SU1707624A1 - Способ определени антилизоцимной активности штаммов менингококка - Google Patents
Способ определени антилизоцимной активности штаммов менингококка Download PDFInfo
- Publication number
- SU1707624A1 SU1707624A1 SU894733637A SU4733637A SU1707624A1 SU 1707624 A1 SU1707624 A1 SU 1707624A1 SU 894733637 A SU894733637 A SU 894733637A SU 4733637 A SU4733637 A SU 4733637A SU 1707624 A1 SU1707624 A1 SU 1707624A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- lysozyme
- strains
- activity
- concentration
- enzyme
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к медицине, а именно к медицинской микробиологии. Цель изобретени - упрощение способа, поИзобретение относитс к области медицины , а именно к медицинской микробиологии . Лизоцим обладает способностью подавл ть рост многих бактерий. Поэтому штаммы микроорганизмов, которые ингиби- руют данный фермент, получают существенное преимущество в межвидовой конкуренции. Они лучше выживают и при внутриклеточной локализации. Переваривание антилизоцимных штаммов в фагоцитах протекает во много раз медленнее, чем клеток , не обладающих активностью в отношевышение чувствительности и ускорение определени активности. Способ заключаетс в приготовлении взвесей изучаемых штаммов мэнингскокков с концентрацией 5.0- 10,0 млрд, микробных клеток на 1 мл раствора лизоцима. внесении их в грздпент концентрации лизоцима, инкубировании 30-60 мин смеси с последующим определением остаточного лизоцима и засевом в лунки гельбзктериальной полиакриламидней среды, включающей т е с т - -- у л ь т у р у Micrococcus Lysodekticus. Причем градиент концентрации фермента готсе т из расчета 0.25. 05 и 1.0 . Способ позвол ет с ei- сокой слеленью -сч.гс определить способность штаммов инг/Ьиро- t т ь фермент в услови х, близка к внутриклеточному паразитироззкньг1 микроорганизмов , в 12-15 раз сократить сроки исследовани и значи ельно упростить и удешевить метод определени зчти- лизоцимчой активности с..ежевыделемных штаммов менингококка. 5 табл. (Л С нии Фермента. Кроме того, микроорганизмы с указанными свойствами способны к внутриклеточному размножению. Менингококки относитс к внутриклеточным паразитам и обладают антнлизо- цимнсй активностью (АЛА). Широкий диапазон значений АЛА характерен дл различных штаммов и даже клонов попул ции. Наличие этого фактора расцениваетс как один из возможных показателей патогенно- сти микроорганизмов, который может быть использован при эпидемиологической характеристике штаммов. vj О vj О ГО
Description
Известны различные модификации одного способа определени антилизоцимной активности штаммов менингококка - определение АЛА на плотных питательных средах , содержащих - определенные концентрации кристаллического лизоцима.
Недостатками данного способа вл ютс сложность постановки опыта, недостаточна чувствительность теста и длительность исследовани .
Наиболее близким у предлагаемому в- л тес метод, основанный на создании градиента концентрации лизоцима на одной чашке с плотной питательной средой. В чашку Петри внос т 20 мл расплавленного агара и став т в наклонное положение дл получени скошенного агара. После засты- зэни среды чашку кладут строго горизонтальное положение и заливают 20 мл 20%-ного сывороточного агара с лизоцимом в максимальной исследуемой концентрации 20-30 мкг/мл. После охлаждени образуетс среда, имеюща градиент концентрации лизоцима. На поверхность агара стандартной петлей (d 3 мм) наноситс непрерывной полосой по направлению градиента концентрации лизоцима взвесь исследуемой 18-24-часовой культуры менингококка (109 КОЕ/мл).
Через 18-24 ч инкубации в термостате при 37°С культура обрабатываетс парами хлороформа и заливаетс 0.1 мл взвеси индикаторного штамма микрококка (10 К СЕ /мл) в 4 мл 0.7 % -ного питательного агара . Чашки вновь-помещают в термостат при 37°С. Учет результатов провод т по наличию роста M.lysodeikticus вдолк полосы исследуемой культуры. За уровень антилизоцимной активности принимают максимальное значение концентрации фермента , при которой еще отмечаетс рост M . - .рококка.
Недостатком указанного метода вл етс тс. что он не позвол ет изучить энтили- зоиимную активность штаммов в жидких средах, т.е. в услови х, близких к развитию менингококков в биологических жидкост х, в том числе, внутриклеточного паоззитиро- вани . Кроме того, постановка опыта довольно сложна , требует значительного расходовани питательной среды и сопр жена с длительностью исследований (не менее 48 ч). Указанна методика определени АЛА может давать существенные отклонени в результатах, св занных с различным числом жизнеспособных клеток во взвеси, вз той дл посева менингококка на агаровую среду, и неодинаковой скоростью его размножени , что затрудн ет стандартизацию условий постановки данного теста.
Целью изобретени вл етс упрощение способа, повышение чувствительности и ускорение определени .
Цель достигаетс путем приготовлени
взвесей культур изучаемых штаммов менингококка в жидкой среде, содержащей различные концентрации лизоцима, инкубировэни смесей в течение определенного времени при 37°С, определени в
0 .них содержани остаточного лизоцима с использованием высокочувствительной поли- акриламидной среды, с последующим вычислением инактивированных штаммов доз фермента. За уровень антилизоцимной
5 активности принимают максимальную концентрацию лизоцима, полностью анактиви- рованную взвесью менингококка, Применение полиакриламидной среды позвол ет вы вить концентрации фермента
0 (менее 1 мкг/мл), которые известным способом не могут быть обнаружены, и сократить сроки исследовани до 2-4 ч вместо 48 ч.
Параметры постановки теста - концентрации культур менингококка и растворов
5 лизоцима. врем инкубации, критерии оценки активности штаммов по антилизоцимно- му признаку, определены следующим образом.
В опыт брали суспензию культуры ме0 нингококка (эталонный штамм № 0646) различной концентрации от 1 до 15 млрд микробных клеток на 1 мл дистиллированной воды. Полученные данные (табл.1) свидетельствуют , что одномиллиардна взвесь
5 не подавл ла в течение 1 ч лизоцимную активность в стандартных растворах. Увеличение концентрации менингококка до 2.5 млрд клеток в 1 мл суспензии позволило во всех случа х ингибировать 0.1-0.25 мкг/мл
0 лизоцима. Угнетение фермента в дозе 0.5 мкг/мл наблюдалось лишь в отдельных случа х . Содержание микробных клеток в пределах 5-10 млрд/мл давало посто нные результаты, во всех стандартных растворах
5 с концентрацией лизоцима 0,1-1,0 мкг/мл в течение 1 ч было отмечено ингибирование фермента.
Более высокое содержание микробных клеток (15 млрд/мл) в смеси подавл ло активность Фермента в-диапазоне 0,1-2,0
0 мкг/мл, однако повтор емость результатов наблюдалась лишь при исследовании растворов , содержащих 0.1-1.0 мкг/мл фермента . Исследование образцов с концентрацией лизоцима 2.0 мкг/мл позво5 лило вы вить ан,тилизоцимную активность менингококка только в отдельных опытах. Отсутствие стабильности результатов при использовании двух с половиной и п тнэд- цатимиллиардной микробной взвеси в растворах 0,5 и 2,0 мкг/мл лиэоцима соответственно вилось основной причиной дл ограничени минимальных и максимальных значений концентрации менингококка 5-10 млрд микробных клеток в одном миллилитре смеси.
Чувствительность тесте обусловлена также длительностью инкубации культуры менингококка с лизоцимом. Соответствующие данные представлены в табл.2. Как вид- но из полученных данных табл.2, п тнадцатиминутна экспозици оказалась недостаточной дл про влени антилизо- цимной активности менингококка. Ингиби- рование лизирующего действи фермента в концентрации 0,1-1.0 мкг/мл во всех опытах наступало в теиение 30-60 мин, поэтому увеличение времен экспозиции более 1 ч нецелесообразно. В контрольных образцах, не содержацих культуры менингококка, активность раствора лизоцима в течение 1 ч не измен лась.
Применение стандартных растворов лизоцима позвол ет значительно сократить сроки определени антилизоцимной активности штаммов Благодар учету результатов по времени по влени начальной зоны ли- эисо тест-культуры о гельбактериэльной среде Без использовани калибровочной кривой. Как показало экспериментальное изучение много-испенных контрольных образцов растворгэ лизсцима с концентрацией 0,25-- 1.0 мкг/мл на полизкриламидной гельбактериэль-о, среде, примен емой в данном способе, временные параметры их, лизирующею эффекта всегда находились в пределах от 30 мин до 2 Параметры уроьи-;й г, тилизоцимной активности по предлагаемому способу определены на 25 ит зммах менингококка. Все вз тые в опыт к/г,ьтуры предварительно изучались с псмсгщыс известного теста и были сгруппированы по способности инак- тивировать различные концентрации фермента следующим образом. 7 штаммов с низкой АЛ А (и на т и веровал и 1-5 мкг/мл лизоцима ), 8 штэммсв со средней АЛА {6-10 мкг/мл) и 10 штаммов с высокой АЛА(инак- тивировали 10 мкг/мл и более).
Результаты изучени антилизоцимной активности этих штаммов по предлагаемо-. му способу представлены в табл.З.
Как следует из табл.З, концентраци инактивированного лизоцима пр мо коррелировала с уровне АЛА штаммов менингококка , определенной известным способом. Полученные сравнительные данные свидетельствуют также о том,что характеристику штаммов можно проводить с помощью трех контрольных растворов лизоцима с концентрацией 0,25; 0,5 и 1 мкг/мл и сценипэть полученные результаты следующим обрэ- зом: при инактивации 0.25 мкг/мл лизоцимз штаммы менингококка считать низкозкгив- ными; при 0,5 мкг/мл - среднеактивными и
при 1 мкг/мл - высокоактивными антилизо- цимному признаку.
Продолжительность исследований на полиакриламидной гельбактериэльном среде в опытных образцах представлена в
0 тэбл.4.
Обнаружение в течение 2 ч лизирующего эффекта смесей культуры менингококка и лизоцима при концентраци х последнего 0,5 и 1,0 мкг/мл указывает на низкую спо5 собность штаммов ингибировать фермент. Наличие зон лизиса в указанный промежуток времени при исследовании образцов, содержащих только 1 мкг/мл лизоцима. характеризует среднюю активность штамма, а
0 отрицательные результаты при исследовании всех растворов - сысокую антилизоцим- ную активность культур менингококка.
Таким образом, дл определени АЛА штаммов менингококка целесообразно ис5 пользовать водную суспензию исследуемого штамма, содержащую 5,0-10,0 млрд микробных клеток нз 1 M;I рэствсра лизсцима (концентрации 0,25. 0.5 и .0 мкг/мл), инкубироэать смесь в течение 30-60 мин
0 при 37°С, после чого с предел ть количество ингибирпвзниого фегмечта с помощью по- лиакрплгми,1 ой ге. ь озктс-ризльисй среды в течение не более Г ч.
Способ осуществл емс :..гедуО1:;им сб5 разсм.
Суточную культуру меничгск.0- 3 смы- сзютдистиллированной физиологическим растворе с рН 6,2 и готов т густую взвесь, соответствующую густоте
3 50-100 млрд/мл по оптическому ст.дарту плотности ГИСК им.Тарасевича. ГСТОБЯТ растворы с различной концентрацией /изо- цима (0,25; 0,5 и 1,0 мчг/мл) и рззлисэют в пробирки по 1 мл (по 2 пробирки на каждую
5 концентрацию лизоцима). В каждую опытную пробирку вносит микробную взвесь из расчета 5.0-10.0 млрд/мл и инкусируют при температуре 37°С в течение 30- мин. Контролем вл ютс стандартные
0 раствори лизоцима без бактериальной культуры. Затем содержимое каждой пробирки (опытной и контрольной) внос т в за- ранееприготовленные лунки гельбзктериальной среды и инкубируют в
5 течение 2 ч при 37°С. Результаты учитывают визуально по по влению зон лизиса или по их отсутствию вокруг лунок с исследуемой микробной суспензией. Определ ют какие максимальные дозы фермента ингибированы . Штаммы менингококка считают низкоактивными по антилизоцимному признаку, если они подавл ют действие лизоцима только при концентрации последнего 0,25 мкг/мл; среднеактивными - 0.25 и 0,5 мкг/мл- высокоактивными - 0.25; 0,5 и 1,0 мкг/мл.
П р и м е р 1. Выросшую в чашке Петри суточную культуру менингококка смывают двум миллилитрами дистиллированной воды . С помощью оптического стандарта мутности определ ют густоту взвеси и довод т ее до мутности, соответствующей 50 млрд микробных клеток в 1 мл.
Готов т стандартные растворы кристаллического лизоцима дл чего раствор ют 10 мг лизоцима в 50 мл дистиллированной воды (конечна концентрации 200 мкг/мл), затем 2 мп данного растпсра соедин ют с 48 мл дистиллированной воды (концентраци 8 м .г/мл). Эти pac. можно , ранит ь при температуре 4- Г;°С Е течение 30 и 6 дней ссотг.ет те-знно.
Из последнего рззседени гогсвчт ех .еглрогае рабочий рзствор. г.сдерж.ащий 1 мкг/мл лизоцима. Дл этого к 0.5 мл раствора , содержащего 8 МХ-/УЛ фермента, добавл ют 3,5 МЛ Д1Н1ТИЛГ .фСВйННСЙ БОДь1.
Дг: получен; ч ; агтворп с белее низкой концентрацией лизоцима смешивают 0,5 мл рабочего раствора лизоцимэ с 1.5 мт дистиллированной ecr.bi (кснц- ктс.чци 0.25 м-г. мл). 1 мл p.c-o-iero рэстегрэ - с 1 мл воды концентра:. 0.5 мкг/мл)
Кзхдый и пон отсЕленчых р створов лизоцима. содержащих 0,25; 0,5 и 1 мкг/мл фермента, внос т по 0.9 мл в дое прсб. -рки. В пеовый р д добавл ют по 0,1 мл 50 млрд микробной взвеси изучаемого штамма менингококка , второй бг рут в качестве кснтрс- л Все пробирки, инкубируют в течение 30 мин при 37°С, затем исслед1- ют нз лизоцим- ную активность с ислопг-зоь змием гельбак- теризльной среды. Гельбактернальна среда готовилась из реакционной смеси, содержащей 5 г акрилзмида; 0,2 N.N -ме- тилен-бис-акриламидз; 0.3 мл N.N.N .N -тет- раметилэтилендиамина; 0.12 г кали персульфата и 0,1-15 г тест-культуры M.lysodelkticus в 90 мл буферного раствора с рН 6,2.
Стекла с внесенными в лунки образцами растворов и смесей инкубируют при в течение 2 ч. Учет результатов, про вившихс на гельбактериэльнсй среде, показал , что опытные образцы, содержащие лизоцим в концентрации 0,25; 0.5 и 1 мкг/мл, не вызывали лизиса микрококка. тогда как соответствующие контрольные растворы его лизировзли в течение 2 ч инкубации , таким образом, изучаема культура менингококка способна ингибировать лизоцим в максимальной дозе 1.0 мкг/мл, т.е. вл етс высокоактивной по антилизоцимному признаку. При определении известным способом штамм инактивировал 15 мкг/мл лизоцима.
П р и м е р 2. Изучали уровень антилизо- цимной активности свежевыделенного из
0 спинномозговой жидкости больного гнойным менингитом штамма манингококка. Готовили 100 млрд взвеси суточной культуры и растворы лизоцима той же концентрации 0,25; 0,5 и 1,0 мкг/мл. Все последующие
5 операции проводили способом, описанным в примере 1. Врем инкубации взвесей 60 мин.
Опытные образцы взвеси менингококка , содержащие лизоцим в концентрации
0 0.25 и 0,5 мкг/мл, лизиса тест-культуры не вызывали, а с 1.0 мкг/мл дали хорошую видимую зону лизиса уже через 40 мин инкубации в термостате. Изучаемый штамм менингококка вл етс среднеактивным по
5 антилизоцимному признаку, так как максимально он способен инактивировать 0,5 мкг/мл лизоцима. При определении АЛА известным способом данный штамм инакти- вировал 6 мкг/мл лизоцима. При изучении
0 предлагаемым способом 28 носоглоточных штаммов микроорганизмов, выделенных от 19 общавшихс с больным лиц в очаге менингококковой инфекции, было установлено , что 5 культур оказались высокозк5 тивными (инактивировали 1 мкг/мл лизоцима}, 14 - среднеактивными (инактивировали 0,5 мкг/мл фермента), а 9 всвсе не обладали антипиэоцимнои активностью. Результаты при этом были получены в
0 течение 4 ч от начала исследовани со значительно меньшей затратой рабочего времени и питательных сред.
Сравнительные данные применени предлагаемого и известного способов сви5 детельстэуют о том, что определение АЛА штаммов менингококка с жидкой среде имеет р д существенных преимуществ (табл.5). По предлагаемому способу используетс небольшое количество сред, себестои0 мость которых значительно ниже примен емых в известном тесте. В качестве объекта исследовани вместо растущей культуры примен ют микробную взвесь, что позвол ет стандартизовать методику опре5 делени антилизоцимной активности штаммов .
Изучение знтилизоцимной активности штаммов менингококка в жидкой среде с использованием раствора лизоцима и чувствительной гельбактериаг.ьной среды позаолчет определить способность штаммов ин- гибировать фермент в услови х, близких к таковым при внутриклеточном пэразитиро- вании микроорганизмов,сократить а 12-15 раз врем исследовани и значительно упростить способ определени АЛА.
Claims (1)
- Формула изобретени Способ определени антилизоцимной активности штаммов менингококка, предусматривающий приготовление взвеси менингококка в жидкой среде, внесение ее в градиент концентрации лизоцима, инкуои- рование с последующей оценкой антилизо0цимной активности по характеру роста тест- культуры Micrococcus Lysodekticus. отличающийс тем, что. с целью упрощени способа, повышени чувствительности и ускорени определени , концентрацию взвеси менингококка устанавливают равной 5.0-10,0 млрд микробных клеток на 1 мл раствора лизоцима. градиент концентраций фермента готов т из расчета 0,25; 0.5 и 1.0 мкг/мл раздельно, полученную взвесь инкубируют в течение 30-60 мин. а затем внос т ее в лунки гельбэктериальной толиакрила- мидной среды, включающей тест-культуру.Таблица 120Таблица 2Примечание. - - отсутствие лизирующего эффекта. + - наблюдаетс лизирующий эффект.Таблица 3Таблица 4Таблица 5
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU894733637A SU1707624A1 (ru) | 1989-08-29 | 1989-08-29 | Способ определени антилизоцимной активности штаммов менингококка |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU894733637A SU1707624A1 (ru) | 1989-08-29 | 1989-08-29 | Способ определени антилизоцимной активности штаммов менингококка |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU1707624A1 true SU1707624A1 (ru) | 1992-01-23 |
Family
ID=21467965
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU894733637A SU1707624A1 (ru) | 1989-08-29 | 1989-08-29 | Способ определени антилизоцимной активности штаммов менингококка |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
SU (1) | SU1707624A1 (ru) |
-
1989
- 1989-08-29 SU SU894733637A patent/SU1707624A1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Борисов С.Д. Антилизоцимнэ активность менингококков и ее применение в диагностике менингококковой инфекции. Автореф.канд.мед. Чел бинск, 1988, с.19. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Loomis Jr et al. | Glucose-lactose diauxie in Escherichia coli | |
Hugo et al. | A quantitative and qualitative study of the lipolytic activity of single strains of seven bacterial species | |
Avery et al. | The use of the final Hydrogen ion concentration in differentiation of Streptococcus haemolyticus of human and bovine types | |
Hipp et al. | Inhibition of Neisseria gonorrhoeae by a factor produced by Candida albicans | |
Alexander et al. | Mode of action of streptomycin on type b Hemophilus influenzae: II. Nature of resistant variants | |
US4923801A (en) | Compositions and methods for the enrichment and isolation of Campylobacter pylori and related organisms from biological specimens and the environment | |
Bauer et al. | The determination of sulfonamide susceptibility of bacteria | |
US6228606B1 (en) | Culture medium for detecting pathogenic bacteria of the genus Listeria and method for identifying said bacteria | |
Chang | Studies on Entamoeba histolytica: IV. The relation of oxidation-reduction potentials to the growth, encystation and excystation of Entamoeba histolytica in culture | |
SU1707624A1 (ru) | Способ определени антилизоцимной активности штаммов менингококка | |
Steinberg et al. | Temperature-sensitive mutants of Mycoplasma pneumoniae. I. In vitro biologic properties | |
Humphreys | Formation of acrolein from glycerol by B. welchii | |
King et al. | Induction of enterococcal L-forms by the action of lysozyme | |
Cremers et al. | Sym plasmid and chromosomal gene products of Rhizobium trifolii elicit developmental responses on various legume roots | |
Dietrich et al. | Effect of shaking speed on the secretion of enterotoxin B by Staphylococcus aureus | |
Smith | The Leeuwenhoek Lecture, 1991. The influence of the host on microbes that cause disease | |
Barbaree et al. | Tolerance of Legionella species to sodium chloride | |
RU2707640C1 (ru) | Штамм бактерий escherichia coli в качестве контрольного тест-штамма для фенотипических и молекулярных исследований эшерихий серологической группы о144 | |
US3278393A (en) | Selective culture medium for microorganisms and use thereof | |
Pace et al. | Measurement of free intracellular calcium levels in epithelial cells as consequence of bacterial invasion | |
Harinasuta et al. | Studies on the growth in vitro of strains of Entamoeba histolytica | |
Berk | Effect of antibacterial agents on the autoplaque phenomenon of Pseudomonas aeruginosa | |
SU1604846A1 (ru) | Штамм бактерий SтRертососсUS FаесIUм, используемый в качестве эталона дл оценки активности микробов-антагонистов менингококка | |
Nayak et al. | A simple alternative method for rapid detection of slime produced by Staphylococcus epidermidis isolates in bacterial keratitis | |
RU2121506C1 (ru) | Способ определения гемолитической активности bacillus anthracis |