Claims (4)
СД Изобретение относитс к биохимии, а именно к способам определени ак- , тивности пероксидазы, и может быть использовано в биологии, токсикологии , медицине. Цель изобретени - повышение чувствительности способа за счет использовани в качестве субстрата сме си пирокатехина и резорцина. Способ осуществл етс следующим образом. В кювету спектрофотометра последовательно внос т 1 мл 0,07 М фосфатного буфера рН 7,3-8,0; мл 0,04 0,07 М раствора пирокатехина; 1 мл 0,02-0,03 М раствора резорцина; 0,5 мл раствора, содержащего перокси дазу. Реакцию инициируют добавлением 0,5 мл 0,03%-ного раствора перекиси водорода. После быстрого перемешивани реагентов определ ют увеличение оптической плотности при 460 км. Активность фермента в условньтх единицах А f7c о тическа ПЛОТНОСТЬ} t - врем , мин; f оптическа толщина кюветы, см; С концентраци фермента, мг/мл. Пример 1. Определ ют активность пероксидазы фиры Реанал. В кювету внос т 1 мл фосфатного буфера рН 7,5; 1 мл 50 мМ пирокатехина, 1 мл 25 мМ резорцина: 0,5 мл пероксидазы ( 2 мкг/мл в фосфатном буфере ); 0,5 мл 0,03%-ного раствора перекиси водорода и измер ют оптичес кую плотность при 460 нм. AD Oj62; f 1 см; t 1 мин; С 0, мг/мл; А uD/t -C 2480 усл.ед. Пример Diabetes The invention relates to biochemistry, namely to methods for determining the activity of peroxidase, and can be used in biology, toxicology, medicine. The purpose of the invention is to increase the sensitivity of the method by using a mixture of pyrocatechin and resorcinol as a substrate. The method is carried out as follows. To the spectrophotometer cuvette, 1 ml of 0.07 M phosphate buffer, pH 7.3-8.0; ml 0.04 0.07 M solution pyrocatechin; 1 ml of 0.02-0.03 M solution of resorcinol; 0.5 ml solution containing peroxidase. The reaction is initiated by adding 0.5 ml of 0.03% hydrogen peroxide solution. After rapidly mixing the reagents, an increase in the optical density at 460 km is determined. Enzyme activity in conditional units A f7c is about T. DENSITY} t - time, min; f optical cuvette thickness, cm; C, enzyme concentration, mg / ml. Example 1 Reanal peroxidase activity was determined. 1 ml of phosphate buffer pH 7.5 was added to the cuvette; 1 ml of 50 mM pyrocatechin, 1 ml of 25 mM resorcinol: 0.5 ml of peroxidase (2 μg / ml in phosphate buffer); 0.5 ml of a 0.03% hydrogen peroxide solution and absorbance at 460 nm. AD Oj62; f 1 cm; t 1 min; C 0 mg / ml; And uD / t -C 2480 used Example
2. Измерение провод аналогично примеру 1, за исключение того, что рН 7,25, концентраци пирокатехина 40 мМ, резорцина 20 мМ D 0,57; t 1 МИН.1 1 1 см; С 0,25 10 мг/мл; А D/t 1 С 2280 усл.ед. Прим е--р 2. Measurement of the wire as in Example 1, except that the pH is 7.25, the concentration of pyrocatechin 40 mM, resorcinol 20 mM D 0.57; t 1 MIN.1 1 1 cm; C 0.25 10 mg / ml; And D / t 1 C 2280 used Note - p
3. Измерение провод т аналогично примеру 2, за исключением того, что рН 8,00, концент аци пирокатехина 70 мМ, резорцина 0 мМ. uD 0,55; t 1 мин; Е i см; С 0, мг/мл; А uD/t-I-C 2200 усл.едПример 3. The measurement is carried out analogously to Example 2, except that the pH is 8.00, the concentration of pyrocatechin 70 mM, resorcinol 0 mM. uD 0.55; t 1 min; E i cm; C 0 mg / ml; And uD / t-I-C 2200 used.Example
4. Определение активности пероксидазы в элодее канадской . Навеску элодеи 500 мг сырого веса растирают в фосфатном буфере 0,01 М, рН 7,50, перенос т в мерную колбу на 25 мл и довод т до метки центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин. Измерени провод т согласно примеру 1, но вместо 0,5 мл раствора пероксидазы в кювету помещают 0,5 мл выт жки. Во втором варианте навеску элодеи предварительно инкубируют в течение 30 мин в растворе ингибитора пероксидазы - 10 М сульфида натри , затем элодею отмывают и определ ют активность фермента аналогично указанному. Расчет провод т на 1 г/мл сырого веса элодеи. Активность пероксидазы нативной элодеи, AD, 0,52 ±0,06; t 1 мин; f см; С - вес/объем 0,5:8:25 0,0025 г/мл (С - концентраци растительного материала в кювете). А iD,-/tJ-C 208 усл.ед. Активность пероксидазы элодеи после обра.ботки ингибитором. DZ 0,29 ±0,04; t мин; F 1 см; С 0,025 г/мл; А uD /t-1C 116 усл.ед. Формула изобретени Способ определени активности пероксидазы путем инкубации пробы, со-- держащей пероксидазу, перекись врдорода и окисл емьш субстрат, с последующим измерением оптической плотности смеси, отличающийс тем, что, с целью повышени чувствительности способа, в качестве окисл емого субстрата используют смесь, содержащую 40-70 мМ пирокатехин и 20-30 мМ резорцин, а определение ведут при рН 7,25-8,00.4. Determination of peroxidase activity in Canadian elodea. A portion of elodea 500 mg wet weight is triturated in phosphate buffer 0.01 M, pH 7.50, transferred to a 25 ml volumetric flask and brought to the mark centrifuged for 10 minutes at 3000 rpm. Measurements are carried out according to Example 1, but instead of 0.5 ml of peroxidase solution, 0.5 ml of the extract is placed in a cuvette. In the second variant, the suspension is preincubated for 30 min in a solution of a peroxidase inhibitor — 10 M sodium sulfide; then the elodeum is washed and the enzyme activity is determined similarly to that indicated. The calculation is carried out on 1 g / ml wet weight of elodea. The activity of peroxidase native elodea, AD, 0,52 ± 0,06; t 1 min; f cm; C - weight / volume 0.5: 8: 25 0.0025 g / ml (C is the concentration of plant material in the cuvette). And iD, - / tJ-C 208 conventional units Elodea peroxidase activity after treatment with an inhibitor. DZ 0.29 ± 0.04; t min; F 1 cm; C 0.025 g / ml; And uD / t-1C 116 used The invention The method for determining the activity of peroxidase by incubating a sample containing peroxidase, peroxide and oxidized substrate, followed by measuring the optical density of the mixture, characterized in that, in order to increase the sensitivity of the method, as the oxidizable substrate, use a mixture containing 40-70 mm pyrocatechin and 20-30 mm resorcinol, and the determination is carried out at a pH of 7.25-8.00.