SU1645301A1

SU1645301A1 - Method for mutants preparation in spore-former bacteria streptomyces and clostridium acetobutylicum

Info

Publication number: SU1645301A1
Application number: SU884490424A
Authority: SU
Inventors: Наталья Дмитриевна Ломовская; Татьяна Александровна Чиненова; Ольга Анатольевна Клочкова; Ирина Владимировна Бирюкова; Лидия Константиновна Емельянова; Татьяна Александровна Воейкова; Нора Манвеловна Мкртумян; Серекбай Каримович Абилев
Original assignee: Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов
Priority date: 1988-10-04
Filing date: 1988-10-04
Publication date: 1991-04-30

Abstract

Изобретение относитс к микробиологической промышленности, в частности к получении мутантов промышленных штаммов актиномицетов и анаэроб- нон бактерии Clostridium acetobutyii- L-uia Целью изобретени вл етс повышение выхода мутантов с минимальным числом множественных мутаций при увеличении абсолютного числа мутантов в попул ции клеток0 Способ заключаетс в обработке на стадии прерастани спор бактерий Clostridium aretobuty- 1 irura и бактерий рода Streptomyces низкими концентраци ми химических мутагенов, 1 табл0 3 (ЛThe invention relates to the microbiological industry, in particular, the production of mutants of industrial actinomycete strains and anaerobic bacteria Clostridium acetobutyii-L-uia. The aim of the invention is to increase the yield of mutants with a minimum number of multiple mutations while increasing the absolute number of mutants in the cell population. The method consists in processing at the stage of growth of the spores of the bacteria Clostridium aretobuty-1 irura and bacteria of the genus Streptomyces with low concentrations of chemical mutagens, 1 table 3 (L

Description

Изобретение относитс к микробиологической промышленности, в частнос- 4 ти к получению мутантов промышленных штаммов актиномицетов и анаэробной бактерии Clostridium acetobutylicunuThe invention relates to the microbiological industry, in particular to the production of mutants of industrial strains of actinomycetes and the anaerobic bacterium Clostridium acetobutylicunu

Цель изобретени - повышение выхода мутантов с минимальным числом множественных мутаций при увеличении абсолютного числа мутантов в попул ции клетокThe purpose of the invention is to increase the yield of mutants with a minimum number of multiple mutations with an increase in the absolute number of mutants in the cell population.

Способ осуществл ют следующим образомThe method is carried out as follows.

Применительно к актиномицетам: на чайки с минимальной средой, содержащей необходимые факторы роста, нанос т полужидкий агар того же состава, содержащий споровую суспензию культуры и раствор мутагена в нужной концентрации . На определенной стадии прорастани спор смесь центрифугируют, отмывают физиологическим раствором или дистиллированной водой и рассевают на чалки со средами, содержащими антибиотики в определенных концентраци х в качестве селективных агентов, дл подсчета мутантов Ant , устойчи- вых к антибиотикамоApplied to actinomycetes: semi-liquid agar of the same composition is applied to gulls with minimal medium containing the necessary growth factors, containing a spore suspension of the culture and a solution of mutagen in the required concentration. At a certain stage of spore germination, the mixture is centrifuged, washed with physiological saline or distilled water, and scattered with media containing antibiotics in certain concentrations as selective agents, to count Ant mutants resistant to antibiotics.

Применительно к С0 acetobutylicum: споры внос т в полужидки агар, содержаний гутаген в нужной концентра-, ции, и эту смесь нанос т на чашки с твердым слоем агара, содержащие в качестве селективного агента антибиотик . Чайки инкубируют в анаэроб-, ных услови х при 37°С в течение 64- 72 ч и отбирают мутанты, устойчивые к антибиотикуоWith respect to C0 acetobutylicum: spores are added to semi-liquid agar, the contents of the gutagen are in the right concentration, and this mixture is applied to the plates with a solid layer of agar containing an antibiotic as a selective agent. Gulls are incubated under anaerobic conditions at 37 ° C for 64–72 h and antibiotic resistant mutants are selected.

О5 O5

слcl

ОдOd

Мутагенную обработку прорастающих спор Со acetobutylicum производ т в слое полужидкого агара, как и в случае актиномицетов Однако из-за чувствительности анаэробных бактерий к кислороду нет возможности определить число выживших клеток традиционным методом разведени Поэтому учет мутантов С acetobutylicum произво- д т путем подсчета абсолютного числа выросших на селективной среде колоний сMutagenic treatment of germinating spores. Co acetobutylicum is produced in a semi-liquid agar layer, as in the case of actinomycetes. However, because of the sensitivity of anaerobic bacteria to oxygen, it is not possible to determine the number of surviving cells by the traditional method of dilution. Therefore, taking account of C acetobutylicum mutants is obtained by counting the absolute number of grown on selective medium of colonies with

Пример 1 о Определение эффективности мутагенного действи N-метил-К-нитро-И-нитрозогуанидина (НГ) „Example 1 Determination of the effectiveness of the mutagenic action of N-methyl-K-nitro-I-nitrosoguanidine (NG) „

На чашки с минимальной средой, содержащей в качестве факторов роста необходимые концентрации крахмала и дрожжевого экстракта, нанос т полужидкий агар со споровой суспензией клеток So aureofaciens ТВ 633 ФУ и НГ в разных концентраци хо После прорастани спор до определенной стадии на чайки вторично нанос т полужидкий агар, содержащий антибиотик олеандомицин в концентрации Юмкг/мл дл отбора мутантов Oln „ При концентрации НГ 5 мкг/мг число полу- ченных мутантов вл етс максимальным и составл ет 10 на 10 выживших клеток (см„ табл«)сSemi-liquid agar with spore suspension of So aureofaciens TB 633 FU and NG cells in different concentrations are applied to plates with minimal medium containing the growth factors of the required concentrations of starch and yeast extract. After germination of spores up to a certain stage, semi-fluid agar is applied to gulls containing the antibiotic oleandomycin at a concentration of Yumkg / ml for the selection of mutants Oln. At a concentration of NG of 5 µg / mg, the number of the obtained mutants is maximum and is 10 per 10 surviving cells (see tab.)

Примеры 2-5о Определение эффективности мутагенов 4-хинолин-1- оксида (НХО), Н-нитрозо-Н-метилмоче- вины (НИМ), динитробензоперилена (5, (5,10-ДНБП) , ДПДТДП-6,7-диамино-4,9- диокси-5,1О-диоксо-4,5,9,10-тетра- гидро-7,9-диаэапирена СЩЩТДП) „ Examples 2-5o Determination of the efficacy of 4-quinoline-1-oxide (NXO) mutagens, N-nitroso-N-methyl urea (BAT), dinitrobenzoperylene (5, (5,10-DNBP), DPDTPD-6,7-diamino -4,9- dioxy-5,1O-dioxo-4,5,9,10-tetra-hydro-7,9-diaaeramine SSCCHTDP) „

Эксперимент осуществл ют также, как в примере 1, но используют мутаген НХО (в концентрации 1 мкг/мл, привод цей к уровню мутаций 1,5-10), НММ (в концентрации 10 мкг/мл, даю- цей уровень мутаций 2 -10), ДНБП (коцентраци 1 мкг/мл, число мутантов 1-Ю3), ДДЦТДП, который в концентрации 50 мкг/мл приводит к уровню мутаций 5-10 (см. табл.).The experiment was carried out as in Example 1, but using HXO mutagen (at a concentration of 1 µg / ml, resulting in a mutation level of 1.5-10), HMM (at a concentration of 10 µg / ml, giving a mutation level of 2 - 10), DNBP (concentration of 1 µg / ml, the number of mutants of 1-U3), DDCTDP, which at a concentration of 50 µg / ml leads to the level of mutations of 5-10 (see table.).

Практически при всех используемых дозах мутагенов наблюдают, что выживаемость клеток штамма So aureofacien существенно не снижаетс о Дл мутагенов ДДДТДП, ДНБП, НИМ и НГ выживав мость при оптимальных дл получени мутантов дозах мутагена составл ет от 30 до 100%. Исключение составл ет лиыь мутаген НХО: использованиеPractically at all used mutagen doses, it is observed that the survival rate of cells of the So aureofacien strain does not significantly decrease. For mutagens DDDDP, DNBP, BAT and NG, surviving at optimal doses of mutagen for mutant production is from 30 to 100%. The exception is LiH mutagen HHO: use

его в концентрации 1 мкг/мл приводит к снижению выживаемости клеток до 11(Г , а в концентрации 0,5 мкг/мл - до 10%. Существенно, что во всех приведенных примерах абсолютное число мутантов, полученных после обработки мутагенами, значительно выше спонтанного уровн , а также на 2-3 пор дка превышает число мутантов, полуненных при соответствующих концентраци х мутагенов по способу- прототипу (см., табл.,)it at a concentration of 1 µg / ml leads to a decrease in cell survival to 11 (G, and at a concentration of 0.5 µg / ml to 10%. It is significant that in all the examples given the absolute number of mutants obtained after treatment with mutagens is much higher than the spontaneous level, as well as 2-3 times more than the number of mutants polunirovanny with the appropriate concentrations of mutagens according to the method of the prototype (see, tab.,)

Пример 6о Определение эффективности этилметансульфоната (ЭМС) дл С, acetobutylicum,,Example 6o Determination of the effectiveness of ethyl methane sulfonate (EMC) for C, acetobutylicum,

В расплавленный полужидкий агар (0,8%) объемом 2,5 мл при 45°С внос т 100 мкл суспензии спор и мутаген ЭМС в объемах, соответствующих его конечной концентрации 0,6 мг/мл„ Смесь перемешивают, наслаивают на заранее подготовленный нижний слой агара, содержащий в качестве селективного фактора рифампицин (3 мг/мл) и учитывают через 72 ч инкубации в аэростате число устойчивых к рифампицину (Rif ) мутантово Дл концентрации этилметансульфоната (0,6 мг/мл) число мутантов равно 185, что в 92,5 раза превышает число мутантов, получаемых при таких же концентраци х мутагена стандартным методом прототипа (см« табл)о100 µl of a spore suspension and an EMC mutagen in volumes corresponding to its final concentration of 0.6 mg / ml are added to the molten semi-liquid agar (0.8%) with a volume of 2.5 ml at 45 ° C. agar layer containing rifampicin (3 mg / ml) as a selective factor and after 72 hours of incubation in a balloon the number of rifampicin-resistant (Rif) mutant For the concentration of ethyl methane sulfonate (0.6 mg / ml) the number of mutants is 185, which is 92 , 5 times the number of mutants obtained at the same concentrations mutagen standard prototype method (see "Table) o

Применение указанного способа позвол ет значительно (до 200 раз по сравнению с прототипом) уменьшить дозы мутагенов, используемых при получении различных типов мутаций,, Это приводит к экономии расхода мутагенов и повышению безопасности работы с нимио В свою очередь, низкие дозы мутагена обеспечивают увеличение выживаемости клеток, а следовательно, и абсолютного числа мутаций в попул ции , т„ес повышают эффективность мутагенеза „ При этом сокращаетс число вредных и множественных мутаций„ Способ позвол ет быстро и с хорошим выходом (число мутантов в 10-100 раз больше , чем в способе-прототипе) получать мутанты с заданными свойствами бактерий , а также вл етс экспресс-методом дл определени эффективности действи различных мутагенов по отноше- н ю к актиномицетаМоThe application of this method allows significantly (up to 200 times compared to the prototype) to reduce the doses of mutagens used to obtain various types of mutations. This leads to savings in the consumption of mutagens and increase the safety of working with them. In turn, low doses of mutagens provide increased cell survival and, consequently, the absolute number of mutations in the population, t „eu increase the efficiency of mutagenesis.“ This reduces the number of harmful and multiple mutations. ”The method allows you to quickly and with a good yield. (the number of mutants is 10-100 times more than in the method of the prototype) to obtain mutants with the desired properties of bacteria, and is also a rapid method for determining the effectiveness of the action of various mutagens with respect to actinomycete

Способ может использоватьс в. процессе рациональной селекции с целью улучшени технологических свойств промышленных штаммов - продуцентов биологически активных веществ.The method can be used in. the process of rational selection in order to improve the technological properties of industrial strains - producers of biologically active substances.

Claims

The invention of the method for producing mutants in spore - forming bacteria Streptomyces and Clostridium acetobutylicum, which involves treating the culture with mutagens followed by the selection of mutants on selective media, with the aim of increasing the yield of mutants with the minimum number of multiple mutations.

become mutagenic at the stage of spore germination, and N-methyl-N-nitro-N-nitroso-guanidium (NG) at a concentration of 5-25 μg / ml, or 4-nitroquinolin-1-oxide (11X0) is used as a mutagen. 0.5-1 µg / ml, or N-nitroso-M-methyl urea (BAT) 1-50 µg / ml, or dinitrobenzene-perylene (5,10-DIBP) 1-25 µg / ml, or DDCTDP-2,7- diamino-4,9-dioxy-5,10-dnoxo-4,5,9,1O-tetrahydro-7,9-diazapyrene (DDDTDP) 5-50 μg / ml, or ethyl methane sulfonate (EMC) 0.25 9y8 Mr / ml

Frequency of induced mutants as an indicator of the effectiveness of the action of various mutagens on the So aureofaciens strain

note

The effectiveness of the mutagens is taken into account by increasing the number of Oln mutants resistant to oleandomycin, the number of spontaneous mutations Oln - 1-102 per 10 surviving cells.