SU1439124A1

SU1439124A1 - Method of extracting bacteria dna

Info

Publication number: SU1439124A1
Application number: SU874222305A
Authority: SU
Inventors: Андрей Валентинович Дроздов; Олег Тихонович Можаров; Павел Иванович Анисимов
Original assignee: Всесоюзный научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"
Priority date: 1987-04-03
Filing date: 1987-04-03
Publication date: 1988-11-23

Abstract

Изобретение относитс к области молекул рной биологии и биотехнологии и может быть использовано в ген но-инженерных работах и бактериологических исследовани х. Целью изобретени вл етс упрощение способа вьще- лени ДНК из бактериальных клеток, улучшение качества целевого продукта И повышение безопасности работы с патогенными микроорганизмами. Основное отличие предложенного способа состоит в том, что весь процесс выделени ДНК провод т в один этап в закрытой центрифужной пробирке. После одномоментной загрузки всех компонентов не требуетс никаких манипул ций с лизатом вплоть до сбора целевого продукта . Этим достигаетс сокращение числа операций в ходе процедуры вьще- лени , а также уменьшение времени контакта, исследовател с исходным материалом . Принципиально важным методическим приемом, обеспечивающим возможность одноэтапного вьщелени ДНК, вл етс способ внесени бактериальных клеток в центрифужную пробирку. Материал помещают между двум сло ми лизирующей смеси, нижний из которых наслоен непосредственно на поверхность раствора хлористого цези . Предложенный метод лизиса клеток позвол ет отказатьс от перемешивани лизата и предотвратить повреждающие гидродинамические воздействи на освобождающиес молекулы ДНК, а также обеспечивает полное освобождение ДНК из св зи с РНК и белком. Вследствие этого целевой продукт содержит меньше повреждений и в меньшей степени, чем в случае использовани известного способа, загр знен примес ми. Благодар тому, что полнота лизиса в данном случае может регулироватьс путем изменени времени контакта клеток с лизирующей смесью, изобретение может быть использовано не только дл получени плазмидной ДНК, но и дл вьщелейи хромосомного материала. 2 3 . п. лы. S (Л 4; соThe invention relates to the field of molecular biology and biotechnology and can be used in gene engineering and bacteriological studies. The aim of the invention is to simplify the method of inducing DNA from bacterial cells, improving the quality of the target product, and improving the safety of working with pathogenic microorganisms. The main difference of the proposed method is that the entire DNA extraction process is carried out in one stage in a closed centrifuge tube. After the simultaneous loading of all the components, no manipulation with the lysate is required up to the collection of the target product. This achieves a reduction in the number of operations during the implementation procedure, as well as a reduction in the contact time of the researcher with the starting material. A fundamentally important methodological approach, which allows one-step DNA separation, is the method of introducing bacterial cells into a centrifuge tube. The material is placed between two layers of the lysis mixture, the lower of which is layered directly on the surface of the cesium chloride solution. The proposed method of cell lysis allows one to refuse to mix the lysate and prevent damaging hydrodynamic effects on the released DNA molecules, and also ensures the complete release of DNA from binding to RNA and protein. As a result, the target product contains less damage and to a lesser extent than in the case of using a known method, is contaminated with impurities. Due to the fact that the completeness of lysis in this case can be regulated by changing the time of contact of the cells with the lysing mixture, the invention can be used not only to obtain plasmid DNA, but also to make a chromosomal material. 2 3. ly S (L 4; with

Description

Изобретение относитс к области молекул рной биологии и биотехнологии и может быть использовано в генно- инженерных работах и бактериологических исследовани х.The invention relates to the field of molecular biology and biotechnology and can be used in genetic engineering and bacteriological studies.

Целью изобретени вл етс упрощение способа выделени ДНК из бактериальных клеток, улучшение качества целевого продукта и повьюение безопас- ю нести работы с патогенными микроорга- низмамиоThe aim of the invention is to simplify the method of isolating DNA from bacterial cells, improving the quality of the target product and ensuring that work with pathogenic microorganisms is carried out safely.

По предлагаемому способу весь процесс выделени ДНК провод т в один этап в закрытой центрифужной пробир- 15 ке. После одномоментной загрузки всех компонентов не требуетс никаких по- следуЮ1цих манипул ций с лизатом вплоть до сбора целевого продукта. Этим дос- тигаетс сокращение числа операций в 20 ходе процедуры выделени целевого продукта, а также уменьшение времени контакта исследовател с исходным материалом, что приобретает особое значение при использовании дл выде- 25 ленй ДНК патогенных штаммов.According to the proposed method, the entire DNA extraction process is carried out in one step in a closed centrifuge tube. After the simultaneous loading of all the components, no subsequent manipulations with the lysate are required, up to the collection of the target product. This achieves a reduction in the number of operations in the course of the procedure for isolating the target product, as well as a decrease in the contact time of the researcher with the source material, which is of particular importance when pathogenic strains are used for DNA extraction.

Бактериальные клетки внос т в центрифужную пробирку между двум сло ми лизирующей смеси, нижний из которых наслоен непосредственно на зО поверхность раствора хлористого цези . Этим достигаетс м гкий и глубокий лизис, при котором ДНК полностью освобождаетс из клетки и легко отдел етс от прочих продуктов деструкции клетки при последующем ультрацентрифугировании .Bacterial cells are introduced into a centrifuge tube between two layers of the lytic mixture, the lower of which is layered directly on the ZO surface of the cesium chloride solution. This results in a soft and deep lysis, in which the DNA is completely released from the cell and is easily separated from other products of cell destruction during subsequent ultracentrifugation.

Такое внесение материала позвохи- ет отказатьс от перемешивани лиза- 40 та и предотвратить повреждающие гидродинамические воздействи на освобо - дившуюс ДНК, В результате применени указанного методического приема пол-учаемьй продукт содержит меньше 00-45 вреждений и в меньшей степени, чем в случае использовани известного ело-- соба, загр знен примес ми ДНК и б(ш- ка.Such introduction of the material allows refusing the lysing of the lasers and preventing the damaging hydrodynamic effects on the released DNA. As a result of using this methodological technique, the sex-training product contains less than 00-45 damage and to a lesser extent than in the case of using the known It is sob, contaminated with DNA and B impurities.

Предлагаемый способ позвол ет ре- о гулировать полноту лизиса путем изменени времени инкубации клеток с лизирующей смесью, а следовательноо в отличие от известного может быть использован не только дл получени гг плазМИД, но и дл выделени хромосомной ДНК, Дополнительное обогащение продукта н: ткным типом ДНК (хромосомной или 1-шазмидной) осуществл етс за счет изменени температурного режима при центрифугировании.The proposed method allows one to regulate the completeness of lysis by changing the incubation time of the cells with the lysing mixture, and therefore, unlike the known, can be used not only to obtain plasmid gg, but also to isolate chromosomal DNA. Additional enrichment of the product of n: tissue type (chromosomal or 1-shazmidnoy) is carried out by changing the temperature regime during centrifugation.

Пример 1. Выделение плазмиды рПС 4К из Escherichia coli НЕ 101.Example 1. The selection of plasmids rPS 4K from Escherichia coli NOT 101.

Культуру бактериальных клеток выращивают на двух флаконах с 75 мп скошенного агара Хоттингера, рН 7,2, в течение суток при 37 С. Клетки смывают с агара 3 мл физиологического раствора.The culture of bacterial cells is grown on two bottles with 75 ml of skewed agar of Hottinger, pH 7.2, for a day at 37 C. The cells are washed off with agar 3 ml of saline.

В 36-миллилитровую полиапломерную центрифужную пробирку внос т 25 мл раствора: хлористьй цезий 25 г, бромистый этидий 2 мл (из основного расвора 5 мг/мп), TES-буфер 15 мл (состав TES-буфера: трис(гидроксиметил- аминометан) 5 мМ,динатриева соль зтилендиаминтетрауксусной кислоты ЭДТА 0,5 мМ, NaCl 5 мМ, рН 8,0). На поверхность раствора хлористого цези наслаивают 3 мл лизирующей смеси: бридж-58 1%, дезоксихолат натри 0,5%, додецилсульфат натри 0,1%, ЭДТА 10 мМ, лизоцим 5 мг/мл, бромистый этидий 0,5 мг/мл, трис 50 tM, рН 8,0. Уравновешивают пробирки, затем наслаивают 3 мл взвеси культуры в физиологическом растворе и еще 2 мл лизирующей см.еси. Помещают , про бирки в ротор, вьщерживают 3 ч при комнатной температуре, затем центрифугируют в ультрацентрифуге при 40000 об/мин (140000 g) при 10 с в течение 40 ч.A 25 ml solution is added to a 36 ml polyaplomer centrifuge tube: cesium chloride 25 g, ethidium bromide 2 ml (from the basic solution 5 mg / mp), TES buffer 15 ml (composition TES buffer: tris (hydroxymethylaminomethane) 5 mM, disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid EDTA 0.5 mM, NaCl 5 mM, pH 8.0). 3 ml of lysing mixture is layered on the surface of the cesium chloride solution: bridge-58 1%, sodium deoxycholate 0.5%, sodium dodecyl sulfate 0.1%, EDTA 10 mM, lysozyme 5 mg / ml, ethidium bromide 0.5 mg / ml, Tris 50 tM, pH 8.0. Balance the tubes, then layered 3 ml of the suspension of the culture in saline and another 2 ml of lysing cm. Place the tags in the rotor, hold it at room temperature for 3 hours, then centrifuge in the ultracentrifuge at 40,000 rpm (140,000 g) at 10 s for 40 hours.

После центрифугировани пробирки облучают ультрафиолетовым светом и визуально определ ют наличие плаз- мидной суперспирализованной ДНК, Затем прокалывают стенку пробирки иглой от шприца и собирают ДНК.After centrifugation, the tubes are irradiated with ultraviolet light and the presence of plasmid supercoiled DNA is visually determined. Then the wall of the tube is punctured with a needle from a syringe and the DNA is collected.

Собранную ДНК освобождают от бромистого этиди и переосаждают этанолом по известной методике. Преципита раствор ют в 500 мкл TES-буфера и 1 мкл этого раствора подвергают анализу методом электрофореза в 0,7%-но агарозном геле.The collected DNA is freed from ethidium bromide and replanted with ethanol using a known method. The precipitate is dissolved in 500 µl of TES buffer and 1 µl of this solution is analyzed by electrophoresis on a 0.7% agarose gel.

П р и м е р 2. Выделение плазмид большой молекул рной массы.Example 2: Isolation of plasmids of high molecular weight.

Используют штаммы lersinia pestis несущие плазмиды pFtra/Tox ( 65 MD) pCad (47 МД), R.Pu (38 МД).The lersinia pestis strains carrying plasmids pFtra / Tox (65 MD) pCad (47 MD), R.Pu (38 MD) were used.

Культуру выращивают аналогично примеру 1, но при 28 С 2 сут. Выделение ДНК провод т в тех же услови х, что и в примере 1,The culture is grown analogously to example 1, but at 28 C 2 days. DNA isolation was carried out under the same conditions as in example 1,

В отличие от мультикопийной плаз- ды рИК 4К крупные плазмиды представпены в клетке лишь единичным репли- коном, поэтому выход ДНК из одинакового количества биомассы соответственно меньше.In contrast to the multi-copy plasm ics 4K, large plasmids are represented in the cell only by a single replicon; therefore, the DNA yield from the same amount of biomass is correspondingly lower.

Пример 3. Выделение хромосо- мальной ДНК из Vibrio cholerae eltor RV 79.Example 3. Isolation of chromosomal DNA from Vibrio cholerae eltor RV 79.

Выделение ведут аналогично примеру 1, но врем лизиса составл ет 1,5 ч, а центрифугирование провод т при 20°С.The isolation was carried out analogously to example 1, but the lysis time was 1.5 hours, and the centrifugation was carried out at 20 ° C.

Таким образом, использование изобретени дает возможность получать высокоочищенную плазмидную и хромосомную ДНК более простым и безопасным, по сравнению с известными, способом.Thus, the use of the invention makes it possible to obtain highly purified plasmid and chromosomal DNA in a simpler and safer way than the known method.

Claims

1. A method for isolating bacterial DNA, comprising lysing cells with a mixture of detergents and lysozyme and ultracentrifuging in a density gradient of cesium chloride with ethidium bromide, characterized in that, with

the aim is to simplify the way

the quality of the target product and the safety of working with pathogenic microorganisms, the bacterial cells are placed between two layers of a lyse mixture, layered on the surface of the cesium chloride solution, and the DNA extraction process is carried out in one step in a closed centrifuge tube.

2. The method according to claim 1, wherein the dp extraction of plasmid DNA lysis is carried out for 3-4 hours.

3. The method according to claim 1, characterized by the fact that in order to isolate chromosomal DNA, lysis is carried out for 1-1.5 hours, and centrifugation is performed at a temperature of 18-22 s.