SU1370136A1 - Способ диссоциации клеток гиппокампа - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к области биотехнологии и может быть использовано дл  получени  диссоциированных клеток животной ткани. Цель изобретени  - удлинение срока переживани  клеток в суспензии и улучшение электрофизических характеристик и хемочувствительнос- ти мембран. Сущность способа сводитс  к тому, что исходную ткань подвергают ферментативной обработке, использу  комплекс протеаз грибного происхождени . Отмывку фермента, его инактивацию и механическую диссоциацию клеток осуществл ют в модифицированном растворе Рингера. Срок переживани  нейронов в суспензии до 6 ч. Пор док сохранившихс  дендритов третий. (Л

Description

ее

00

0)

11

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано дл  получени  диссоциированных клеток животной ткани.

Цель изобретени  - удлинение срока переживани  клеток в суспензии и улучшение электрофизических характеристик и хемочувстрительности мембран .

Способ иллюстрируетс  следующим примером.

Пример. Крыс 2-3-недельного возраста декапитируют, извлекают гип покамп. Гиппокамп перенос т в раствор А следующего состава, ммоль: NaCl 150; КС1 4; HEPES 20; глюкоза 10 моль. В этом растворе ткань рассекают на поперечные срезы толщиной 200-300 мкм. Срезы инкубируют в растворе фермента. В качестве фермента дл  дальнейшей обработки исходной ткани используют комплекс щелочных протеаз гриба Aspergillus oryzae - амилоризин П20х, в концентрации 0,1- 1,5% в солевом растворе Б следующего состава, ммоль: NaCl 150; КС1 4; МаНСО.з26; глюкоза 10; концентраци  свободного 10 моль задаетс 

концентраци ми CaCl 0-1,8 ммоль и этш1енгликольтетрауксусной кислотой (ЭГТА) 1,0 ммоль. После растворени  HEPES рН исходного раствора довод т до 7,4 при помощи NaOH. При приготовлении исходного раствора ЭГТА 100 ммоль навеску ЭГ ТА раствор ют в бидистиллированной воде, добавл   NaOH до рН 7,4. Срезы гиппокампа перенос т из раствора А в раствор Б с ферментом и обрабатывают при 36-37°С в течение 30-120 мин при посто нном пропускании через раствор карбогена (СО 5%, 0,95%). Затем обрабатываемую ткань перенос т в раствор Б без фермента (отмывочный) и выдерживают в нем в течение 20-120 мин, градуально повыша  концентрацию в нем CaCl до 0,5 - 2,6 ммоль, Мр,С1 , от О до 1,1 ммоль. Сначала ткань выдерживают в растворе Б без фермента в течении 10-20 мин, а затем в этот раствор через равные промежутки времени добавл ют растворы CaCl р, и Мр(И . За 5-10 мин до конца процедуры в смось добавл ют 2-10% бычьей сыворотки.

Затем ткань подвергают механической диссоциации в растворе А, в который добавл ют 0,5-2,6 ммоль CaCl, 0,22-1,1 ммоль MgCl г,, При помощи пас

теровскои пипетки ткань диссоциируют на отдельные клетки, которые перенос т в среду МСИ (минимальна  среда Игла) с 2-10% бычьей сыворотки и физиологическими концентраци ми CaCl и MgCl. В этой среде клетки наход тс  до 6 ч без заметных изменений своих морфологических и электрических характеристик. Часть срезов остаетс   в отмывочном растворе при посто нном пропускании карбогена и температуре 20 с и может быть использована дл  получени  изолированных клеток в течение 6-8 ч.

В отличие от нейронов, получаемых при осуществлении известного способа, нейроны, полученные по данному способу , обладают улучшенными морфологическими чертами: диаметр нейронов составл ет 15-20 мкм, длина 20- 40 мкм, тела клеток полностью сохран ют характерную пирамидную форму и даже неровности поверхности, обуслов- ленные контактами в ткани с соседними клетками, у них остаетс  обширное

0

5

0

5

0

5

дендритное древо, причем сохран ютс  дендриты вплоть до третьего пор дка. Клетки гораздо дольше переживают в суспензии без изменени  своих характеристик . Тела клеток, полученных по известному способу, значительно более округлы, максимальный пор док сохранившихс  дендритов второй. Срок переживани  в суспензии 2-3 ч.

Электро- и хемоуправл емые токи ионов через мембраны нейронов исследуют методом внутриклеточной перфузии в режиме фиксации потенциала на мембране в сочетании с методом быс г- рой смены внеклеточного раствора. Нейроны сохран ют электровозбудимость . Хемочувствительность их значительно улучшаетс . При сравнении амплитуд вход щих натриевьк токов в ответ на аппликацию различных веществ у нейронов, полученных по предлагаемому и известному способам,видно, что амплитуды на пор док вьппе.Так,среднее значение максимальных амплитуд при аппликации глутамата в 11,8 раз выше (сравнивали 16 клеток, полученных по предлагаемому способу, и 16 по известному). Стабильность ответов сохран етс  в течение 2 ч в эксперименте.

Способ может быть использован дл  диссоциации любых нервных клеток.

а также клеток тголжелулочгих железы, почки, печени, соединительной ткани.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ диссоциации клеток гиппо- кампа путем ферментативной обработки исходной ткани с последующими отмывкой и инактивацией фермента и механическим разделением клеток, отличающийс  тем, что, с целью удлинени  срока переживани  клеток в суспензии и улучшени  электрофизиологических характеристик и хемочувст

   вительности мембран, ферментатипную обработку провод т амилоризином 1120х при его концентрации 0,1-1,5% п солевом растворе в присутствии следовых количеств СаСТ , отмывку осуществл ют в том же солевом растворе в услови х градуального повышени  концентраций СаСТ и до 0,5-2,6 ммоль и от О до 1,1 ммоль соответственно, а инактивацию и механическую диссоциацию осуществл ют в присутствии тех же солей в концентрации 0,5-2,6 ммоль и 0,22-1,1 ммоль соответственно.