SU1640652A1 - Способ определени микробной резистентности организма - Google Patents

Abstract

Способ определени  неспецифической антимикробной резистентности организма относитс  к иммунологии. Цель изобретени  - упрощение и повышение точности способа. Указанна  цель достигаетс  путем взаимодействи  цельной крови с микробами.Новизна способа заключаетс  в том, что в качестве микробных субстанций используют микробный антиген в дозе 8,0 и более АЕ-0,1 в РТПГА,смесь инкубируют при 36-37°С в течение 10-15 мин, охлаждают в течение 20-30 мин при 3-7°С, добавл ют 0,5 мл иммунной сыворотки активностью 3,0 и более АЕ/0,5 в РПГА,специфичнои к антигену, инкубируют при 3-7°С в течение 20 - 30 мин, центрифугируют, перенос т 0,5 мл надосадочной жидкости в планшет и определ ют антимикробную активность крови по остаточной активности антигена в АЕ/0,1 РТПГА. 1 табл. с SS (Л

Description

Изобретение относитс  к медицине, а именно к иммунологии, и предназначено дл  объективного контрол  за эффективностью лечени  лекарственными препаратами, обладающими иммуностимулирующими свойствами, санаторно- курортными факторами и другими способами лечени , дл  определени  индивидуального уровн  антимикробной резистентности организма при различных физиологических и патологических состо ни х , прогнозировани  индивидуального уровн  изменени  неспецифической антимикробной резистентности организма при лечении больных, а также в других област х медицины.

Целью изобретени   вл етс  упрощение и повгпчение точности способа за счет, оценки суммарной антимикробной активное ги гуморальных и клеточных факторов по их способности бло-;

киров ть активность микробного антигена , объективного контролировани  эффективности лечени .

Способ осуществл етс  следующим образом.

В центрифужную пробирку к 0,1 мл крови, стабилизированной гепарином из расчета 50 ЕД/мл, добавл ют 0,1 мл раствора активностью 8,0 и более АЕ/0,1 РТПГА микробного антигена ши- гелл Зонне, Нькжестл или Флекснера, встр хивают, инкубируют при 36-37°С в течение 10-15 мин. Смесь охлаждают 15-30 мин при 3-7°С. К пробам приливают по 0,5 мл раствора иммунной сыворотки, специфичной к антигену титром 3,0 и более в РПГА. Раствор иммунной сыворотки готов т из 1,0 мл неадсорбированной иммунной сыворотки к шигеллам Зонне, Ньюкестл или Флекснера, приложенной дл  контрольО5 Јь

О

с&

СП ND

ных исследований к соответствующему эритроцитарному диагностикуму. С этой целью 1,0 мл сыворотки развод т в 5,0 мл физиологического раствора и дл  осаждени  конгломератов этой сыворотки ее центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин. Осадок удал ют, а надоеадочный раствор иммунной сыворотки развод т в 100 200 мл физиологического раствора. Одномоментно став т шкалу, позвол ющую оценить активность антигена,блокированного исследуемой кровью. К 0,1 мл микробного антигена различной активности с целью уравнивани  приливают по О,1 мл физиологического раствора. Контролем  вл етс  проба с 0,2 мл физиологического раствора. К пробам крови с остаточной активностью антигена и различных разведений этого антигена в контрольных исследовани х приливают по 0,5 мл приготовленного раствора иммунной сыворотки . Пробы встр хивают и инкубируют при 3-7 С в течение 20-30 мин, центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин Надосадочный раствор каждой пробы перенос т в отдельные лунки 1-го р да планшета дл  макроварианта постановки РПГА. В лунки этого р да и последующих р дов приливают по 0,5 м физиологического раствора и раститро вывают сыворотку каждой пробы по вертикальному р ду лунок планшета, так, что в 1-й лунке ее разведение будет 2-кратное,.во 2-й - 4-кратное и т.д. до 4-5-го горизонтального р да лунок планшета и добавл ют в каждую лунку по 0,20-0,25 мл 1%-ной взвеси эритроцитов антигенного диагностику- ма. С учетом, что при исследовании антимикробной активности крови всегда провод т кoнfpoльныe исследовани  определ ют активность антигена и иммунной сыворотки - диапазон колебаний времени и инкубации планшетов может быть значителен и составл ет соответственно от 2 до 24 ч, температура 5-20°С.

Учет реакции провод т по 4-крест- ной системе: 4+ ;- все эритроциты агглютинированы и равномерно покрывают дно лунки:

3+ - агглютинированы почти все эритроциты, но на их фоне имеетс  малозаметное кольцо из осевших неагглютинированных эритроцитов;

5

0

5

0

5

0

2+ - нар ду с равномерным агглю- тинатом на дне лунки имеетс  осадок из неагглютинированных эритроцитов - в виде маленького колечка;

1+ - большинство эритроцитов не агглютинировано и осело в виде маленького колечка в центре лунки.

С учетом, что картина агглютинированных и осевших эритроцитов в лунках четка , при оценке результатов исследований между 4+ и 3+, 3+ и 2+ дополнительно выдел ют 3,5+ и 2,5+. Между 2+ и 1 + , 1+ и - соответственно 1,5+ и 0,5+. Такой учет результатов не вызывает трудностей. Однако эта модификаци  резко повышает точность количественной оценки результатов взаимодействи  крови с антигеном .

В дальнейшем кресты, отражающие активность иммунной сыворотки,вступившей в контакт с остаточной активностью антигена в пробах с исследуемой кровью и различными разведени ми этого антигена в контрольных пробах с физиологическим раствором различных лунок по вертикальному р ду планшета складывают и получают относительную величину ее активности в +. Из полученных сумм высчитывают остаточную активность иммунной сыворотки в + после ее взаимодействи  с исходным раствором, антигена и получают величину активности антигена, блокированного исследуемой кровью или иммунной сывороткой в контрольных пробах в + или АЕ/0,1 в РТПГА.

С учетом, что в микробиологии активность антигена оцениваетс  в основном в АЕ в РТПГА, оценку активности крови можно проводить по формуле

45

С« х А.

4

0

5

где A j - активность антигена в АЕ/ /1,0 мл в РТПГА, блокированного исследуемой кровью; С ( - остаточный титр иммунных антител после взаимодействи  с антигеном в пробе с

кровью в +;

i

А2 - исходна  активность микробного антигена в АЕ;

Cg. исходный титр иммунных антител в +;

Способ иллюстрируетс  следующими примерами.

5164

Пример 1. Вли ние дибазола на антимикробную реэистентность организма у детей.

Исследование антимикробной активности крови проводили у 13 детей, длительно и часто болеющих, 6-летнего возраста до и после 4-недельного курса лечени  дибазолом (иммуностимул тор ) в дозе 0,005 1 раз в день в поликлинических услови х по выше- описанной методике с использованием О,1 мл раствора антигена шигелл Нькжестл, активностью 13,5 АЕ/0,1 в РТПГА.

После инкубации О,1 мл крови с антигеном при 37°С в течение 10 мин пробы охлаждали при 3°С в течение 20 мин, приливали к пробам по 0,5 мл иммунных антител к шигеллам Ньюкестл титром 16/ в 0,5 мл в РПГА. Пробы встр хивали и снова выдерживали при 3°С в течение 20 мин, центрифугировали при 1500 об/мин 5 мин и 0,5 мл надосадочного раствора проб перено- сили в планшет дл  макроварианта постановки РПГА и определ ли активность блокированного антигена кровью де- тей в АЕ/0,1 РТПГА.

Средн   величина активности блокированного антигена кровью детей до лечени  составл ет 3,1 АЕ/0,1 в РТПГА. Однако отмечаютс  значительные индивидуальные вариации этого показател  - в диапазоне от 1,0 до 4,0 АЕ С ± 16 3,1±0,9 (36 ±0,27) После проведенной терапии дибазолом отмечаетс  статистически достоверное повышение уровн  антимикробной актив- ности крови у детей (,05), на +32%. В то же врем  установлена обратна  зависимость между исходными величинами антимикробной активности крови у детей и изменени ми их уров ней после лечени  дибазолом (г -0,88 + 0,07, ,01),

Таким образом, результаты исследований позвол ют объективно контролировать эффективность лечени  и прог- позировать изменени  индивидуального уровн  антимикробной резистентности организма у детей: с относительно низкими исходными уровн ми антимикроной активности крови (3,0 АЕ и ниже) отмечаетс  значительное повышение ее уровн  и, наоборот, с высокими (3,5 АЕ,и выше) отмечаетс  незначительное повышение, изменение не вы

5

20

Q

25

30

до 45

50 55

35

 вл етс  или отмечаетс  незначительг ное снижение этого показател  крови

За вл емый способ позвол ет с высокой достоверностью прогнозировать уровень изменени  антимикробной резистентности организма конкретного ребенка до начала лечени , что позвол ет обеспечить индивидуалыый подход при проведении терапии иммуностимул торами в поликлинических услови х и проводить объективный контроль за эффективностью лечени .

Л р и м е р 2. Изменение антимикробной резистентности организма у детей под вли нием лечени  липамидом и поливитаминами.

Обследована группа детей в возрасте 3-х лет 7 человек) из дома ребенка № 1 г. Перми. Особенность этой группы - дети закрытого коллектива с энцефалопати ми смешенного генеза. Исследование антимикробной активности крови проводили до и после лечени  поливитаминами и липамидом в течение 2-х недель по вышеописанной методике с использованием антигена шигелл Ньюкестл активностью 10 АЕ/ /0,1 мл в РТПГА. После взаимодействи  0,1 мл крови с антигеном диаг- ностикума при 36°С в течение 15 мин смесь охлаждали при 7°С в течение 30 мин, приливали 0,5 мл иммунной сыворотки шигелл Ньюкестл титром 16 в 0,5 РПГА, пробы встр хивали и допол.- нительно выдерживали при 7°С в течение 30 мин, центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин,надоса- дочный раствор проб переносили в планшет и определ ли активность блокированного кровью антигена в АЕ/0,1 РТПГА.

Средн   величина блокированного антигена кровью детей до лечени  составл ет 3,3 АЕ, индивидуальные величины этого показател  .колеблютс  от 2,0 и 4,5 АЕ. М±б 3,3±0,9 (3 ±0,27). После проведени  лечени  отмечаетс  статистически достоверное повышение уровн  антимикробной активности крови у детей (,05), на + 27%. В то же врем  установлена обратна  зависимость между исходными величинами антимикробной активности крови у детей и изменени ми их уров ней под вли нием лечени  (г -0,55 + 0,13, ,05), что позвол ет, как и в первом примере,проводить объективный контроль за эффективностью лече-

ни  и прогнозировать изменени  антимикробной резистентности организма под вли нием лечени  детей липамидом и поливитаминами: с относительно низкими уровн ми антимикробной активности крови (3,5 АЕ и ниже) отмечаетс , как правило, значительное повышение ее уровн  и, наоборот,при высокой исходной величине антимик- робной активности крови (4,0 АЕ и выше ) из 6 детей только у одного ребенка отмечаетс  повышение этого показател , у двух детей изменений не вы влено , а у трех - наблюдаетс  снижение его уровн .

Приведенные результаты исследований антимикробной активности крови у детей под вли нием лечени  липамидом и поливитаминами убедительно показывают возможность проводить объективный контроль за эффективностью лечени  и прогнозировать ее изменение.

П р и м е р 3. Изменение антимикробной резистентности организма у детей под вли нием лечени  в санато

рии Светлана г.Перми.

Обследована группа детей (27 человек ) в возрасте от 3 и 7 лет до начала лечени  и в динамике через 4 недели после лечени  в детском санатории Светлана г. Перми с использованием методики исследовани  антимикробной активности крови. К 0,1 мл крови приливали 0,5 мл антигена ши- гелл Ньюкестл активностью 16 АЕ/0,1 мл в РТПГА. Пробы выдерживали 13 мин при 36,5°С, охлаждали при 5 С в течение 25 мин, приливали по 0,5 мл иммунной сыворотки к шигеллам Ньюкестл титром 16 АЕ/0,5 в РПГА, пробы встр хивали, снова выдерживали при низкой температуре (5°С) в течение 25 мин.Пробы центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин, надосадочную жидкость в количестве 0,5 мл переносили в планшет и определ ли активность блокированного антигена исследуемой крови в АЕ/0,1 мл в РТПГА.

Средн   исходна  величина активности блокированного антигена кровью у детей до начала лечени  составл ет 4,6 АЕ, индивидуальные колебани  этой величины равн ютс  в диапазоне от 2,0 до 9,0 АЕ М±6 4,6il,7 (36 i5,l). Через 4 недели после лечени  отмечаетс  статистически достоверное повышение уровн  антимикробной активности крови у детей (,05)

Q j

0

5

15

0

15

50

55

на +39%. В то же врем  отмечаетс  обратна  зависимость между исходными уровн ми антимикробной активности крови доноров и изменени  этих величин после лечени  (г -0,56iO,13, ,05).

Результаты исследований позвол ют сделать вывод о возможности объективного контрол  за эффективностью лечени  детей в санатории и прогнозировани  индивидуальных изменений антимикробной активности крови с использованием за вл емого способа: из 12 детей с относительно низкими уровн ми антимикробной активности крови (4,0 АЕ и ниже) у 10 отмечаетс  значительное повышение ее активности и только у 2 не вы вл етс  существенное изменение этого показател  и, наоборот, у 15 детей со средними и высокими уровн ми антимикробной активности крови (4,5 АЕ и выше) у 4 отмечаетс  снижение, у 3 существенных изменений не вы влено, у 8 детей отмечаетс  несущественное повышение этого показател .

Как было отмечено выше, при исследовании антимикробной активности крови в качестве стабилизатора использовали гепарин в дозе 50 АЕ/мл крови, при снижении дозы препарата до 20 - 30 АЕ/мл у р да здоровых доноров и детей отмечалось частичное свертывание крови. Достаточным  вл етс  объем 0,1 мл крови, снижение его до 0,05 мл снижает воспроизводимость способа. Активность антигена шигелл Зонне, Ньюкестл или Флекснера ЛНИИБС составл ет 3,0 и более АЕ/0,1 мл в РТПГА.

В этой дозе антиген полностью блокирует активности гуморальных и клеточных антимикробных факторов цельной крови и частично сохр н ет свою активность в отношении индикаторной дозы иммунной сыворотки, используемой дл  определени  активности антигена , блокированного кровью.

Оптимальна  температура инкубации крови и антигена составл ет 36-37°С. Основанием дл  использовани  этой температуры обработки смеси  вл етс  энергозависимость процесса взаимодействи  крови с антигеном,косвенным доказательством которой  вл етс  снижение величины блокированного антигена цельной кровью при 3-13°С.

Дл  вы влени  индивидуальной разницы антимикробной активности исследуемой крови оптимальное врем  обработки смеси составл ет 10-15 мин. Увеличение времени инкубации снижает эту разницу. Этот эффект св зан иммуностимулирующими свойствами индикаторной дозы антигена в отношении активности антимикробных факторов крови. В св зи с этим при увеличении времени обработки смеси при 37°С более чем 15 мин резко снижаетс  индивидуальна  разница в антимикробной активности крови у доноров или детей.

Результаты исследований полностью подтверждают литературные данные о возможности некоторых микробов и их субстанций (БЦЖ и липополисахаридов) стимулировать активность клеточных факторов иммунитета.

После взаимодействи  крови с антигеном пробы охлаждают до 3-7 С. В литературе известны данные, полученные на модели исследовани  фагоцитарной активности лейкоцитов, что при низкой температуре отмечаетс  снижение и даже полное прекращение метаболических процессов в клетках крови, следствием которого  вл етс  угнетение или полное прекращение антимикробной активности этих клеток. В то же врем  сохран етс  способность антигена вступать во взаимодействие с иммунными антителами, используема  дл  индикации остаточной активности этого антигена.

В результате исследований установлено , что индикаторна  доза иммунных антител в титрах при определении остаточной активности антигена в пробах с кровью составл ет 8,0 и более в 0,5 мл в РПГА. Врем  контакта при 3-7°С антигена с иммунными антителами достаточно 20-30 мин. Как показали исследовани , к этому сроку наблюдаетс  полна  блокада активности антигена иммунными антителами в пробах с кровью.

Дл  определени  неспецифической антимикробной активности крови использованы взвеси микробов шигелл Зонне, Ньюкестл и Флекснера или взвеси антигенных эритроцитарных диагнос тикумов из этих микробов. Основанием дл  использовани  антигенов дизентерийной -группы микробов  вл ютс  полученные с использованием за вл емого

5

0

5

0

5

0

5

0

5

способа результаты исследований: пр ма  коррел ционна  св зь между индивидуальными уровн ми антимикробной активности крови к этой группе микробных антигенов.

Несмотр  на значительные индивидуальные колебани  антимикробной активности крови к антигенам ни елл Зонее. Ньюкестл отмечаетс  высока  пр ма  коррел ционна  св зь между уровн ми активности блокированного антигена этих микробов (г +0,95± ±0,04 ,01).Аналогична  пр ма  коррел ционна  св зь вы влена между уровн ми антимикробной активности крови доноров к антигенам шигелл Зонне и лекснера, шигелл Ньюкестл и Флекснера (,05).

Преимущества способа определени  антимикробной активности крови по ее способности блокировать активность микробного антигена заключаютс  прежде всего в том, что эта методика отражает интегральный результат взаимодействи  крови с антигеном - позвол ет оценить способность гуморальных и клеточных компонентов крови снижать активность микробного антигена . Показатель антимикробной активное-. ти цельной крови на 4/5 состоит из величины блокированного антигена гу- моральным компонентом крови, около 1/5 приходитс  на клеточные элементы крови - эритроциты, лимфоциты,фагоциты . Величина фагоцитированного антигена в антимикробной активности крови составл ет не более 5%. В то же врем  методика оценкифагоцитйр- ной активности лейкоцитов отражает, как правило, уровень фагоцитоза 100 - 200 поли- и мононуклеарных фагоцитов.

За вл емый способ отличаетс  высо-1 кой точностью - средн   ошибка не превышает 5%, высокой воспроизводимостью , составл ющей практически 100% в сравнении с методикой оценки фагоцитоза,котора  по мнению большинства исследователей в фазе подсчета имеет р д недостатков: субъективна , недостаточно точна и воспроизводима .

Важным преимуществом за вл емого способа  вл етс  и высока  производительность труда. Дл  оценки результатов исследований требуетс  ке более 1 мин. Дл  подсчета в 1 мазке количества объектов, фагоцитированных

100-200 лейкоцитами, необходимо около 30 мин - 1 ч.

В за вл емом способе не требуютс  растворы дл  фиксации и покраски маз- г ков.

Сравнительна  оценка различных способов определени  антимикробной ре- зистентности организма показана в таблице.Ю

За вл емый способ может конкурировать по точности исследовани  антимикробной резистентности с радиоиммунными методами. Однако в нем не J5 требуетс  меченых радиоактивным изотопом микробных взвесей. Определение антимикробной активности цельной крови проводитс  с использованием стандартизованных , доступных, выпускав- 20 мых отечественной промышленностью микробных антигенов дизентерийной группы микробов и прилагаемых к ним иммунных сывороток.

Claims (1)

1. С учетом высокой точности,объек- 25 тивности, высокой воспроизводимости и производительности труда при исследовании антимикробной резистентности организма за вл емый способ рекомендуетс  в практическую медицину дл  объективного контрол  за эффективностью лечени  лекарственными препаратами , обладающими имму но стимул ируо- щими свойствами, и другими способами лечени ,прогнозировани  неспецифической антимикробной резистентности организма . Формула изобретени 

   Способ определени  микробной резистентности организма путем внесени  в пробу цельной крови микробного антигена с последующей оценкой результатов взаимодействи  компонентов крови с антигеном, отличающийс  тем, что, с целью упрощени  и повышени  точности способа, в пробу цельной крови внос т антиген с избыточной активностью, инкубируют затем внос т специфические к антигену иммунные антитела, повторно инкубируют с последующим центрифугированием смеси, отделением надосадочной жидкости и определением в ней остаточной активности внесенного антигена в реакции торможени  пассивной гемагглютинашш.

   т

   ки

   100-200 поли- и моно- нуклеарных фагоцитов

   низка 

   низка 

   дл  подсчета количества объектов фагоцитоза в 100-200 лейкоцитах требуетс  около 30 мин - 1 ч требуютс 

   антител (80%), эритроцитов (15%) и не более 5% приходитс  на долю фагоцитов

   ошибка составл ет не более

   практически 100% не более 1 мин

   нет