SU1615179A1

SU1615179A1 - Method of immobilizing alcoholoxidase

Info

Publication number: SU1615179A1
Application number: SU884429758A
Authority: SU
Inventors: Юозас Юозович Кулис; Марите Винцовна Песлякене; Лайма Стасевна Матялене; Валдас-Станисловас Альгимантович Лауринавичюс
Original assignee: Институт биохимии АН ЛитССР
Priority date: 1988-05-23
Filing date: 1988-05-23
Publication date: 1990-12-23

Abstract

Изобретение относитс к способам иммобилизации ферментов, а именно к технологии получени иммобилизованной алкогольоксидазы, котора используетс в анализаторах дл определени этилового спирта в крови и других биологических растворах. Цель изобретени - повышение активности и стабильности иммобилизованной алкогольоксидазы. Способ заключаетс в том, что при иммобилизации алкогольоксидазы путем включени в гелевую структуру, содержащую сывороточный альбумин и глутаровый альдегид в буферном растворе, и последующего нанесени его на лавсановую мембрану - дерный фильтр, в гелевую структуру дополнительно ввод т азид натри в концентрации 0,25-500 мМ, а иммобилизацию провод т при PH 8,0-9,0. 1 ил. 3 табл.The invention relates to methods for the immobilization of enzymes, in particular, to a technology for producing immobilized alcohol oxidase, which is used in analyzers to determine ethyl alcohol in blood and other biological solutions. The purpose of the invention is to increase the activity and stability of the immobilized alcohol oxidase. The method consists in the fact that when alcohol-oxidase is immobilized by incorporating serum albumin and glutaric aldehyde in a buffer solution into a gel structure, and then applying it to a mylar membrane - a dermal filter, sodium azide is added to the gel structure at a concentration of 0.25- 500 mM and immobilization is carried out at a pH of 8.0-9.0. 1 il. 3 tab.

Description

Изобретение относитс к способам иммобилизации ферментов, а именно к технологии получени иммобилизованной алкогольоксидазы, котора ис- пользуетс в анализаторах дл определени этилового спирта в крови и других биологических растворах.The invention relates to methods for the immobilization of enzymes, namely, to a technology for producing immobilized alcohol oxidase, which is used in analyzers for the determination of ethyl alcohol in blood and other biological solutions.

Цепь изобретени - повьшение активности и стабильности иммобилизованной алкогольоксидазы.The chain of the invention is an increase in the activity and stability of the immobilized alcohol oxidase.

Способ заключаетс в том, что при иммобилизации алкогольоксидазы из Candida boidinii путем включени фермента в гелевую структуру, содержащую сывороточньй альбумин и глу- таровый альдегид в буферном растворе , и последующего нанесени его на лавсановую мембрану - дерный фильтр, в гелевую структуру дополнительно The method consists in the fact that upon immobilization of alcohol oxidase from Candida boidinii by incorporating the enzyme into a gel structure containing serum albumin and glutaraldehyde in a buffer solution, and then applying it to a mylar membrane — a nuclear filter, in addition to the gel structure

ввод т азид натри в концентрации 0.25-500 ммоль, а иммобилизацию про-. вод т при рН 8,0-9,0.sodium azide was introduced at a concentration of 0.25-500 mmol, and immobilization was pro- water at pH 8.0-9.0.

Азид натри комплексируетс в активном центре алкогольоксидазы. Это подтвер дает изменение в спектре поглощени алкогольоксицазы в присутствии азида натри в области 400- 700 нм. |Sodium azide is complexed in the active center of alcohol oxidase. This confirms a change in the absorption spectrum of the alcohol oxidae in the presence of sodium azide in the range of 400-700 nm. |

На чертеже показаны спектры поглощени алкогольоксидазы в отсутствие (крива А) и в присутствие (крива Б) азида натри .The drawing shows the absorption spectra of alcohol oxidase in the absence (curve A) and in the presence (curve B) of sodium azide.

Пример 1. 3,0ед. алкогольоксидазы из Candida bo.idiniij 8 мг бычьего сывороточного альбумина раствор ют в 0,1 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 8,0, содержащего 0,1 М Example 1. 3.0 units Candida bo.idiniij alcohol oxidase 8 mg bovine serum albumin dissolved in 0.1 ml 0.01 M phosphate buffer pH 8.0 containing 0.1 M

сл KCl ,- 1 мМ ЭДТА и 50 ммоль азида нат- .рм . В раствор добавл ют 0,02 мл 5%- ного глутарового альдегида, смесь тщательно перемешивают и выливают на макропористую лавсановую мембрану (цериый фильтр) проницаемостью 10,7 диаметром, пор 0,54 мкм, площадью 9:см. Дл получени ферментной мем- , примен емой в анализаторах дл о)1ределени этилового спирта, на по-п в рхность приготовленной двухслойно мфмбраны надевают ацетатцеплюлозную мфмбрану толщиной 10 мкм. Полученную трехслойную мембрану помещают в хо- лфдильник в течение суток, затем раз на куски, надевают на элект- рфд и, тщательно отмыв струей буфера огаредел ют ток ферментного электрода пи рН 8,0 при 0,6 В отн. Ag/AgClSL KCl, - 1 mM EDTA and 50 mmol of azide nat. rm. 0.02 ml of 5% glutaraldehyde is added to the solution, the mixture is thoroughly mixed and poured onto a macroporous lavsan membrane (cerium filter) with a permeability of 10.7, diameter, pore 0.54 µm, area 9: cm. In order to obtain the enzyme meme used in analyzers for the determination of ethyl alcohol, a 10 micron thick acetone-mous membrane is put on the preparedness of the prepared bilayer mmbrane. The resulting three-layer membrane is placed in a refrigerator for 24 hours, then divided into pieces, put on electrofusion and, after washing carefully with a stream of buffer, restrict the current of the enzyme electrode to pH 8.0 at 0.6 V rel. Ag / AgCl

э/ ектрода сравнени .e / ekrod comp.

I Аналогично провод т иммобилизацию а когольоксидазы с использованием ази д4 натри в концентраци х 100 и 5(|)0 ммоль или в отсутствии азида натрй по известному способу. Готов т а1| алогичные примеру 1 ферментные элек тДоды.I Similarly carried out the coagoloxidase immobilization using sodium d4 sodium in concentrations of 100 and 5 (|) 0 mmol or in the absence of sodium azide by a known method. Ready t a1 | Similar to example 1 enzyme electrons.

, В табл. 1 приведены сравнительные п4раметры полученных электродов. Изме р ни -провод т в 0,01 М фосфатном .буфере (0,1 И КС1, 1 мМ ЭДТА),рН8,0. Из приведенных в табл. i данных врдно, что при тех же концентраци х эт|анола ток или чувствительность элекIn tab. 1 shows the comparative p4 parameters of the obtained electrodes. The measurement is not carried out in a 0.01 M phosphate buffer (0.1 AND KCl, 1 mM EDTA), pH8.0. From the table. i data in the meantime, for the same concentrations of floor current or electrical sensitivity

тг) меmr

ЛсLs

одов, содержащих иммобилизованные ;мбраны, изготовленные согласно пред . гаемому способу (2-4), значительно вь|1ше, чем содержащих мембрану, приготс|вленную согласно известному спо- сс|бу.odes containing immobilized; branes made according to before. This method (2-4) is significantly higher than those containing a membrane prepared according to a known method.

Мембраны, изготовленные согласно иг вестному способу, обладают низкой ч вcтвитeльнocтью и непригодны дл использовани в анализаторах этанола, поскольку при определении в реальных многокомпонентных средах соотношение фонового и полезного сигнал:ов превышает 5% из-за наличи в них посторон- HJ-tx веществ. .Membranes manufactured according to the known method have low coupling strength and are unsuitable for use in ethanol analyzers, since the ratio of background and useful signals in real multicomponent media: s exceeds 5% due to the presence of extraneous HJ-tx substances in them. .

Пример 2, Дл вы снени ин- тервалов используемых конц€:нтраций а(ида натри аналогично примеру 1 провод т иммобилизацию алкогольоксидазы без нанесени ферментного раствора на дерный фильтр с использованием а:-1ида натри в гелевой структуре в различных концентраци х. В этих иммобилизованных препаратах приExample 2 In order to clarify the intervals of the used concentra tions: (sodium ida, analogously to example 1, the alcohol oxidase is immobilized without applying the enzyme solution to a nuclear filter using a: sodium -1ide in a gel structure in various concentrations. In these immobilized preparations with

-0,6 В отн. Ag/AgCl электрода сравнени определ ют алкогольоксидазную активность в Е/г. Вычисл ют остаточную ферментативную активность (%) по сравнению с неиммобилизованным препаратом . Измерени провод т в 0,01 М фосфатном буфере, .рН 8,0 (1,0 М КС1, 1 мМ ЭДТА) в присут ствии 10 NM этилового спирта.-0.6 V Rel. Ag / AgCl reference electrodes determine alcohol oxidase activity in U / g. The residual enzyme activity (%) is calculated as compared with the non-immobilized preparation. Measurements are carried out in 0.01 M phosphate buffer, pH 8.0 (1.0 M KS1, 1 mM EDTA) in the presence of 10 NM of ethanol.

Полученные данные приведены в табл.2. The data obtained are given in table 2.

Данные, приведенные в табл.2, показывают , что при концентраци х азид натри 0,25-500 ммоль активность иммбилизованной алкогольоксидазы увеличиваетс в 1,5-40 раз по сравнению с ферментным препаратом, приготовленным без азида натри . При концентрации азида натри более 500 ммоль активность уже не увеличиваетс . Кроме того, увеличивать концентрацию нецелесообразно , так как гель при больших концентраци х азида натри становитс менее жестким, а следовательно , ухудшаютс механические свойства получаемых ферментных мембран. При эксплуатации менее жесткой ферментной мембраны фермент начинает вымыватьс из гел . Таким образом, оптимальные концентрации азида натри при изготовлении ферментной алкоголь- оксидазной мембраны 0,25-500 ммоль.The data given in Table 2 shows that, at a concentration of sodium azide of 0.25-500 mmol, the activity of the immobilized alcohol oxidase increases by 1.5-40 times compared with the enzyme preparation prepared without sodium azide. When the concentration of sodium azide is more than 500 mmol, the activity does not increase. In addition, it is impractical to increase the concentration, since the gel becomes less rigid at high concentrations of sodium azide, and, consequently, the mechanical properties of the resulting enzyme membranes deteriorate. When a less rigid enzyme membrane is used, the enzyme begins to wash out of the gel. Thus, the optimum concentration of sodium azide in the manufacture of the enzyme alcohol-oxidase membrane 0.25-500 mmol.

Активность иммобилизованной алкогольоксидазы зависит от рН буферного раствора, в котором провод тс измерени . При наличии в буферном растворе 10 мМ этилового спирта и.использу ферментную мембрану, приготовленную по примеру 1 с азидом натри в гелевой структуре 100 ммоль, при рН 6,0 ток электрода равен 12 нА, при рН 7,0 - 22 нА, при рН 7,5 - 27 нА, при рН 8,0-32,5 нА, при рН 8,5 - 35 нА, при рН 9,0 - 32,5 нА, при 10 - 20 нА. Таким образом, наилучшие результаты реализации способа получаны в буферных растворах рН 8,0-9,0. Пример 3. Дп определени стабильности иммобилизованной алкогольоксидазы изготавливают ферментную мембрану с использованием азида ,натри концентрации 500 ммоль и по известному способу по примеру 1 и определ ют зависимость тока электрода от продолжительности эксплуатации .The activity of the immobilized alcohol oxidase depends on the pH of the buffer solution in which the measurements are made. If 10 mM of ethanol is present in the buffer solution, using an enzyme membrane prepared according to Example 1 with sodium azide in a gel structure of 100 mmol, at pH 6.0, the electrode current is 12 nA, at pH 7.0 - 22 nA, at pH 7.5 - 27 nA, at pH 8.0-32.5 nA, at pH 8.5 - 35 nA, at pH 9.0 - 32.5 nA, at 10 - 20 nA. Thus, the best results of the implementation of the method obtained in buffer solutions pH 8.0-9.0. Example 3. Dp of determining the stability of immobilized alcohol oxidase make an enzyme membrane using azide, sodium concentration 500 mmol and using the known method of example 1 and determine the dependence of the electrode current on the duration of operation.

Полученные результаты приведены в табл.3 (концентраци этиловогоThe results are shown in Table 3 (the concentration of ethyl

спирта в чейке 0,5 мМ, другие услови аналогичны примерам 1, 2).alcohol in a cell of 0.5 mm, other conditions are similar to examples 1, 2).

Электроды, содержащие мембраны, работают в среднем по 8 ч сут при комнатных услови х. Остальное врем суток ферментные мембраны хран тс в буферном растворе при комнатных услови х.Electrodes containing membranes operate an average of 8 hours a day under room conditions. The rest of the day the enzyme membranes are stored in a buffer solution under room conditions.

Из табл.3 видно, что чувствительность электрода, приготовленного на основе иммобилизованной алкогольо сидазы по предлагаемому способу, в течение 1 мес эксплуатации уменьшаетс на 50%, тогда как мембрана, приготовленна по известному способу.From Table 3 it can be seen that the sensitivity of an electrode prepared on the basis of immobilized alcoholic sidase according to the proposed method is reduced by 50% within 1 month of operation, whereas the membrane prepared by a known method.

16.1517916.15179

полностью тер ет активность в°течение 10 дней.completely loses activity in ° for 10 days.

Claims

Invention Formula

The method of immobilizing alcoholic acid, comprising introducing alcohol oxidase from Candida boidinii to a gel structure containing serum and glutaraldehyde in a buffer solution, and then applying to a nuclear filter, characterized in that, in order to increase activity and stability, the structure was additionally injected with sodium azide at a concentration of 0.25-500 mmol, and immobilization was carried out at pH 8.0-9.0.

Table t

The amount of the lead on the p

.., „„. - "- pa" and tilo "ggs;„ mouth. ;;; g

: olI I ° 1 y 0

0,213

The known method 0.017 0.0330.0 "70.0700,107 0.1330,173

Offerings

JOLJLiJI.J | .J |.

I I Oh

... 1 .. „1 1 JJ °° J

.. о.з. о.о7о

0.9

1.3

1.7

".9

2.1

3.5

0.30

ten

0,213

Table 2

250

0.30

0. 1.08 1.00 0.93

3.5

ten

24

33

31

100 NM