SU1537689A1 - Штамм бактерий КLевSIеLLа рNеUмоNIае, используемый в качестве референс-штамма при определении антилизоцимной активности бактерий, и способ определени антилизоцимной активности бактерий - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к медицинской микробиологии и может быть использовано дл  прогнозировани  реконвалесцентного бактерионосительства. Цель изобретени  - ускорение способа и повышение точности при количественной оценке антилизацимной активности. Штамм KLEBSIELLA PNEUMONIAC выделен из объектов окружающей среды и депонирован под номером ГИСК N 151. Штамм несет плазмиду PAL_T-60, кодирующую синтез антилизоцимного фактора. Штамм инактивирует 20 мкг/мл лизоцима, показатель антилизоцимной активности А = 0,98. Референс-штамм N 151 и исследуемую культуру раздельно выращивают в жидкой питательной среде, затем смешивают с раствором лизоцима и суспензий MICROCOCCUS LUSODEIKTUCUS. Полученные смеси выдерживают в течение 25 - 30 мин. и измер ют оптическую плотность при длине волны 400±200 нм. Активность антилизоцимного фактора пр мо пропорциональна оптической плотности. Показатель А исследуемой культуры определ ют по формуле, сравнивают с показател ми А референс-штамма и определ ют концентрацию лизоцима, которую способна инактивировать исследуема  культура. 2 с.п. ф-лы.

Description

те в жидких питательных средах образует равномерную муть.

Физиолого-биохимические признаки.

Прототроф на минимальной среде с глюкозой растет в пределах 4-45°С. В качестве единственного источника углерода, кроме глюкозы, может использовать цитраты, мукаты, малонаты, фруктозу, галактозу, арабинозу, лак- тозу, сорбит и дульцит. Обладает уреазной и лизин-декарбоксилазной активностью. Восстанавливает нитраты до нитритов. Обусловливает положительную реакцию «Ьогес-Проскауэра. Желати- ну не разжижает. Гемолизина не образует .

Устойчивость к антибиотикам.

Бактерии устойчивы к канамицину (50 мкг/мл), ампициллину (500 мкг/мл), хлорамфениколу (50 мкг/мл) и сульфаниламидам (50 мкг/мл).

Антилизоцимна  активность.

Инактивируют 20 мкг/мл лизоцима, показатель А 0,98.

Стабильность антилизоцимного признака . При выращивании бактерии на МПА, содержащим 50 мкг/мл канамици- на или 5000 мкг/мл ампициллина, или 50 мкг/мл хлорамфеникола, получают микробные клетки, характеризующиес  высокой антилизоцимной активностью. Это св зано с тем, что гены, контролирующие антибиотикоустойчивость и синтез антилизоцимного фактора, ло- кализованы на одном репликоне плаз- миды .

Рестрикци  плазмиды , кодирующей синтез антилиэоцимного фактора , показала, что данна  плазмида имеет один сайт узнавани  дл  рест- риктаз EcoR 1 и Xho 1,16 - дл  Msp 1; 17 - KpN 1; 18 - Bglll и 20 - дл  эндонуклеазы Hind III. Дл  контрол  наличи  у бактерий референс штамма K.pneumoniae AB-86 плазмиды следует определить сохранение микробными клетками устойчивости к указанным антимикробным веществам, поскольку детерминанты резистентности нахо- д тс  на этом же плазмидном репликоне вместе с генами, детерминирующими антилизоцимную активность.

Способ осуществл ют следующим образом .

Референс-штамм и испытуемые бактериальные культуры выращивают раздельно в минимальной среде при шуттелиро- вании, отдел ют культуральную жип

кость от клеток центрифугированием. Надосадочную жидкость смешивают с суспензией клеток микрококка и раствором лизоцима. Выдерживают при комнатной температуре в течение 25-30 мин и измер ют оптическую плотность при длине волны 400±20 нм.

Активность антилизоцимного фактора пр мо пропорциональна оптической плотности. В качестве контролей используют смеси: без лизоцима (К,) - ее оптическую плотность принимают за плотность образца с полным подавлением действи  лизоцима; без культураль- ной жидкости (замененной стерильной минимальной средой) - после 30 мин инкубации при комнатной температуре (К) этот контроль соответствует полному отсутствию антилизоцимной активности (полное просветление).

Антилизоцимную активность (А) куль туральной жидкости исследуемого штамма рассчитывают по формуле (с точностью до второго знака)

А

Но -.

к, - v

0

о 5

5

где М0 - оптическа  плотность опытной смеси;

К

и К - оптические плотности первого и второго контролей.

Показатели А, равные 0,3 и выше, считаютс  положительными при учете антилизоцимной активности как эпид- маркера изучаемого штамма. Показатели, равные и выше 0,7, позвол ют отнести выделенный штамм к штаммам-бактери м, способным к длительному переживанию в услови х организма хоз ина, св занному с процессом реконвалесцентного бактерионосительства.

Пример. Референс штамм Klebsiella pneumoniae AB-86, несущий плазмиду рА , контролирующую синтез антилизоцимного фактора, выращивают в минимальной среде М9, содержащей на 1 л, %: Na2HP04 6,0; КН.РО 3,0; NH4C1 1.0; NaCl 0,5; глюкоза 1, рН 7,2-7,0. Дл  ауксотрофных штаммов примен ют добавки в стандартных концентраци х: аминокислоты 20 мкг/мл и витамины 1 мкг/мл. Можно использовать среду LB, содержащую на 1 л Bac-to-tryptou 10,0 г, дрожжевой экстракт 5,0 г, и Naf l 10,0 г. Бактерии,

выращенные при 37 С в течение 18 ч

(при шуттелировании 200 качаний/мин врем  можно сократить до 10 ч), осаж дают центрифугированием при 4000 об/ми в течение 20 мин. Взвесь клеточных стенок М.lysodeiktieus готов т известным способом. Можно использовать успенэию живых бактериальных клеток микрококка, выращенных в течение 18 ч, на 1,5% м сопептонном агаре с 1%-ной глюкозой, содержащей в 1 мл 1x101 микробных тел. Готов т рабочий раствор лизоцима, содержащего 100 мкг/мл препарата, в физиологическом растворе хлористого натри .

Объемное соотношение культурапь- ной жидкости, суспензии микрококка и раствора лизоцима составл ет 10:5:1. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 25-30 мин и измер ют оптическую плотность при длине волны 400120 нм.

Получают следующие показатели: Мо 0,94; К, 0,95; Кг 0,21.

Производ т расчет по формуле

А Ki

К1 Ч

ра в ный 0,98.

Штаммы, выдепенные при вну, рибол ничной инфекции, характеризуютс  различной степенью антилизоцнмной активности.

Штамм К.pneumoniae АВ-Нб обпадае наиболее выраженной антилизопимной активностью (А 0,98), котора  при использовании метода раститровки соответствует инактивации 20 мкг/мл лизоцимл.

Лабораторные штаммы E.coli К( могут быть использованы в качестве отрицательного контрол . Бактерии выращивают как описано в примере, и культуральную жидкость провер ют

1537689

на наличие антилнзоцимной активности в соответствии с указанной выше методикой тестировани  (пример).

-,„ - 0,35, Kf - 0,35, Кг

При этом получены следующие показатели: М0 0.35. К 20, А 0.

Все штаммы E.coli К-12 дают отрицательные показатели антилизоцимной активности.

Использование способа и нового референс-штамма позвол ет ускорить способ (1 сут вместо 48-72 ч) и повысить точность количественного оп- ределени  антилизоцимной активности бактерий.

Claims (2)

1.Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae ГИСК № 151, используемый в качестве референс-штамма при определении антилизоцимной активности бактерии.

2.Способ определени  антилизоцимной активности бактерий, включающий посев и выращивание исследуемой культуры в присутствии лизоцима и тест- культуры Micrococcus lysodeiktucus

и учет полученных результатов, о т- л и чающийс  тем, что, с целью ускорени  способа и повышени  точности при количественной оценке антилизоцимной активности, осуществл ют раздельное выращивание исследуемой культуры и референе-штамма Klebsiella pneumoniae ГИСК № 151 в жид- ких питательных средах, отдел ют су- пернатант и инкубируют последние с

суспензией тест-культуры и лизоцимом в течение 25-30 мин, а антилизоцим- ную активность определ ют по оптической плотности инкубированных суспензий .