SU1518369A1

SU1518369A1 - Method of strain of hybrid mus musculus cells used for producing monoclonal antibodies to hemagglutinine of measles virus

Info

Publication number: SU1518369A1
Application number: SU874327453A
Authority: SU
Inventors: Отар Георгиевич Анджапаридзе; Фирая Галиевна Нагиева; Неля Николаевна Мальцева; Светлана Леонардовна Ведунова; Анатолий Юрьевич Звонарев; Нина Ивановна Краснова; Вера Григорьевна Никулина; Елена Петровна Баркова; Галина Владимировна Эткинд; Елена Ивановна Кузнецова; Елена Глебовна Ходоровская
Original assignee: Московский научно-исследовательский институт вирусных препаратов
Priority date: 1987-10-19
Filing date: 1987-10-19
Publication date: 1989-10-30

Abstract

Изобретение относитс к области гибридомной технологии и может быть использовано дл создани диагностических препаратов. Цель изобретени - получение мышиной лимфоцитарной гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела (монАТ) к гемагглютинину вируса кори, которые обладают высокой авидностью и про вл ют иммунологическую активность в нескольких реакци х. МонАТ могут быть использованы в качестве иммунодиагностикумов. Штамм депопирован под номером ВСКК(П) N148Д. ПРОДУЦИРУЕТ МОНАТ КЛАССА JGG2A, СПЕЦИФИЧНЫЕ К ГЕМАГГЛЮТИНИНУ ВИРУСА КОРИ. МОНАТ ВЫЯВЛЯЮТ В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ, АКТИВНОСТЬ В ИФА 1:72000. Продукци антител сохран етс в течение 50 пассажей. На основе монАТ к гемагглютинину вируса кори создан пероксидазный конъюгат, который может быть использован дл вы влени JGM и JGG антител человека к вирусу кори. 2 табл.The invention relates to the field of hybridoma technology and can be used to create diagnostic products. The purpose of the invention is to obtain a murine lymphocyte hybridoma producing monoclonal antibodies (monAT) against the hemagglutinin of the measles virus, which have a high avidity and exhibit immunological activity in several reactions. MonAT can be used as immunodiagnostics. The strain is deposited under the number VSKK (P) N148D. PRODUCE MONAGES CLASS JGG2A, SPECIFIC TO HEMAGGLUTININ KORI VIRUS. MONAT DISCOVER IN IMMUNO-ENERGY ANALYSIS, ACTIVITY IN ELISA 1: 72000. Antibody production is maintained for 50 passages. Based on the monat against hemagglutinin of the measles virus, a peroxidase conjugate was created that can be used to detect human JGM and JGG antibodies to the measles virus. 2 tab.

Description

Изобретение относитс к гибридом- ной технологии и может быть использовано дл создани диагностических препаратов.The invention relates to hybridoma technology and can be used to create diagnostic products.

Цель изобретени - получение мышиной лимфоцитарной гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела (монАТ) к гемагглютинину вируса кори, которые обладают высокой авидностью и про вл ют иммунологическую активность в нескольких реакци х.The purpose of the invention is to obtain a murine lymphocyte hybridoma producing monoclonal antibodies (monAT) against the hemagglutinin of the measles virus, which have a high avidity and exhibit immunological activity in several reactions.

Штамм получают следующим образом.Strain was prepared as follows.

Самок мышей линии BALB/c массой 8-10 г иммунизируют внутрибрюшинно двукратно с интервалом в две неделиFemale BALB / c mice weighing 8-10 g are immunized intraperitoneally twice with an interval of two weeks

цельным частично очищенным препаратом вируса кори, пропассированным в первичной культуре клеток эмбрионов понских перепелов, выращенных на микроносител х ДЕАЕ - сефадексwhole partially purified preparation of measles virus, passive in the primary cell culture of Japanese quail embryos grown on DEAE microspecies - Sephadex

А-50.A-50.

Первую иммунизацию провод т вирусным антигеном в полном адъюванте Фрейнда в дозе 5,0 Ij на мышь, втора иммунизаци - в той же дозе в неполном адъюванте Фрейнда. За три дн до сли ни интраорбитально ввод т 0,1 МП вирусосодержащего материала в солевом растворе в дозе 4,0 Ij на мышь.The first immunization is carried out with viral antigen in Freund's complete adjuvant at a dose of 5.0 Ij per mouse, and the second immunization is given in the same dose in Freund's incomplete adjuvant. Three days before the fusion, 0.1 MP of virus-containing material was added intraorbital in saline solution at a dose of 4.0 Ij per mouse.

СЛSL

0000

со а соwith and with

В качестве злокачественного партнера используют мьппиную лимфоцитар- ную линию NSO в фазе логарифмического роста, Миеломные клетки выраЕ1ивают в среде RPMI-I640 с 0,13% NaHCOj, глюкозой до 4 г/л, 5% сыворотки эмбрионов коров и 57о сыворотки су гных овец (очищены полиэтиленгликолем), пируватом натри 0,05 мг/л, оксало- ацетатом 0,15 мг/л, инсулином 0,2 ед/мл, 2-меркаптоэтанолом 5 0 М, HEPES 5-10 мМ, гентамицином 50 мкг/мл, Имунные спленоциты получают на третий день после бустерног инъекции антигена из стерильно извлеченных селезенок, Спленоциты извлекают путем мисггократного введени в пульпу селезенки 0,1-0,2 мл холодной ростовой среды RPMI-1640 с помощью тонкой иглы со шприцем. Извлечение спленоциты собирают в пластиковые охлажденные пробирки, осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин, осадок клеток с эритроцитами обрабатывают в течение 5 мин на холоду 0,8 3%-ным раствором Ш 4С1 в п тикратном объеме, Поспе лизиса эритроцитов клетки повторноThe NSP lymphocytic line in the logarithmic growth phase is used as a malignant partner. Myeloma cells are expressed in RPMI-I640 medium with 0.13% NaHCOj, glucose up to 4 g / l, 5% serum of cow embryos and 57o serum of dried sheep ( purified by polyethylene glycol), sodium pyruvate 0.05 mg / l, oxaloacetate 0.15 mg / l, insulin 0.2 u / ml, 2-mercaptoethanol 5 0 M, HEPES 5-10 mM, gentamycin 50 µg / ml, Immune splenocytes are obtained on the third day after the booster injection of antigen from sterile-extracted spleens. Splenocytes are extracted by misggo selfless administration in the pulp of spleen of 0.1-0.2 ml of cold growth medium RPMI-1640 with a thin needle with a syringe. Extraction of splenocytes collected in plastic cooled tubes, precipitated by centrifugation at 1000 rpm for 10 min, the cell sediment with erythrocytes is treated for 5 min in the cold with 0.8 3% solution of W 4C1 in five-fold volume, cell erythrocyte sedimentation again

саждают и дважды промывают в бессы- вороточной среде RPMI- 640c Дл сли ни используют 50%-ный раствор поли- этиленгликол с м,в, 1000, Иммунные спленоциты сливают с клетками NSO в соотношении 4:1 и распредел ют на двадцать 96-луночных пластик со сло- ем-кормилкой из непммунных спленоци- тов. Селекцию гибридных клеток провод т в среде HATj составленной ил ростовой сроды с И гипоксантина (Н) sulphate and rinsed twice in a non-collar RPMI-640c medium. Fusion solution of 50% polyethylene glycol with m, b, 1000 is used for fusion. Immune splenocytes are fused with NSO cells in a 4: 1 ratio and distributed onto twenty 96-well wells. a plastic with a feeding layer of non-immune splenocytes. The selection of hybrid cells is carried out in HATj medium compiled by a sludge growth agent with hypoxanthine (H)

I ,6 -lO М тимидина (Т) и 4 амино- птерпна (А),I, 6-lO M thymidine (T) and 4 amino pterpna (A),

Начина с трех суток с момента культивировани и в последующие дни, в лунки культуральных пластин каждые дн внос т по 2 капли свежей сепективной среды или из пластин удал ют 0,1 мл культуральной среды и замен ют на свежую. Начина с 20 сут с момента культивировани , клетки из лунок, в которых наблюдаетс рост гибр1здньгх клеток, пересевают в 24-лу ночные пластины со слоем-кормилкой из неиммунных спленоцитов. Неиммунные спленоциты ресуспендируют в гиб- ридомной среде ИХ (селективна среда без аминоптерина) и по 0,1 чл распредел ют в 24-луночные пластины (спленоциты, полученные от однойStarting from three days after cultivation and on the following days, 2 drops of fresh seperate medium are added to the wells of the culture plates every day or 0.1 ml of culture medium is removed from the plates and replaced with fresh. Starting from the 20th day from the moment of cultivation, the cells from the wells, in which the growth of hybrids cells is observed, are subcultured into 24-well night plates with a feeding layer of non-immune splenocytes. Non-immune splenocytes are resuspended in hybridoma IC (selective medium without aminopterin) and distributed to 24-well plates (splenocytes obtained from one

М1.1ШИ, распредел ют на две 24-луночные пластины), Кпоны гибридных клеток , раступще в 24-луночных пластинах со слоем-кормилкой, выращивают до фор№1ровани сплошного сло , а затем клетки пересевают в 24-луночные nnacTHiibi без сло -кормилки, После формировани сплошнот о сло клеток провод г первичный скрининг культуральных жидкостей на наличие вирусо- специфических антител в твердофазном иммyнoфep eнтнoм анализе (PiOA), В качестве твердой фазы используют клетки Vero, инфицированные вирусом кори, штамм Л-16, Антителопродуцирую щие клоны гибридных миелом выр. ;щипаю в пластикоиых флаконах площадью 25 см со слоем-кормилкой из сплеио- цитоп и после накоппени клеток в достаточном количестве (сплогинор покрытие ростовой поперхно; ти флакона) провод т оценку монАТ и культуральных жидкост х на активность и слеЦ;-:- фичность. По данным проведенного ис- сле17,овапи осуществл ют пыбор кленов дл их накоплени в массовой в:ульту- ре и криоконсервацир.M1.1SHI, distributed into two 24-well plates), Hypon cell hybrid plates, placed in 24-well plates with a feeding-bed, grown to form a continuous layer, and then the cells are subcultured into 24-well nnacTHiibi without a feeding-bed After forming a solid layer of cells, the wire and primary screening of culture fluids for the presence of virus-specific antibodies in a solid phase immunoassay (PiOA). Vero cells infected with the measles virus, strain L-16, Antibody-producing hybrid clones of the myeloma are used as the solid phase.vyr. I tweeted in plastic bottles with an area of 25 cm with a nourishment layer from the spliocytope and after accumulating enough cells (sporinor growth cover surface; such bottles) assessed monat and culture fluids for activity and slet; -: - ficity. According to the data of the study17, ovapi carry out a sampling of maples for their accumulation in the mass in: ultrasound and cryopreservation.

В результате счи шш получена коллекци гибридов, продуцирушщтх -.jbAT к вирусу кори ( штамм Л-16),. Из них практический интерес представл ю гпбридома ВК-93,2, г{онАТ класса IgG 2а, Hanyjai fHHbie к гемагглютинину р-нруса корИ: Харак- TtTpHCTHKa активности иммуFIOглобул - HOR, продуцируеЬмх г-нбр домоч ВК- 93,2; представлена в табл,1,As a result, a collection of hybrids, produced by -.jbAT against the measles virus (strain L-16), was obtained. Of these, of practical interest are the gpbridoma VK-93.2, g {onAT class IgG 2a, Hanyjai fHHbie to hemagglutinin r-nrusa korI: Harak-TtTpHCTHKa activity immunofloglobule - HOR, produced by gnbr-BK- 93 is presented in table, 1,

Приведенные данные позвол ют заключить , что монАт, продуцируемие гибридомой ВК-93„2, обладают одинаки вой высокой реактивностью с двум исследованными штз 1мами вируса кори (штамм Л-16 и Ш гамм LEC-вирус KOIJH) в различных тестах и не вы вл ют вирус чумы плото дных (штамм ЭГМ)«These data allow us to conclude that the monatabates produced by hybridoma VK-93 „2 have the same high reactivity with the two studied strain of 1m of the measles virus (strain L-16 and W gamma LEC-virus KOIJH) in various tests and do not reveal carnivorous plague virus (strain EGM) "

Штамм гибридомь депонирован под номером BCKJ (И) № 148Д и имеет следующие признаки,Strain hybridoma deposited under the number BCKJ (I) No. 148D and has the following characteristics

Культуральные признаки.Cultural features.

Стандартные услови выращивани о Среда дн культивировани - RPMI-164 с 0,13 MaHCOj, глюкозой до 4 г/л, 5% сыворотки эмбрионов коров и 5% сыворотки су гных овец (очищенна с помощью полиэтиленгликол ),, пируватом натри 0,05 иг/мл, оксалоацетатом 0,15 иг/мл, инсулином 0,2 ед/мл, 2-мегкаптоэтанолом 5-10 М. HFPESThe standard cultivation conditions for medium-day cultivation are RPMI-164 with 0.13 MaHCOj, glucose up to 4 g / l, 5% serum of cow embryos and 5% serum of dried sheep (purified with polyethylene glycol), sodium pyruvate 0.05 Ig / ml, oxaloacetate 0.15 g / ml, insulin 0.2 units / ml, 2-megaptoethanol 5-10 M. HFPES

5-10 мМ. Температура культивировани 36,5 С. Клетки растут в суспензии, обладают слабой адгезивной способностью к поверхности пластика или стекла. Посевна доза 200-300-10 клеток/мл, кратность рассева 1:4-1:6 два раза в неделю.5-10 mM The cultivation temperature of 36.5 C. The cells grow in suspension, have a weak adhesive ability to the surface of plastic or glass. A seeding dose of 200-300-10 cells / ml, the multiplicity of sowing 1: 4-1: 6 twice a week.

Культивирование гибридомы в организме животного.Cultivation of hybridoma in the animal.

Самок мышей линии BALB/c в возрасте 2-2,5 мес сенсибилизируют 0.5 мл пристана внутрибрюшинно за 7-10 дней до введени 2-4-10 гибридных клеток, через 10-14 дней формируетс асцитна опухоль. Перевиваемост гибридомы в 100% случаев.Female BALB / c mice aged 2-2.5 months are sensitized with 0.5 ml of pristan intraperitoneally 7-10 days before the introduction of 2-4-10 hybrid cells, and an ascites tumor is formed 10-14 days later. Hybridoma wearability in 100% of cases.

Характеристика полезного продуктаCharacteristics of a useful product

Гибридт лини ВК-93.2 продуцирует моноклональные антитела, вы вл емые в иммуноферментном анализе (ГТФА), п рс-акции непр мой иммунофлуо ресценции (НИФ), в реакции торможени гемаглютинации (РТГА), в реакции нейтрализации на культуре клеток (Н).VK-93.2 hybrid line produces monoclonal antibodies detected in the enzyme-linked immunosorbent assay (GTPA), prs-actions of indirect immunofluorescence (NIF), in the reaction of haemaglutination inhibition (RTGA), in the neutralization reaction on cell culture (H).

Активность антител в иммунных ас- цитных жидкост х: в ИФА - 1:720000; н НИФ - 1:32000; в РТГА - 1:5120; ;з РН -1:64 МонАТ относ тс к классу и гмуноглобулинов G2a. Стабильность продуцировани антител сохран етс на прот жении 50 пассажей в культуре клеток (врем наблюдени ) и 6 пассажей на мьшах линии BALB/c (врем наблюдени ) .Antibody activity in immune ascitic fluids: in ELISA - 1: 720000; n NIF - 1: 32000; in rtga - 1: 5120; ; PH -1: 64 MonAT is classified as G2a immunoglobulin. Antibody production stability is maintained for 50 passages in the cell culture (observation time) and 6 passages on the BALB / c lines (observation time).

Способ криоконсервации.Method of cryopreservation.

Среда дл замораживани включает сыворотку эмбрионов коров 90%, ди- метилсульфоксид 10%. 1 мл клеточной суспензии с плотностью не ниже 2-10 жизнеспособных клеток, ресуспендиро- ван1{ых в холодном криоконсерванте, перенос т в пластиковые 1,8-мнллит- ровые ампулы, укладывают в пеноплас- тиковую коробку с толщиной стенок не меньше 1,5 см и немедленно помещают на холод - (-70 )-(-80 )° С, .На следующие сутки ампулы перенос т в жидкий азот Замороженные ампулы оттаивают в воде с температурой 37-39°С. Клетки развод т в 10 раз сывороткой эмбрионов корон или су гных овец и осаждают центрифугированием при 500 об/мин в течение 10 мин. Восстановленные клетки ресуспендируют в ростовой среде в концентрации 2.5 The freezing medium comprises bovine fetal serum 90%, dimethyl sulphoxide 10%. 1 ml of cell suspension with a density of not less than 2-10 viable cells resuspended in cold cryopreservation is transferred to plastic 1.8 ml ampoules, placed in a foam box with a wall thickness of not less than 1.5 cm and immediately placed in the cold - (-70) - (- 80) ° С. On the following day the ampoules are transferred to liquid nitrogen. The frozen ampoules are thawed in water with a temperature of 37-39 ° С. Cells were diluted 10-fold with serum from coronary or dried sheep embryos and pelleted by centrifugation at 500 rpm for 10 minutes. Recovered cells are resuspended in growth medium at a concentration of 2.5

40--3,0-10 жизнеспособных клеток в 1 мл, перенос т в пластиковые куль- туральные флаконы. Жизнеспособность40--3.0-10 viable cells in 1 ml, transferred to plastic culture vials. Viability

после размораживани составл ет 60- 70% и устанавливаетс по дифференциальной окраске клеток с помощью 0,25%-ного раствора трипанового синего , приготовленного на физиологическом фосфатно-буферном растворе, рН 7,2-7,3.after thawing, it is 60-70% and is determined by differential staining of the cells with a 0.25% trypan blue solution prepared in physiological phosphate-buffer solution, pH 7.2-7.3.

Пример 1. На сонове монАТ, продуцируемых гибридомой ВК-93,2, создан диагностический препарат пероксидазный конъюгат дл иммуно- ферментного анализа. Основной дл его получени вл етс иммунна асцитна жидкость (ИАЖ) с титром в ИФА 0,72-10. Иммуноглобулины из ИАЖ высолены с помощью 50%-ного сульфата аммони а Фракци IgG очищена методом аффинной хроматографии на белке А - сефарозе 4В,Example 1. A monoAT produced by hybridoma VK-93.2 created a diagnostic peroxidase conjugate for immunoassay. The main one for its preparation is immune ascites fluid (IAG) with a titer in ELISA 0.72-10. IAGI immunoglobulins are salted with 50% ammonium sulfate and the IgG fraction is purified by affinity chromatography on protein A - Sepharose 4B,

В табл. 2 представлены результатыIn tab. 2 presents the results

экспериментов по идентификации вируса кори в пр мом иммуноферментном анализе с помощью конъюгата на основе монАТ, продуцируемых гибридомой ВК-93.2„experiments on the identification of the measles virus in direct enzyme immunoassay using a monaton-based conjugate produced by hybridoma VK-93.2

Как видно из табл.2, конъюгат, приготовленный на основе ИАЖ, содержащей монАТ к гемагглютинину, вируса кори (штамм Л-16), специфически вы в ет вирус кори (штамм Л-16, и вирусAs can be seen from Table 2, a conjugate prepared on the basis of an IAG containing heAMglutinin monAT, a measles virus (strain L-16) specifically detects the measles virus (strain L-16, and

кори (штамм LEC) и не вы вл ет вирус чумы плото дных.measles (strain LEC) and does not detect the plague virus.

Использование гибридомы позвол ет получать монАТ, специфичные к гемаг- глютинину вируса кори.The use of hybridoma makes it possible to produce monat specific to hemaglutinin measles virus.

Claims

Invention Formula

Strain of hybrid cells of animals us rausculis BCKK (II) N 148L, used to produce monoclonal antibodies to the hemagglutinin of the measles virus.

Table 1

Characterization of monoclonal immunoglobulins produced by hybridoma VK-93,2, by specificity and antibody activity in various tests

Ability Antibody activity in immune ascites to react with fluids in various tests (given with strain values)

measles virus gg

IFA MFA RTGA PH in vitro

L-16 720-10 32-10 5-10 Not studied LEG 720-10 32-10 Neissle 6.4-10

doov

Control: Plague Disease Virus (EPM strain) (control) 0000

Notes: ELISA - ELISA;

MFA - fluorescent antibody method; Rtga - hemmagglutination inhibition reaction; PH is a neutralization reaction,

Table 2

Determination of the activity and specificity of peroxidase conjugate prepared on the basis of monat produced by hybridoma VK-93.2, with various antigens

Antigens Optical density at 492 nm with dilutions

1: 200 I 1: 400 1: 800 1: 1600 1: 3200 1: 7400 1: 14800

Measles virus

(strain L-16) 1,513 1,165 0,923 0,598 0,398 0,261 0,239 Measles virus

(LEC strain) 1.554 1.322 1.227 0.887 0.630 0.379 0.27 Plague virus

cartods 0.363 0.281 0.260 0.250 0.103 0.096 0.071 Uninfected Vero cells 0.091 0.08 0.06 0.03 0.02 0.02 0.02

Compiled by A. Manykin Editor M. Petrova Tehred M. Khodanich Proofreader M. Maksimishinets

r - rm1-- - - -

Order 6568/31 Circulation 501 Subscription

VNIIPI State Committee for Inventions and Discoveries under the USSR Committee on Scientific and Technical Information 113035, Moscow, Zh-35, Raushsk. 4b, 4/5

Production and Publishing Combine Patent, Uzhgorod, st. Gagarin, 101