SU1666531A1

SU1666531A1 - Strain of hybridous cultured mammalian cells, mus musculus l, producing monoclonal antibodies for dlycoprotein e (v3) of vernalencepha-litis virus

Info

Publication number: SU1666531A1
Application number: SU894674770A
Authority: SU
Inventors: Семен Николаевич Атанадзе; Владимир Иванович Новиков; Семен Григорьевич Рубин; Игорь Викторович Красильников; Ирина Александровна Николаева; Игорь Георгиевич Сидорович
Original assignee: Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР; Институт иммунологии
Priority date: 1989-04-10
Filing date: 1989-04-10
Publication date: 1991-07-30

Abstract

Изобретение относитс к гибридомной технологии и может быть использовано дл аффинной очистки гликопротеина E(V3) вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). Цель изобретени - получение штамма гибридомы, продуцирующей низкоавидные моноклональные антитела (монАТ) к ВКЭ. Штамм получают гибридизацией клеток миеломы X63.AG8.653 с клетками селезенки мышей BALB/C, иммунизированных очищенным антигеном. Штамм культивируют в суспензионно-монослойной культуре в среде RPM I 1640 с 15% сыворотки эмбриона коровы, 2 MML - глутамина, 50 мкг/мм гентамицина, а также в брюшной полости сингенных мышей. Специфичность монАТ определ ют методом твердофазного иммуноферментного анализа на том же антигене. Кроме того, монАТ активны в реакции торможени гемагглютинации. МонАТ не вы вл ютс в реакци х св зывани комплемента, преципитации в агаре и нейтрализации. Константа св зывани с дрЕ равна 6,4 ^. 10^-6 М. МонАТ принадлежит к классу 1 GGI. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N282D.The invention relates to hybridoma technology and can be used for affinity purification of the tick-borne encephalitis virus glycoprotein E (V3). The purpose of the invention is to obtain a hybridoma strain producing low-avid monoclonal antibodies (monAT) for tick-borne encephalitis. Strain receive hybridization of myeloma cells X63.AG8.653 with cells of the spleen of BALB / C mice immunized with purified antigen. The strain is cultivated in a suspension-monolayer culture in RPM I 1640 medium with 15% bovine fetal serum, 2 MML - glutamine, 50 μg / mm gentamicin, and also in the abdominal cavity of syngeneic mice. The specificity of monAT is determined by an enzyme-linked immunosorbent assay on the same antigen. In addition, monat is active in the haemagglutination inhibition reaction. MonAT is not detected in complement fixation, agar precipitation and neutralization reactions. The coupling constant with others is 6.4 ^. 10 ^-6 M. MonAT belongs to class 1 GGI. The strain deposited under the number VSKK (P) N282D.

Description

1one

(21)4674770/13(21) 4674770/13

(22)10с04с89(22) 10s04s89

(46) 30.07.91„ БюЛо № 28(46) 07.30.91 “BuLo number 28

(71)Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АНН СССР и Институт иммунологии(71) Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitis of the USSR Academy of Sciences and the Institute of Immunology

(72)С.Н.Атанадзе, В„И,Новиков, с Рубин, ИоВоКрасильников, И,АсНиколаева и ИоГоСидорович(72) S.N.Atanadze, VNI, Novikov, with Rubin, IoVoKrasilnikov, I, AsNikolaeva and IoGoSidorovich

(53)678 о085о 23(088 о8)(53) 678 o085o 23 (088 o8)

(56)Heing F.X., Berger R0, Majdie 0. е.а„ - Infect. Ironunolc, 1982, 37, 784 - 869.(56) Heing F.X., Berger R0, Majdie 0. e.a „- Infect. Ironunolc, 1982, 37, 784-869.

(54)ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЪТИВИРУЕгЕЫХ КЩТОК ЖИВОТНЫХ MUS, MUSCULUS L. - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ПЖКОПРОТЕИНУ Е (V 3) ВИРУСА КЛЕЩЕВОг- IX) ЭНЦЕФАЛИТА(54) MUS, MUSCULUS L. HYBRID CULTIVATED ANIMAL STRAIN STRAIN - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO PJKOPROTEIN E (V 3) VARUS-TICK-IX) VIRUS CELL

(57)Изобретение относитс к гибри - домной технологии и может быть пользовано дл аффинной очистки копротеина Е (V 3) вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). Цель изобретени «получение штамма гибридомы, проду цирующей низкоавидные моноклональные антитела (монАТ) к ВКЭс Штамм получают гибридизацией клеток миеломы X63oAg8c653 с клетками селезенки мьг шей Balb/c, иммунизированных очищен - ным антигеномо Штамм культивируют в суспензионно-монослойной культуре в среде RPM I 1640 с 15% сыворотки эмбриона коровы, 2 mM L-глутамина, 50 мкг/мм гентамиц 1на,а также в брили - ной полости сингенных мышей. Специ - фичность монАТ определ ют методом твердофазного иммуноферментного ана лиза на том ке антигенес Кроме тогоэ монАТ активны в реакции торможени гемагглютинации,, МонАТ не вы вл ютс в реакци х св зывани комплемента, преципитации в агаре и нейтрализации Константа св зывани с дрЕ равна 6, М„ МонАТ принадлежат к су JgG1c Штамм депонирован под номером ВСКК(П) № 282 Do(57) The invention relates to hybridoma technology and can be used for affinity purification of tick-borne encephalitis virus (VIK) coprotein E (V 3). The purpose of the invention is to obtain a hybridoma strain producing low-avid monoclonal antibodies (monAT) to VKE Strain, which is obtained by hybridization of X63oAg8c653 myeloma cells with spleen cells of the Balb / c neck, immunized with purified antigenome, the Strain is cultured into mono monosaccharide suspension in a mono-monosaccharide monosaccin, which is inoculated with mono anti-monoclonal cells that are immunized with monoclonal antibiotics. 15% bovine fetal serum, 2 mM L-glutamine, 50 µg / mm gentamic 1a, as well as in the shaved cavity of syngeneic mice. The specificity of monAT is determined by the method of enzyme-linked immunosorbent assay on the antigenes. In addition, monAT is active in the haemagglutination inhibition reaction, MonAT is not detected in the reactions of complement fixation, precipitation in agar and neutralization. The binding constant with others is 6, M „MonAT belong to su JgG1c Strain deposited under the number VSKK (P) № 282 Do

§§

Изобретение относитс к гибридом- ной технологии и может быть исполь- зовано дл аффинной очистки глико- протеина Е (v3) вируса клещевого энцефалита (ВКЭ).The invention relates to hybridoma technology and can be used for affinity purification of glycoprotein E (v3) tick-borne encephalitis virus (VIK).

Цель изобретени - получение штамма гибридомы, продуцирующей низ- коавидные моноклональные антитела монАТ к ВКЭсThe purpose of the invention is to obtain a hybridoma strain producing low avoid monoclonal antibodies to antibacterial vitamins.

Штамм V ВСКК (II) 283 D получают следующим образом.Strain V VSKK (II) 283 D was obtained as follows.

Клетки миеломы РЗ.Х63.Ag80653 сливают со спленоцитами мыщей линииMyeloma cells RZ.H63.Ag80653 merge with the splenocytes of the murine line

Balb/c, иммомучнзированных гликс- протеином Е вируса КЭ западного типа (штамм 256) , Иммунизацию мышей прово - д т 4-кратно с недельными интервалами (первична иммунизаци 5 мкг белка с полным адъювантом Фрейнда внутрибркк- шинно, посшедук ще - те же дозы белка на физиологическом растворе)„Balb / c, immunized with glyx protein E of Western type CE virus (strain 256), Immunization of mice was carried out 4 times at weekly intervals (primary immunization with 5 µg of protein with Freund's complete adjuvant intrabranchine, followed by similar doses protein on physiological solution) „

Сливающим агентом служит 50%-ный раствор полиэтиленгликол (ПЭГ) с мо лекул рной массой 6000. К осадку ток, содержащему 10-10 клеток миело мы и клеток селезенки мышей,A 50% solution of polyethylene glycol (PEG) with a molecular mass of 6000 serves as a discharging agent. A current containing 10-10 cells of myeloma and mouse spleen cells

31663166

выделенных на 4 сутки после последней иммунизации белком Е, добавл ют 1 мл 50%-ного раствора ПЭГа„ После легкого перемешивани в течение 1 мин к клётг- кам с ПЭГом добавл ют обычную культу ральную среду без сыворотки, довод конечный объем до 10 мл в течение 5 мин при посто нном перемешивании,, Затем клетки отмывают низкоскорост- ным центрифугированием в течение 5 миноisolated on day 4 after the last immunization with protein E, add 1 ml of a 50% PEGa solution. After light stirring for 1 min, the usual culture medium without serum is added to the PEG cells, bringing the final volume to 10 ml in for 5 minutes with constant stirring, the cells are then washed by low-speed centrifugation for 5 min

Осадок развод т средой дл культи вировани гибридом, содержащей гипок«- сантинаминоптеринтнмидин (ГАТ), и The precipitate is diluted with culturing medium of hybridomas containing the hypoca-Santinaminopterin-tmidine (GAT), and

разливают в 96-луночные панели, куда накануне засевают перитонеальные макрофаги и тимоциты (1-5-105 макро - фагов и 1 -107 тимоцитов на панель) сингенных мышейсpoured into 96-well panels, where peritoneal macrophages and thymocytes (1-5-105 macrophages and 1 -107 thymocytes per panel) are seeded onto syngenic mice

Через 8-12 сут инкубировани в атмосфере с углекислого газа при 37°С определ ют количество образую1 щихс колоний гибридомных клеток Посредством твердофазного иммунофер - ментного анализа оценивают число лоний секретирующих антитела к глико - протеину Е вируса КЭ. Клетки из лунок в супернатанте которых обнаруживают синтез специфических антител, подвёр гают клонированию Последнее провод т в 96-луночных панел х методом пре дельных разведений (50,5 и 0,5 ток на лунку) „ Дл последующих рекло - нирований отбирают лунки, в которых обнаруживаетс синтез специфических антител, при наличии в них не более 1-2 колоний Всего провод т 5 реклони рованийу после чего полученный штамм перевод т в массовую культуру - чале в количестве 2«10 клеток в 10 мл среды, а затем 4Ч06 клеток в 25 мл средыAfter 8–12 days of incubation in an atmosphere with carbon dioxide at 37 ° C, the number of forming colonies of hybridoma cells is determined. Using a solid phase immunoassay, the number of lonium secreting antibodies to glyco-protein E of the CEE virus is estimated. Cells from the wells in the supernatant which detect the synthesis of specific antibodies, are subjected to cloning. The latter is carried out in 96-well panels by the method of limiting dilutions (50.5 and 0.5 current per well). For subsequent reclamations, wells are selected in which the synthesis of specific antibodies is detected, if there are no more than 1-2 colonies in them, a total of 5 clones are performed, after which the resulting strain is converted into a mass culture in an amount of 2-10 cells in 10 ml of medium, and then 4 × 06 cells in 25 ml Wednesday

Ытамм характеризуетс следующими свойствами оYtamm is characterized by the following properties about

При оптимальных услови х культиви - ровани жизнеспособность клеток равна 95-98%о Врем удвоени , определ емое путем пр мого подсчета количества клеток в суспензии, мен етс в зави симости от условий культивировани в диапазоне ч„ За период дн после посева клетки претерпевают 1- 2 делени и достигают плотностиUnder optimal cultivation conditions, cell viability is 95-98% of the doubling time, determined by direct counting of the number of cells in suspension, varies depending on the cultivation conditions in the h range. During the day after seeding, cells undergo 1- 2 divisions and reach density

6-8-10Г клеток в 1 мл. В культурах с более высокой плотностью отмечаетс повышенна гибель клеток„ Кратность рассева равна 1 + 2 - 1+3,.6-8-10G cells in 1 ml. In cultures with higher density, increased cell death is noted. The multiplicity of sieving is 1 + 2 - 1 + 3 ,.

,. Q , Q

$ $

00

Клетки штамма после четырех рекло- нирований перевод т с селективной среды с добавлением ГАТ на обычную среду следующего состава: среда RPMI-1640 с 15% фетальной тел чьей сыворотки и 2 мМ L-глютамина. Дл исключени возможности бактериально го пророста в среду добавл ют гента - мицин в дозе 50 мкг/мл„The cells of the strain after four reclosing were transferred from selective medium with the addition of GAT to the usual medium of the following composition: RPMI-1640 medium with 15% fetal calf serum and 2 mM L-glutamine. To eliminate the possibility of bacterial growth, geneticin at a dose of 50 µg / ml is added to the medium.

Гибридома по типу роста вл етс суспензионной культурой и растет в виде гроздей из клеток и в ветле единичных клетокс Характер роста мен етс в зависимости от качества используемого пластика или стекла Пересев культуры осуществл ют путем энергичного встр хивани культуралы- ного сосуда или смывом клеток с культуральной поверхности средой под давлением из шприца в случае роста культуры в виде моносло . Морфологи клеток предлагаемого штамма -клетки неоднородны по форме и размерам, но преимущественно имеют округлую форму и неровные кра Growth hybridomas are suspension cultures and grow as bunches of cells and in a single cell cell. Growth patterns vary depending on the quality of the plastic or glass used. Peres culture are performed by vigorously shaking the culture vessel or washing the cells from the culture surface medium under pressure from the syringe in the case of growth of culture in the form of a monolayer. The morphology of the cells of the proposed strain - cells are heterogeneous in shape and size, but mostly have a rounded shape and irregular edges

При внутрибрюшинной трансплантат ции клеток гибридомы син генным мышам, получившим предварительно за сут внутрибрюшинно по 0,3 мл пристава, отмечаетс рост опухоли в асцит ной форме через 15 сут0 От 1 мыши получают от 1 до 6 мл асцитной жидкостиWhen intraperitoneal cell transplantation of hybridoma to gene mice, which received an intraperitoneal dose of 0.3 ml of a bailiff during the day, the tumor grows in ascites form after 15 days. From 1 mouse receive from 1 to 6 ml of ascites fluid

Культура клеток штамма не конта - минирована грибами, бактери ми, вирусами и микоплазмамиьThe culture of the strain cells is not contaminated by fungi, bacteria, viruses, and mycoplasmas.

Криоконсервирование клеток ридомы провод т на среде, состо щей из 90% фетальной тел чьей сыворотки и 10% диметилсульфоксида„Cryo-preservation of Ridoma cells is carried out on medium consisting of 90% fetal calf serum and 10% dimethyl sulfoxide.

Пнбридома продуцирует монАт к новиому функциональному белку оболоч - ки вируса КЭ - к г ли копр от ей ну Е Антитела относ тс к подклассу IgG1« Титр антител по данным иммунофер ментного анализа в культуральной жиде- кости равен 1«-2 -Ю2, а в асцитной жидкости 1-. 1-10у„ Антитела не вы вл ютс в реакци х св зывани комплемента диффузионной преципита - 1$ш в агаре и нейтрЈ1лизациис В то же врем они активны в реакции тормо - жени гемагглютинации (титр 1/1бО)0 Активность антител низка - консташ- та св зывани равна 6, .Pnbridoma produces monathe to the new functional protein of the envelope of the virus KE - to the gli copra from it. The antibodies belong to the IgG1 subclass Antibody titer according to the immunofermental analysis in the culture fluid is 1 -2 –U2, and ascitic fluid 1-. 1-10u Antibodies are not detected in diffusion precipitate complement binding complement reactions - 1 $ w in agar and neutrins. At the same time, they are active in the reaction of hemagglutination inhibition (titer 1 / 1bO) 0 Antibody activity is low - constash This binding is 6,.

Пример Выд шение белка Е вируса КЭ методом аффинной хроматографин с применением монАТ вырабатываемых гибридомойоExample Extraction of E protein of CE virus by affinity chromatographic method using monat produced by hybridoma

МонАТ получают, трансплантиру внутрибрюшинно по 1-510 клеток предлагаемого штамма гибридомы син«- генным мышам, получившим предвари - тельно за 20-30 сут внутрибрюшинно по 0,3 мл пристава„ Рост опухоли мечают в асцитной форме через 15 суто Объем асцитной жидкости, получаемой от 1 мыши, колеблетс в пределах 1-6 мл„ Титры монАТ к глико протеику Е в асцитной жидкости по данным иммуноферментного анализа равны 1-10-4 г- 1 MonAT is obtained by transplanting intraperitoneally 1-510 cells of the proposed hybridoma strain to syngemic mice, which received in advance for 20-30 days intraperitoneally with 0.3 ml of bailiff “Tumor growth is labeled in ascites form after 15 days. The volume of ascites fluid obtained from 1 mouse, varies in the range of 1-6 ml. The titers of monatum to glycoprotein E in ascites fluid are 1-10-4 g- 1 according to the ELISA test.

Дл аффинной хроматографии колон ки размером 1x5 см заполн ют макро - пористым стеклом, модифицированным либо поликлональными антителами к вирусу КЭ, либо монАТ, секретируемыми предлагаемым штаммом„For affinity chromatography, 1x5 cm columns are filled with macroporous glass, modified with either polyclonal antibodies to CE virus, or monAT secreted by the proposed strain

На каждую из колонок нанос т сус- пензию, содержащую гликопротеин Е вируса КЭ в количестве 5 мг. После адсорбции белка колонки промывают О,1 М фосфатно-солевым буферным раствором и элюируют белок Е 0,1 М НС1 буфером, рН 8,5 с градиентом хлористого натри , а затем - тем же буфером с градиентом тиоцианата ка«ЛИЯ0A suspension containing glycoprotein E of VE virus in an amount of 5 mg is applied to each of the columns. After adsorption of the protein, the columns are washed with O, 1 M phosphate-saline buffer solution and protein E is eluted with 0.1 M HC1 buffer, pH 8.5 with a gradient of sodium chloride, and then with the same buffer with a gradient of thiocyanate “LIA0”

Из колонки с сорбентом, модифици - рованным поликлональными авидными антителами, при использовании диента хлористого натри белок Е не элюируетсЯо При использовании в качестве элюирующего агента М тиоциана та кали йыход белка на этой колонке составил 30% от нанесенного на коло№ ку количества белка, а его специфическа активность 10%0From the column with a sorbent modified with polyclonal avid antibodies, when using sodium chloride, protein E is not eluted. When using thiocyan and potassium protein on the column as eluent, this column made up 30% of the amount of protein applied to the column and specific activity 10% 0

Из колонки с сорбентом, модифицированным монАТ, секретируемыми предлаFrom the column with a monobat modified sorbent, secreted by

гаемым штаммом, выход белка Е состав - л ет 70% при использовании в качест ве элюирующей жидкости вьшеназва н- ного буфера с 0,6 М хлористого ри „ При этом специфическа актив - ность полученного белка полностью со хран етс „the desired strain, the yield of protein E is 70% when using an equivalent buffer with 0.6 M chloride as the elution liquid. At the same time, the specific activity of the obtained protein is completely preserved

Благодар низкой авидности анти тел при использовании их в аффинной хроматографии можно примен ть щад щие воздействи дл разрыва св зи антитело - антиген, что позвол ет избежать денатурации антигена и обеспечивает его высокий выходоDue to the low avidity of antibodies when used in affinity chromatography, sparing effects can be used to break the bond of the antibody - antigen, thus avoiding the denaturation of the antigen and ensuring its high yield.

Так, выход антигена (белок Е виру са КЭ) при аффинной хроматографии с использованием авидных антител, со ставл ет 30%, а применение ннзкоавид - ных монАТ, секретируемых полученной гибридомой, позвол ет повысить выход антигена до 70% „ При этом удаетс по«- лучить примерно в 7 раз больше антThus, the yield of the antigen (protein E of the CE virus) with affinity chromatography using avid antibodies is 30%, and the use of nzcoavid monAT secreted by the resulting hybridoma allows an increase in the yield of the antigen to 70%. - shine about 7 times more ant

гена, сохранившего свои серологи - ческие свойства (из колонки с бентом, модифицированным авидными антителами, отмечаетс выход 10% бел«- ка Е, сохранившего активность в серо логических реакци х, от количества белка, нанесенного на колонку, выход белка Е, сохран ющего активность в серологических реакци х, из колонки с макропористым стеклом, модифици рованным монАТ, вырабатываемыми of the gene that retained its serological properties (from the column with a bent modified with avid antibodies, there is a yield of 10% protein "E, which retained activity in serological reactions, of the amount of protein applied to the column, the yield of protein E that retains activity in serological reactions, from a column with macroporous glass modified with monat, produced

Claims

hybridoma, 70%). Invention Formula

The strain of hybrid cultured animal cells Mus musculus L. - BCKK (II) In 283D, it produces monoclonal antibodies to glycoprotein E (v.3) of tick-borne encephalitis virus.