем различные концентрации иммуноглобулинов G кролика (Calbiochem) и конъюгат аффинно очищенных ослиных антител к JgG кролика с перок- сидазой хрена в конечной концентрации 10 М. После инкубации в течение 4 ч при комнатной температуре и посто нном перемешивании раствор удал ют отсасыванием, а твердофазные носители промывают дистиллированной водой. Затем к ним добавл ют раствор 0,1 М натрийфосфатного буфера (рН 5,9), содержащий 4х10 4 М тетраметил- бензидина (Serva) и ЮМ пербората натри . После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре и посто нном перемешивании реакцию останавливают удалением твердофазного носител  и измер ют оптическую плотность раствора при длине волны 655 нм.

Как следует из представленных данных на.фиг. 2, носители, полученные предлагаемым способом, дают увеличение чувствительности анализа (снижение минимальной определ емой концентрации) в 2,6-15,8 раз (см. таблицу 2).

При м е р 2. Полистирольные шарики обрабатывают 24 ч при комнатной температуре в метаноле по примеру 1 и помещают в пробирки дл  анализа. На полистироль- ные шарики нанос т антитела к ферритину по примеру 1. Затем добавл ют 0,3 мл раствора , содержащего ферритин в концентраци х от 4 до 250 мкг/л (калибровочные пробы ) либо контрольные сыворотки с известным содержанием ферритина и инкубируют 3 ч при комнатной температуре и вертикальном встр хивании. Супернатант удал ют, шарики промывают дистиллированной водой и добавл ют 0,3 мл раствора, содержащего меченные йодом-125 антитела

к ферритину. После встр хивани  в течение 3 ч при комнатной температуре супернатант удал ют, промывают шарики дистиллированной водбй и измер ют активность св занных с поверхностью шариков 125-йодантител на гамма-счетчике. Результаты обрабатывают в координатах В/Т -1 (концентраци  антигена). Точность анализа характеризуют, вычисл   коэффициент вариации результатов многократных измерений одной и той же пробы (контрольной сыворотки или калибровочной пробы).

Полученные коэффициенты вариации наход тс  в пределах 2,8-6,3% дл  калибровочных проб и 3,6-8,5 % дл  контрольных

сывороток, что свидетельствует о соответствии параметров точности анализа современным требовани м.

Способ более прост, т.к. позвол ет избежать гамма-облучени  носител .

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ получени  твердофазного носител  дл  иммунохимического анализа, включающий стадию обработки поверхности

   синтетического органического полимера. отличающийс  тем, что, с целью упрощени  способа, поверхность полимера подвергают обработке метанолом или диметилсульфоксидом при комнатной температуре в течение 24-48 ч.

   Минимальна  определ ема  концентраци  (чувствительность) в двухцентровом иммуноферментом анализе (в нг/мл)

   -э BxlO , cpm

   0.35

   0.30

   0.0

   0.5

   Ig Ab, нг в пробе

   2.02.5

   Ig , нг/мл