SU1644037A1

SU1644037A1 - Method of determination of biopolymer concentrations in the reaction of complement binding

Info

Publication number: SU1644037A1
Application number: SU884361953A
Authority: SU
Inventors: Геннадий Андреевич Золенко
Original assignee: Чечено-Ингушский Государственный Университет Им.Л.Н.Толстого
Priority date: 1988-01-08
Filing date: 1988-01-08
Publication date: 1991-04-23

Description

1one

(21)4361953/13(21) 4361953/13

(22)08,01.88(22) 08,01.88

(46) 23.04.91. Бюл № 15(46) 04.23.91. Bull number 15

(71)Чечено-Ингушский государственный университет им Л.Н Толстого(71) Chechen-Ingush State University named after L.N. Tolstoy

(72)Г.А.Золенко(72) G.A. Zolenko

(53)543.9(088.8)(53) 543.9 (088.8)

(56)Лабораторное дело, 1986, № 9, с0 548.(56) Laboratory work, 1986, No. 9, c0 548.

Иммунологические методы /Под ред, Г.Фримел , 1987, М.: Медицина, с. 193.Immunological methods / Ed., G. Frimel, 1987, M .: Medicine, p. 193.

(54)СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ БИОПОЛИМЕРОВ В РЕАКЦИИ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА(54) METHOD FOR DETERMINING THE CONCENTRATION OF BIOPOLYMERS IN THE COMPLEMENT BINDING REACTION

(57)Изобретение относитс к аналитической биохимии и может быть использовано дл определени полипептидов(57) The invention relates to analytical biochemistry and can be used to determine polypeptides.

и нуклеиновых кислот в исследовательских лаборатори х и лаборатори х пищевой промышленности. Целью изобретени вл етс упрощение способа и расширение спектра исследуемых веществ . Основу способа составл ют две св занные реакции Перва представл ет собой конкурентную ферментатив- ную систему: анализируемое вещество (полипептид, нуклеинова кислота) - тест-антиген-фермент (пептидаза илиand nucleic acids in research laboratories and food industry laboratories. The aim of the invention is to simplify the method and expand the spectrum of the studied substances. The method is based on two coupled reactions. The first is a competitive enzyme system: the analyte (polypeptide, nucleic acid) is a test antigen-enzyme (peptidase or

нуклеаза) Друга представл ет постановку реакции св зывани комплемента с участием тест-антигена, антисыворотки к нему и гемолитической системы. Способ допускает также анализ нуклеиновых кислот с нуклеаза- ми, В этом случае очистка нуклеиновых кислот не вл етс необходимой Специфичность анализа здесь обеспечена ферментом и инактивированным вирусом, при этом активность антигенов возрастает при обработке ну- клеазой Способ содержит три блока операций: 1„ Хронометрическа инкубаци анализируемого вещества и антигена в растворе фермента с последующей гго инактивацией, 2. Постановка реакции св зывани комплемента в инкубате. 3 Учет глубинб гемолиза и определение количества анализируемого вещества по калибровочной зависимости. Количество анализируемого вещества пропорционально количеству гемолизированных эритроцитов Способ не требует получени специфической антисыворотки к исследуемому веществу и допускает возможность анализа большого числа полипептидов , выделенных, например, с помощью электрофореза. 2 табл„nuclease) Another is the formulation of the complement fixation reaction involving the test antigen, its antiserum and hemolytic system. The method also permits the analysis of nucleic acids with nucleases. In this case, purification of nucleic acids is not necessary. The specificity of the analysis here is provided by an enzyme and an inactivated virus, while the activity of antigens increases during nucleotide processing. The method contains three blocks of operations: 1. Chronometric incubation the analyte and antigen in the enzyme solution, followed by inactivation, 2. Statement of the complement fixation reaction in the incubate. 3 Accounting for depth of hemolysis and determination of the amount of the analyte by the calibration dependence. The amount of analyte is proportional to the number of hemolyzed erythrocytes. The method does not require the preparation of specific antisera to the test substance and allows for the analysis of a large number of polypeptides isolated, for example, by electrophoresis. 2 tabl „

даЬyes

Изобретение относитс к аналитической биохимии и может быть использовано дл определени полипептидов и нуклеиновых кислот в исследовательских лаборатори х и лаборатори х микробиологической промышленности.The invention relates to analytical biochemistry and can be used to determine polypeptides and nucleic acids in research laboratories and laboratories of the microbiological industry.

Цель изобретени - упрощение способа и расширение спектра исследуемых веществThe purpose of the invention is to simplify the method and expand the spectrum of the investigated substances.

Пример 1 Дл проведени анализа все необходимые растворы готов т с помощью взвешивани с точностьюExample 1 For analysis, all necessary solutions are prepared by weighing with accuracy.

до 0,1 мг на физиологическом растворе , имеющем рН 7,18 при 20°С„up to 0.1 mg in physiological solution, having a pH of 7.18 at 20 ° С „

Провод т определение количества заданных по весу высокоочищенных белков разной молекул рной массы и структуры. В определени х используют следующие кристаллические реакти- вы (наименование - молекул рна масса 10): -глобулин лошади 150; лактатдегидрогеназа бычь 136; гис- тон Hj 15,1; инсулин бычий 6,0.The amount of highly purified proteins of different molecular weights and structures given by weight is determined. The following crystalline reagents are used in the definitions (the name is molecular weight 10): —globulin of a horse 150; lactate dehydrogenase bovine 136; Ht Ht 15.1; insulin bovine 6.0.

В кинетическую систему, кроме инсулина г вход т трипсин в концентрации 25 нг и антиген, представленный инактивированным аденовирусом 6 в культуре AI, имеющий концентрацию 40 нг.The kinetic system, in addition to insulin g, includes trypsin at a concentration of 25 ng and an antigen represented by inactivated adenovirus 6 in the AI culture, having a concentration of 40 ng.

Реагенты метрологической системы - специфическа сыворотка, комплемент , гемолизин, эритроциты барана - готов т в титрах, рекомендованных в прилагаемым к ним инструкци м по реакции св зывани комплемента (РСК) - диагностике аденовирусных антител в сыворотке крови„The reagents of the metrological system — specific serum, complement, hemolysin, sheep erythrocytes — are prepared in the titers recommended in the instructions attached to them on complement fixation reaction (RAC) - diagnosis of adenoviral antibodies in serum „

Кинетическую систему готов т в центрифужных пробирках путем смешени по 0,333 г каждой из ее рабочих концентраций и инкубирована в течени 30±0,05 мин в вод ной бане при 37iO,2 C« Врем дезактивации фермента 2 - 2,2 мин при 60-65 Со Все операции с растворами кинетической . системы провод т в услови х изол ции и обеспыленной атмосфере.The kinetic system was prepared in centrifuge tubes by mixing 0.333 g of each of its working concentrations and incubated for 30 ± 0.05 min in a water bath at 37iO, 2 C. The enzyme deactivation time was 2 - 2.2 min at 60-65 Co All operations with kinetic solutions. the systems are conducted under isolation and dust-free atmosphere.

Остальные операции, постановка РСК и учет глубины гемолиза провод т согласно инструкци м по РСК-диагно стике с использованием пр мого счета эритроцитов в камере Гор ева Среднее их количество (О) в четырех больших квадратах принимают в качестве учетной величины дл калибровочной зависимостиThe remaining operations, setting the RSK and taking into account the depth of hemolysis are carried out according to the instructions on the RSK-diagnostics using direct counting of erythrocytes in the Gorev chamber. Their average number (O) in four large squares is taken as a reference value for the calibration dependence

В табл. 1 приведены результаты анализа.In tab. 1 shows the results of the analysis.

П р и м е р 2о Дл анализа ДНК предварительно провод т сенсибилизацию 1 мг антигена к ДНКазе,Example 2 For DNA analysis, 1 mg of antigen to DNAse was first sensitized,

Сенсибилизаци вируса основана на известном свойстве ДНК образовывать сплавы с некоторыми из биополимеров , Сплавление произведено в следующем режиме,,Sensitization of the virus is based on the well-known property of DNA to form alloys with some of the biopolymers. Fusion was performed in the following mode,

Смешивают кристаллический антиген с кристаллической ДНК и бидистилли- рованной водой в соотношении масс 10:5:3-5. Экспонируют материал приThe crystalline antigen is mixed with crystalline DNA and bidistilled water in a mass ratio of 10: 5: 3-5. Exhibit material at

5five

00

5five

00

5five

00

5five

00

5five

85-90 С в течение 1 ч« Охлаждают материал в течение 2-2,5 ч до комнатной температуры. Готов т рабочий раствор антигена с необходимым значением рН из полученного материала. Созревание раствора в течение суток при 4-5°С85-90 ° C for 1 h “Cool the material for 2–2.5 h to room temperature. Prepare a working antigen solution with the required pH value from the obtained material. The maturation of the solution during the day at 4-5 ° C

При хранении на холоду рабочий раствор пригоден дл использовани в течение.10-15 сут„ Перед постановкой анализа необходим контроль активности антигена.When stored in the cold, the working solution is suitable for use for 10–15 days. Before testing, the control of antigen activity is necessary.

Из сенсибилизированного антигена готов т рабочий его раствор, обеспечивающий неполный гемолиз эритро- цитов в РСК (100-300 ед„ в учетном объеме). Кинетическую . систему в этом случае составл ют из рабочей концентрации сенсибилизированного антигена, раствора ДНКазы и растворов ДНК в концентраци х 0;.50; 250; 1250 нг. В остальном пор док и режимы определени калибровочных зависи- „ мостей не отличаютс от описанных в примере 1. Результаты калибровки приведены в табл. 1.A working solution is prepared from the sensitized antigen, which provides incomplete hemolysis of erythrocytes in the RSK (100-300 units in the accounting volume). Kinetic. the system in this case is composed of the working concentration of the sensitized antigen, the DNase solution and the DNA solutions at concentrations of 0; .50; 250; 1250 ng. Otherwise, the order and modes of determination of calibration dependencies do not differ from those described in Example 1. The results of the calibration are given in Table. one.

ПримерЗ. Результаты всех контрольных определений приведены в табл. 2 в пор дке задано/определено.Example The results of all control definitions are given in table. 2 is in order given / defined.

Контрольный анализ ДНК провод т в сыворотке крови крысы, из которой удалены мешающие определению следы ДНК и подавлена собственна ДНКаз- на активность следующими приемами: ввод т в сыворотку ДНКазы (- 1,5 мкг/мл), инкубируют материал (2 ч, 37,7РС), ввод т трипсин (1- 1,5 мкг/мл), инкубируют материал (3 ч, 37,), инактивируют фермент (20 мин, 65-70«С)0The DNA test was carried out in rat blood serum, from which traces of DNA that interfered with the determination were removed and the DNA activity was suppressed by the following methods: DNAse serum (-1.5 µg / ml) was injected, the material was incubated (2 h, 37, 7PC), trypsin is introduced (1-1.5 µg / ml), the material is incubated (3 h, 37,), the enzyme is inactivated (20 min, 65-70 ° C) 0

При анализе ДНК в нативном материале первые две операции излишни.When analyzing DNA in the native material, the first two operations are unnecessary.

Claims

Invention Formula

The method of determining the concentration of biopolymers in the reaction of complement fixation, including contacting the test substance with specific antibodies, complement and hemosystem with subsequent consideration of the results on the hemolysis depth of red blood cells, characterized in that, in order to simplify the method and expand the spectrum of the test substances, the test substance is pre-incubated

with a test antigen - adenovirus 6 at a concentration that provides hemolysis of 10 -107 erythrocytes in a staged experiment, and an enzyme specific to the test substance and a test antigen at a concentration that ensures a competitive enzymatic reaction, then the enzyme is inactivated, and the resulting reaction mixture is contacted with specific antibodies to the test antigen.

Table 1