ооoo
О1 О1O1 O1
О1 Изобретение относитс к спиртовой промышленности, в частности к способам получени -этанола. Целью изобретени вл етс ускоре ние процесса и повышение концентрации этанола в среде,. Способ осуществл етс следующим образом. Подвергают микробиологическому превращению сахар в этанол путем кон тактировани иммобилизованных в геле-носителе этанолпродуцирующих дрож жей или анаэробных микроорганизмов рода Saccharomyces или Zymomonas с питательной средой, содержащей ферментируемьй сахар в концентрации 50-100 мг/мл и другие питательные вещества, необходимые дл роста микроорганизмов в геле. После снижени концентрации сахара в питательной среде до 2-10 мг/мл осуществл ют дополнительную подачу питательной среды , содержащей 100-400 мг/л сахара, до концентрадии сахара в среде 50100 мг/мл, поддержива этим самым в процессе микробного логического прег вращени сахара в этанол рост дрожжей или анаэробных микроорганизмов. Процесс осуществл ют периодическим или непрерывным способом при 15-45 С до получени этанола в среде концентрацией не менее 75-100 мг/л, затем отдел ют среду, содержащую этанол, с последующим его отделением. Дл осуществлени способа используют дрожжи или анаэробные микроорганизмы, обладающие активностью, направленной на синтез этанола, например пивные дрож жи Sacchcerevisiae I FO 2018 и Sacch viarum IFO 1167; дрожжи,использующиес дл получени вина,Sacchcerevisia If6 0216, Sacch cerevisiae IFO 0233, Sacch cerevisiae ATCC 4111 и Sacch cerevisiae ATCC 4124, дрожжи дл получени саке Sacch sake ATCC 26422; винные дрожжи Sacch cerevisiae IFO 1661, Sacch cerevisiae ATCC 4098 и Sacch cerevisiae IFO ATCC 4921, Sacch carlsbergensis OVT 7013, Sacch pasterianus OVT 7122, Sacch fermentari IFO 0422, Zymomonas mobilis IFO 13756, Zymomonas omaerobea ATCC 29501 и т.п. Любой из упом нутых типов дрожжей или анаэробных микроорганизмов, иммо билизованный в геле, можно использовать , причем иммобилизацию г4икроорга низмов осуществл ют следующим образом: Небольшое количество микробных клеток смешивают с раствором гелевого основного материала и полученную в результате смесь желатинируют в таблетки или кусочки пленки в соответствии с известными способами желатини- . ровани , например смесь по капл м добавл ют в раствор желатинирующего агента с целью получени таблеток или кусочков пленки толщиной или диаметром 2 мм - 5 см, содержащих 0,01-10 колоний микробных клеток на 100 г (влажный вес) гелей. Далее, гели инкубируютс в питательной среде дл выращивани культуры, пригодной дл роста микроорганизмов, при 15-45 С с целью получени искомых иммобилизованных микроорганизмов, которые образуют плотный слой микробных клеток внутри поверхностного сло несущего гел . В качестве гелевого основного материала используют полисахариды, например, сульфагированньй полисахарид, алгинат натри , сукцинат целлюлозы. Любой из сульфатированных полисахаридов, который содержит не менее 10% в.в., в предпочтительном варианте - 12-62% в.в сульфатных групп (-SO Н) в своей молекуле , к сульфатированным полисахаридам относ тс каррагинан, фурцелларан и сульфат целлюлозы. Каррагинан содержит примерно 20-30% в.в. сульфатных групп (SOjH) в молекуле, а фурцелларан - 12-16% в.в. сульфатных групп в своей молекуле. Пригоден сульфат целлюлозы, содержащий 1262% в.в. сульфатных групп в молекуле. Приготавливают питательную среду в результате перемешивани в воде источника азота, например, экстракта дрожжей, насьпденного .кукурузного ликера , пептона или т.п. и одного или нескольких питательных веществ, необходимых дл роста микроорганизмов. Эти питательные вещества выбирают из витаминов: тиамин, биотин, пантотенова кислота, инозитол и т.п., минеральных веществ: фосфаты, соли магни , соли кальци , соли натри , соли кали и т.п., солей аммони : хлорид аммони , кгш их смесей. Количестг во этих питательньк веществ, которое необходимо добавить, следующее, % в.в.: источник азота 0,05-1,0, минеральные вещества 0,0001-0,1, аммоний 0,01-1,0, кроме того, в питательную среду можно добавить следы витаминов. Затем в приготовленную.таким образом 3 питательную среду добавл ют фермент руемый сахар: глюкоза, фруктоза, са хароза, мальтоза и т.п. Меласса содержит как ферментируе мьй сахар, так и другие питательные вещества, необходимые дл роста мик роорганизма. В св зи с этим водный раствор мелассы можно использовать как среду дл выращивани культуры. При реализации предлагаемого изо ретени н принципе периодического действи иммобилизованные микроорга низмы сначала контактируют со средой дл выращивани культуры при перемешивании с целью превращени ферменти руемого сахара в среде в этанол.Когда концентраци сахара снижаетс до величины, не превышающей 20% от начальной концентрации, в предпочтительном варианте - не превьшающей 10 мг/мл, в систему реакции превращени добавл ют дополнительное -количество свежей среды дл выращивани культуры, содержащей сахар. Вновь добавленньй сахар также превращаетс в этанол и концентраци его в среде снова снижаетс . Добавление свежей среды дл выращивани культуры, содержащей сахар, можно повтор ть через некоторые промежутки времени до тех пор, пока будет производитьс высока концентраци этанола, например 100-200 мг/мл. Дополнительно количество свежей среды дл выращивани культуры, которую добавл ют в систему реакции превращени , должно содержать ферментируемый сахар в относительно высоких концентраци х, не менее 250 мг/мл, в предпочтительном варианте - вместе с питательными веществами , отличными от ферментируемого сахара, необходимыми дл роста иммобилизованных микроорганизмовi каждый раз, когда добавл ют дополнительное количество свежего питательного бульона, концентраци сахара в свежей питательной среде дл выращивани может периодически увеличивать с до 400 мг/мл. При реализации предлагаемого способа на принципе непрерывного действи используетс колоннообразное реакционное оборудование, упакованное иммобилизованными микроорганизмами. Цилиндрическа колонна, обращенна колонна конической формы, колонна, снабженна циркул ционной трубой, ил люба сери , или комбинаци на их ос 554 нове могут быть использованы в качает-, ве колоннообразного реакционного оборудовани . В случае использовани в качестве реакционного оборудовани цилиндрической колонны среду дл выращивани культуры, содержащую в предпочтительном варианте 50-100 мг/мл ферментируемого .сахара вместе с питательными веществами, отличными от ферментируемого сахара, необходимыми дл роста микроорганизмов, подают непрерывно через один из концов колонны с целью превращени сахара в этанол , а среда, содержаща полученный таким образом этанол, вытекает из колонны через другой конец. Скорость загрузки среды дл выращивани культуры регулируетс таким образом, чтобы концентраци сахара в потоке, покидающем колонну, не превышала 20% его первоначальной концентрацр-ш, в предпочтительном варианте - не более 10 мг/мл. Затем в колонну непрерывно подают дополнительное количество свежей питательной среды дл выращивани культуры, содержащей не менее :200 мг/мл сахара, скорость загрузки среды дл вьфащивани культуры регу;лируетс так, чтобы концентраци саIхара в вытекающем потоке составл ла не более 20% от его первоначальной концентрации, т.е. не более 10 мг/мп. Когда в качестве реакционного оборудовани используетс обращенна колонна конической формы, реакци превращени ферментируемого сахара в этанол может осуществл тьс с большей эффективностью, поскольку образующа с в реакции газообразна двуокись углерода может удал тьс с большей эффективностью . При использовании цилиндрической колонны, снабженной циркул ционной трубой, порци среды, прошедша через колонну, циркулирует ;через циркул ционную трубу ко дну колонны . этом варианте концентраци сахара в дополнительном количестве свежей питательной среды дл вьфащивани культуры, котора должна непрерьшно подаватьс через входную трубу ко дну колонны, должна поддерживатьс повьшенной, например до 250- 400 мг/мп, дл устранени снижени концентрации сахара, вызванного разбавлением циркулирующей порцией бульона . Кроме того, концентраци сахара в среде дл вьфащивани культуры, котора непрерывно загружаетс в ко- , лрнну, может постепенно увеличиватьс до 250-400 мг/мл с течением време ни. При реализации предлагаемого спо соба иммобилизованные микроорганизмы сохран ют исключительно высокую продуктивность , направленную на синтез этанола, в течение.длительного промежутка времени, при этом этанол вырабатываетс с высокой концентрацией например, 100-200 мг/мл. Кроме того, можно использовать целую серию колон в соответствии с непрерывным принципом действи . Например, непрерывный способ осуществл етс с использованием серии цили1-щрических колонн и подачей свежей питательной среды дл вьфащивани культуры в первую колонну с такой скоростью подачи, чтобы концентраци сахара в вытекающей жидкости из первой колонны снижалась до величины, не превышающей 20% его первоначально концентрации, в предпочтительном варианте - до величины, не превышающей 10 мг/мл, загружают дополнительное количество свежей питательной среды дл выращивани культуры, содержащей не более 250 мг/мл сахара , во вторую колонну вместе с жидкостью , вытекающей из первой колонны , и т.д., повтор аналогичную про цедуру загрузки дл последующих колонн . Можно использовать данную колонну , регулиру скорость подачи свежей питающей среды дл выращивани культуры, таким образом, чтобы концентраци сахара в ее некоторой части снилсалась до величины, не превышающей 20% от его первоначальной концентрации, подава дополнительное количество свежей среды дл выращива ни культуры, содержащей сахар, в ту часть колонны, где снижаетс концент раци сахара, повтор затем эту про цедуру загрузки в последующих част х колонны. Эти варианты реализации предлагаемого способа могут увеличит выход этанола за единицу времени, кроме того, этанол может образовыватьс непрерывно с высокой концентрацией и весьма эффективно. Отделение среды после завершени реакции превращени может быть осуществлено известными способами, на пример дистилл цией, центрифугированием , декантацией и т.п. При использовании колонны бульон можно легко отделить в виде потока, вытекающего из неё. Активность иммобилизованных микроорганизмов , направленна на синтез этанола, определ етс при помощи определени количества образующегос этанола, концентраци ферментируемого сахара определ етс в пересчете на глюкозу. .Пример 1. Дрожжи Saccharomyces sake АТСС 26422 смешивают с 20 мл стерилизованного 4,5% в.о. водного раствора каррагинана при 37°С. Смесь по капл м добавл ют из сливного наконечника в 2% в.о. водньй раствор хлорида кали (200 мл) с целью получени сферических гелей с диаметром 4 мм. Питательную среду приготавливают в результате смешивани в воде, % в.в.: экстракт дрожжей 0,15, хлорид аммони 0,25, кислый бифосфат кали 0,55, гептагидрат сульфата магни 0,025, хлорид кальци 0,001, лимонна кислота 0,1 и хлорид натри 0,25 и поддерживают рН на уровне 5,0. В полученную среду добавл ют глюкозу с концентрацией. 10% B.C. и полученные гели инкубируют в содержащей глюко.зу среде 500 мл при легком встр хивании при в течение 60 ч с целью выращивани дрожжей в гел х. Полученные таким образом иммобилизованные дрожжи обладают активностью, направленной на синтез этанола, котора равн етс 50 мг этанола/мл гел /ч . Иммобилизованные дрожжи 20 ми контактируют с питательной средой, содержащей 10% B.C. глюкозы (20 мл) при в течение 1 ч. Когда концентраци оставшейс глюкозы в среде снижаетс до 2 мг/мл, добавл ют дополнительное количество свежей питательной среды, содержащей 40% в.о. глюкозы (5 мл), и реакци превращени глюкозы , в этанол продолжаетс еще в течение 1 ч при тех же услови х. Затем стади добавлени питательной среды, содержащей 40% в.о. глюкозы (5 мл), повтор етс три раза с интервалом в 1 ч. В результате иммобилизованные дрожжи сохран ют свою активность, направленную на синтез этанола, на уровне 50 мг/мл гел /ч в течение периода реакции, после проведени реакции превращени в течение 5 ч получаетс среда, содержаща этанол в концентрации 125 мг/мл (40 мл). Пример 2. Способ осуществл ют аналогично примеру 1,, Активность направленна на синтез этанола, вышеленных иммобилизованных дрожжей н снижаетс даже после вьщелени и ста ди получени этанола повтор етс дес ть раз, в результате получают среду, содержащую этанол с концентрацией 125 мг/мл (40 мл), в конце каждой реакции превращени , продолжавшейс в течение 5 ч. Пример 3. Иммобилизованные дрожжи 20 мл приготавливают аналогично примеру 1. Затем их помещают в цилиндрическую колонну (объем 30 мл в которую через один из концов загружают питательную среду, содержащ 10% в.о. глюкозы, со скоростью 20 мл/ч при 30 С, при этом дрожжи вспльгоают и выход т из колонны чере другой ее конец с той же скоростью. . После инкубировани в течение 60 ч при 30 С, в течение которого подача среды продолжаетс с .упом нутой скоростью , скорость подачи бульона дово дитс до 7 мл/ч с тем, чтобы вытекающий поток содержал глюкозу с концен трацией не более 10 мг/мл. При этих услови х концентраци глюкозы в пита тельной среде, которую подают в колонну , постепенно увеличиваетс таки образом, что концентраци глюкозы в нем достигает 30% в.о. в пересчете н бульон через 120 ч. В течение этого периода активность иммобилизованных дрожжей, направленна на синтез этанола , не снижаетс и в результате вы текающий из колонны поток содержит этанол в концентрации 150 кг/мл. Кро ме того, когда питательна среда, со держаща 30% в.о. глюкозы, непрерывно поступает в колонну со скоростью 7, мл/ч, иммобилизованные дрожжи в колонне сохран ют свою стабильную активность в течение более 1 мес, а вытекающий поток содержит этанол со средней концентрацией 146 мг/мл. Пример 4. Получение этанола осуществл етс с использованием цилиндрического колоннообразного реакционного оборудовани , содержащего три колонны. Кажда колонна (объем 30 мп) подготавливаетс аналогично примеру 3, т.е. упаковывают колонны иммобилизованными дрожжами и подают питательную среду, содержащую 10% B.C. глюкозы, со скоростью 20 ми/ч при в течение 60 ч. Затем колон ны соедин ютс между собой. Питательную среду, содержащую 10% в.л. глюкозы, подают в нижнюю часть первой колонны через трубу со скоростью 20 мл/ч при . Вытекающий из колонны поток подают во вторую колонну вместе с питательной средой, содержащей 40% B.C. глюкозы, через загрузочную трубу со скоростью 5 мл/ч. Вытекающий из второй колонны поток подают в третью колонну вместе с питательной средой, содержащей 40% в.о. глюкозы, через загрузочную трубу со скоростью 5 мл/ч. В результате, из третьей колонны через выходную трубу вытекает поток, содержащий этанол в концентрации 100 мг/мл со скоростью 30 мл/ч. Пример- 5. Способ осуществл ют аналогично примеру 4, только 20% в.о. 5%-ного водного раствора мелассы используетс вместо 10% в.о. глюкозы в исходной питательной среде (100 мг/мл в пересчете на глюкозу) и концентраци водного раствора мелассы в дополнительной питательной среде постепенно увеличиваетс до 60% в.о. с целью непрерьшного получени вытекающего потока, содержащего этанол в концентрации 142 мг/мл со скоростью 5 мл/ч. Пример 6. Получение этанола осуществл ют с использованием конического колоннообразного реакционного оборудовани . В коническую колонну (объем 30 мл) помещают иммобилизованные дрожжи 20 мл, полученные согласно примеру 1, подают питательную среду, содержащую 10% в.о. глюкозы , в нижнюю часть колонны через загрузочную трубу со скоростью 20 мл/ч при , среду вьшод т из колонны в ее верхней части через трубопровод с той же скоростью. После инкубировани при в течение 40 ч (при этом среду подают с приведенной скоростью ) скорость подачи измен етс до 6 мл/ч с тем, чтобы .вытекающий поток содержал глюкозу в концентрации, не превышак цей 10 мг/мп. При этих услови х концентраци .глюкозы в пиательной среде, которую подают в колонну , постепенно увеличиваетс так, чтобы концентраци глюкозы в ней достигла 35% в.о. в пересчете на среду спуст 72 ч. В течение этого периода активность иммобилизованных дрожжей, направленна на синтез этанола , не снижаетс и в результате в вытекающем потоке концентраци этано ла составл ет 175 мг/мп. Пример 7. Получение этанола осуществл етс с использованием цилиндрического колоннообразного реакционного оборудовани , содержащего трубу дл циркулирующего потока, при помощи которой часть среды, вытекающей из колонныJ подаетс в нижнюю часть колонны, т.е. в колонну, упако ванную иммобилизованными дрожжами 25 мл, полученными согласно примеру 1, затем подают 20% в,о. водный раствор молазы (100 мг/мп в пересчет на глюкозу) в нижнюю часть колонны через трубу со скоростью 25 мл/ч при 30 С, в результате иммобилизованные дрожжи всплывают и среду вывод т из колонны через ее верхнюю часть с той же скоростью. После инкубировани в течение 40 ч при (при этом среду подают с указанной скоростью) в колонну подают 50% в.о. водньш рас вор молазы (250 мг/мп в пересчете на глюкозу) со скоростью 10 мл/ч, пр этом часть среды, вытекающей из колонны , циркулирует в нижнюю часть ко лонны через трубу со скоростью 100 мл/ч. Концентраци молазы в пото ке, циркулирующем через трубу, снижаетс до величины, не превышающей 10 мг/мл в пересчете на глюкозу. При этих услови х активность иммобилизованных дрожжей, направленна на синтез этанола, не снижаетс и через трубу непрерывно вытекает жидкость, содержаща этанол с концентрацией 125 мг/мл, так как концентраци водного раствора молазы в бульоне, который загружаетс в колонну, разбавл етс при помощи среды, циркулирующей через трубу. . Пример 8. Одна колони Zymomonas mobilis IFO 13756 смеамваетс со стерилизованным раствором (4,5% в.о,) каррагинана 20 мл при . Смесь по капл м добавл ют из сливного наконечника в 2% в.о. водны раствор хлорида кали 200 мл с целью получени шарообразных гелей с диаметром 4 мм. Приготавливают питатель ную среду при помощи перемешивани в воде,. % в.о.: экстракт дрожжей 0,15, хлорид аммони 0,25, кислый бифосфат кали 0,55, гептагидрат сульфата маг ни 0,025, хлорид кальци 0,001, лимонна кислота 0,1 и хлорид натри 0,25, рН смеси довод т до 6,8. В питательную среду добавл ют глюкозу с концентрацией 10% в.о. и полученные гели инкубируют в содержащем глюкозу бульоне 500 мл при 30°С в течение 90 ч в атмосфере азота с целью выращивани в них анаэробных микроорганизмов . Активность полученных таким образом иммобилизованных анаэробных микроорганизмов, направленна на синтез этанола, составл ет 77 мг этанола/мл гел /ч. Иммобилизованные анаэробные микроорганизмы 20 мл контактируют с питательной средой, содержащей 10% в.л. глюкозы (20 мл), при в течение 45 мин. Когда концентраци оставшейс глюкозы в среде снижаетс до 2 мг/мл, добавл ют дополнительное количество свежей питательной среды, содержащей 40% в.о. глюкозы (5 мл), и реакци превращени глюкозы в этанол продолжаетс еще в течение 40 мин при тех же услови х. Далее стади добавлени питательной среды, содержащей 40% в.о. глюкозы (5 мл), повтор етс три раза с 40-минутными интервалами. В (Результате иммобилизовани анаэробные микроорганизмы сохран ют свою активность , направленную на синтез этанола , на уровне 77 мг этанола/мл гел /ч и после взаимодействи в течение 200 мин получаетс бульон, содержащий этанол с концентрацией 125 мг/мл (40 ш). Пример 9. Иммобилизованные анаэробные микроорганизмы, полученные согласно примеру 8, вьщел ют декантацией , Повтор ют операции по примеру 8 с использованием вьщеленных иммобилизованных микроорганизмов дл получени этанола. Активность вьзделенных иммобилизованных анаэробных микроорганизмов , направленна на синтез этанола, не снижаетс даже после выделени и получени этанола в течение дес ти раз, в результате в конце каждой реакции превращени , продолжающейс 200 мин, получаетс среда, содержаща этанол с концентрацией 125 мг/мп (40 мл). Пример 10. Способ осуществл ют аналогично примеру 1, только в колонну помещают иммобилизованные анаэробные микроорганизмы согласно примеру 9 в количестве 20 мл, а затем подают питательную среду, содержащую 10% в.л. глюкозы со скоростью 30 мл/ч при 30°С в течение 90 ч. Затем колонны соедин ют последовательn1O1 The invention relates to the alcohol industry, in particular to methods for producing ethanol. The aim of the invention is to accelerate the process and increase the concentration of ethanol in the medium. The method is carried out as follows. Sugar to ethanol is microbiologically transformed by contacting ethanol-producing yeast or anaerobic microorganisms of the genus Saccharomyces or Zymomonas immobilized in a carrier gel with a nutrient medium containing fermentable sugar at a concentration of 50-100 mg / ml and other nutrients necessary for the growth of microorganisms. . After reducing the sugar concentration in the nutrient medium to 2-10 mg / ml, additional feeding of the nutrient medium containing 100-400 mg / l of sugar is carried out until sugar concentration in the medium 50100 mg / ml, thereby supporting in the process of microbial logical rotation of sugar in ethanol is the growth of yeast or anaerobic microorganisms. The process is carried out in a batch or continuous manner at 15-45 ° C to obtain ethanol in an environment with a concentration of at least 75-100 mg / l, then the medium containing ethanol is separated, followed by its separation. Yeast or anaerobic microorganisms with activity aimed at ethanol synthesis, for example, Sacchrerevisiae i FO 2018 and Sacch viarum IFO 1167; yeast used to produce wine, Sacchcerevisia If6 0216, Sacch cerevisiae IFO 0233, Sacch cerevisiae ATCC 4111 and Sacch cerevisiae ATCC 4124, yeast to obtain Sacch sake ATCC 26422 sake; wine yeast Sacch cerevisiae IFO 1661, Sacch cerevisiae ATCC 4098 and Sacch cerevisiae; P. Any of the above types of yeast or anaerobic microorganisms immobilized in the gel can be used, and the immobilization of the microorganisms is carried out as follows: A small amount of microbial cells is mixed with a solution of the gel base material and the resulting mixture is gelatinized into tablets or film pieces according to with known methods of gelatin-. For example, the mixture is added dropwise to a solution of a gelling agent in order to obtain tablets or film pieces with a thickness or diameter of 2 mm-5 cm, containing 0.01-10 colonies of microbial cells per 100 g (wet weight) gels. Further, the gels are incubated in a culture medium suitable for the growth of microorganisms at 15-45 ° C in order to obtain the desired immobilized microorganisms that form a dense layer of microbial cells within the surface layer of the gel carrier. As the gel base material polysaccharides are used, for example, sulfated polysaccharide, sodium alginate, cellulose succinate. Any of the sulfated polysaccharides, which contains at least 10%. at. , in the preferred embodiment - 12-62%. in the sulfate groups (-SO N) in its molecule, the sulfated polysaccharides include carrageenan, furcelllaran and cellulose sulfate. Carrageenan contains approximately 20-30% c. at. sulfate groups (SOjH) in the molecule, and furcellaran - 12-16% c. at. sulfate groups in their molecule. Cellulose sulphate containing 1262% is suitable. at. sulfate groups in the molecule. The nutrient medium is prepared by mixing a nitrogen source in water, for example, a yeast extract that has been grown. corn liquor, peptone or t. P. and one or more nutrients necessary for the growth of microorganisms. These nutrients are selected from vitamins: thiamine, biotin, pantothenic acid, inositol, etc. P. minerals: phosphates, magnesium salts, calcium salts, sodium salts, potassium salts, etc. P. , ammonium salts: ammonium chloride, kgsh mixtures thereof. The amount of these nutrients that you need to add is the following,% c. at. : nitrogen source 0.05-1.0, mineral substances 0.0001-0.1, ammonium 0.01-1.0, in addition, traces of vitamins can be added to the nutrient medium. Then cooked. thus, the 3 nutrient medium is added with the fermentable sugar: glucose, fructose, sacharose, maltose, etc. P. Molasses contains both fermented sugar and other nutrients necessary for the growth of a microorganism. In connection with this, an aqueous solution of molasses can be used as a medium for growing a culture. When implementing the proposed batch principle, the immobilized microorganisms are first contacted with the medium for growing the culture under agitation in order to convert the fermentable sugar in the medium into ethanol. When the sugar concentration drops to less than 20% of the initial concentration, preferably not exceeding 10 mg / ml, an additional amount of fresh medium for growing the sugar-containing culture is added to the conversion reaction system. The newly added sugar is also converted to ethanol and its concentration in the medium decreases again. The addition of fresh medium for growing a culture containing sugar can be repeated at certain intervals until a high concentration of ethanol is produced, for example, 100-200 mg / ml. Additionally, the amount of fresh culture medium that is added to the conversion reaction system should contain fermentable sugar in relatively high concentrations of at least 250 mg / ml, preferably, along with nutrients other than fermentable sugar necessary for growth. immobilized microorganisms every time an additional amount of fresh nutrient broth is added, the sugar concentration in the fresh nutrient medium can be periodically increased. elichivat up to 400 mg / ml. When implementing the proposed method on the principle of continuous operation, columnar reaction equipment packed with immobilized microorganisms is used. A cylindrical column, a reversed conical column, a column equipped with a circulation pipe, or any series, or a combination on their base 554 can be used in pumps, columnar reaction equipment. If a cylindrical column is used as the reaction equipment, the culture medium containing, in a preferred embodiment, 50-100 mg / ml of fermentable. the sugars along with nutrients other than fermentable sugars necessary for the growth of microorganisms are fed continuously through one of the ends of the column in order to convert the sugar into ethanol, and the medium containing the ethanol thus obtained flows out of the column through the other end. The loading rate of the culture medium is adjusted so that the concentration of sugar in the stream leaving the column does not exceed 20% of its initial concentration, preferably not more than 10 mg / ml. Then, an additional amount of fresh nutrient medium for growing a culture containing at least 200 mg / ml of sugar is continuously fed into the column, the loading rate of the medium for refining the culture is adjusted so that the concentration of CaIhara in the outflow is not more than 20% of its original concentration, t. e. no more than 10 mg / mp. When a conic-shaped reversed column is used as the reaction equipment, the conversion of the fermentable sugar to ethanol can be carried out more efficiently, because the carbon dioxide gas produced in the reaction can be removed more efficiently. When using a cylindrical column equipped with a circulating tube, a portion of the medium passing through the column circulates through the circulation tube to the bottom of the column. In this embodiment, the concentration of sugar in an additional amount of fresh nutrient medium for refining the culture, which must be continuously fed through the inlet tube to the bottom of the column, must be increased, for example, up to 250-400 mg / mp, in order to eliminate the decrease in sugar concentration caused by dilution with a circulating portion of broth. In addition, the concentration of sugar in the culture enhancement medium, which is continuously loaded in the tank, can gradually increase to 250-400 mg / ml over time. When implementing the proposed method, the immobilized microorganisms retain an extremely high productivity, aimed at ethanol synthesis, for a period of. long period of time, while ethanol is produced with a high concentration of, for example, 100-200 mg / ml. In addition, a whole series of columns can be used in accordance with the continuous principle of operation. For example, the continuous process is carried out using a series of cylindrical columns and supplying fresh nutrient medium for refining the culture in the first column at such a feed rate that the sugar concentration in the effluent from the first column decreases to a value not exceeding 20% of its initial concentration, in the preferred embodiment, to a value not exceeding 10 mg / ml, additional amount of fresh nutrient medium for growing a culture containing not more than 250 mg / ml of sugar is loaded into the second columns together with the fluid flowing from the first column, and so on. d. , repeat the same loading procedure for subsequent columns. It is possible to use this column by adjusting the feed rate of the fresh culture medium so that the sugar concentration in some part of it is reduced to a value not exceeding 20% of its initial concentration by supplying an additional amount of fresh medium for the culture containing sugar. , to the part of the column where the sugar concentration decreases, then repeat this loading procedure in the subsequent parts of the column. These embodiments of the proposed method can increase the ethanol yield per unit of time; in addition, ethanol can be formed continuously with high concentration and very efficiently. The separation of the medium after the completion of the transformation reaction can be carried out by known methods, for example by distillation, centrifugation, decantation, etc. P. When using a column, the broth can be easily separated as a stream flowing from it. The activity of immobilized microorganisms aimed at the synthesis of ethanol is determined by determining the amount of ethanol produced, the concentration of fermentable sugar is determined in terms of glucose. . Example 1 Yeast Saccharomyces sake ATCC 26422 is mixed with 20 ml of sterilized 4.5% c. about. aqueous solution of carrageenan at 37 ° C. The mixture is added dropwise from a 2% v drain tip. about. an aqueous solution of potassium chloride (200 ml) to obtain spherical gels with a diameter of 4 mm. The nutrient medium is prepared by mixing in water,% c. at. : Yeast extract 0.15, ammonium chloride 0.25, acid potassium biphosphate 0.55, magnesium sulfate heptahydrate 0.025, calcium chloride 0.001, citric acid 0.1 and sodium chloride 0.25 and maintain the pH at 5.0. Concentration glucose is added to the resulting medium. 10% B. C. and the resulting gels are incubated in containing gluco. 500 ml with gentle shaking for 60 hours to grow the yeast in gels. The immobilized yeast thus obtained has an activity aimed at the synthesis of ethanol, which is equal to 50 mg of ethanol / ml of gel / h. The immobilized yeast is in contact with a nutrient medium containing 10% B by 20 mi. C. glucose (20 ml) for 1 hour When the concentration of the remaining glucose in the medium drops to 2 mg / ml, an additional amount of fresh nutrient medium containing 40% c is added. about. glucose (5 ml), and the conversion of glucose to ethanol continues for 1 hour under the same conditions. Then the step of adding a medium containing 40% c. about. glucose (5 ml), repeated three times with an interval of 1 h. As a result, the immobilized yeast retains its activity aimed at ethanol synthesis at a level of 50 mg / ml gel / h during the reaction period, after carrying out the conversion reaction for 5 h, a medium containing ethanol at a concentration of 125 mg / ml (40 ml ). Example 2 The method is carried out analogously to example 1, the activity directed to the synthesis of ethanol, the released immobilized yeast n decreases even after the extraction and the ethanol production stage is repeated ten times, resulting in a medium containing ethanol with a concentration of 125 mg / ml (40 ml) at the end of each conversion reaction that lasted for 5 hours. Example 3 Immobilized yeast 20 ml prepared as in example 1. Then they are placed in a cylindrical column (30 ml volume into which nutrient medium containing 10% c is loaded through one of the ends. about. glucose, at a rate of 20 ml / h at 30 ° C, with the yeast emerging and leaving the column through the other end at the same speed. . After incubation for 60 hours at 30 ° C, the medium is continued to flow from. with the above rate, the broth feed rate is brought to 7 ml / hr, so that the effluent stream contains glucose with a concentration of not more than 10 mg / ml. Under these conditions, the concentration of glucose in the nutrient medium, which is fed to the column, gradually increases in such a way that the concentration of glucose in it reaches 30%. about. in terms of broth after 120 h. During this period, the activity of immobilized yeast, aimed at ethanol synthesis, does not decrease, and as a result, the effluent from the column contains ethanol at a concentration of 150 kg / ml. In addition, when the nutrient medium, containing 30%. about. glucose, continuously enters the column at a rate of 7 ml / h, the immobilized yeast in the column retains its stable activity for more than 1 month, and the resulting stream contains ethanol with an average concentration of 146 mg / ml. Example 4 The production of ethanol is carried out using cylindrical columnar reaction equipment containing three columns. Each column (volume 30 mp) is prepared analogously to Example 3, t. e. the columns are packed with immobilized yeast and supplied with a nutrient medium containing 10% B. C. glucose, at a speed of 20 mi / hr for 60 hours. The columns are then interconnected. Nutrient medium containing 10%. l glucose, served in the lower part of the first column through a pipe at a rate of 20 ml / h at. The stream flowing from the column is fed to the second column along with a nutrient medium containing 40% B. C. glucose through the loading tube at a rate of 5 ml / h. The stream flowing from the second column is fed to the third column along with a nutrient medium containing 40% c. about. glucose through the loading tube at a rate of 5 ml / h. As a result, a stream containing ethanol at a concentration of 100 mg / ml at a rate of 30 ml / h flows out of the third column through the exit pipe. Approximately 5. The method is carried out analogously to example 4, only 20% of. about. A 5% aqueous solution of molasses is used instead of 10% c. about. glucose in the original nutrient medium (100 mg / ml in terms of glucose) and the concentration of an aqueous solution of molasses in the additional nutrient medium gradually increases to 60%. about. for the purpose of the continuous production of a stream containing ethanol at a concentration of 142 mg / ml at a rate of 5 ml / h. Example 6 The preparation of ethanol is carried out using a conical columnar reaction equipment. In a conical column (volume 30 ml) placed immobilized yeast 20 ml, obtained according to example 1, serves a nutrient medium containing 10%. about. glucose, in the lower part of the column through the loading tube at a speed of 20 ml / h with, the medium was removed from the column in its upper part through the pipeline at the same speed. After incubation for 40 hours (the medium is fed at a superficial rate), the feed rate is changed to 6 ml / hr. the effluent contained glucose at a concentration not exceeding 10 mg / mp. Under these conditions, concentration. glucose in the nutrient medium, which is fed into the column, gradually increases so that the concentration of glucose in it reaches 35%. about. in terms of Wednesday after 72 hours During this period, the activity of the immobilized yeast, aimed at ethanol synthesis, does not decrease and as a result, the ethanol concentration in the outflow is 175 mg / mp. Example 7 The production of ethanol is carried out using a cylindrical columnar reaction equipment containing a pipe for a circulating flow, with which part of the medium flowing from the column is fed to the bottom of the column, t. e. Into the column packed with 25 ml of immobilized yeast prepared according to Example 1, then 20% V, o are fed. an aqueous solution of molase (100 mg / mp in terms of glucose) in the lower part of the column through a tube at a rate of 25 ml / h at 30 ° C, as a result, the immobilized yeast floats and the medium is removed from the column through its upper part at the same rate. After incubation for 40 h at (while the medium is being fed at the indicated rate), 50% c. Is fed into the column. about. A solution of molasese (250 mg / mp in terms of glucose) at a rate of 10 ml / h, and a portion of the medium flowing from the column circulates to the lower part of the column through a tube at a rate of 100 ml / h. The concentration of molase in the stream circulating through the pipe is reduced to a value not exceeding 10 mg / ml in terms of glucose. Under these conditions, the activity of immobilized yeast, aimed at ethanol synthesis, does not decrease, and a liquid containing 125 mg / ml of ethanol continuously flows through the pipe, because the concentration of the aqueous solution of molase in the broth, which is loaded into the column, is diluted with medium circulating through a pipe. . Example 8 One colony of Zymomonas mobilis IFO 13756 is mixed with a sterilized solution (4.5% c. o,) carrageenan 20 ml at. The mixture is added dropwise from a 2% v drain tip. about. an aqueous solution of potassium chloride 200 ml in order to obtain spherical gels with a diameter of 4 mm. Prepare the nutrient medium by stirring in water. % at. about. : yeast extract 0.15, ammonium chloride 0.25, acid potassium biphosphate 0.55, magnesium sulfate heptahydrate 0.025, calcium chloride 0.001, citric acid 0.1 and sodium chloride 0.25, the pH of the mixture was adjusted to 6.8 . Glucose with a concentration of 10% is added to the nutrient medium. about. and the resulting gels are incubated in a 500 ml glucose-containing broth at 30 ° C for 90 hours in a nitrogen atmosphere in order to grow anaerobic microorganisms in them. The activity of the thus-obtained immobilized anaerobic microorganisms, directed towards the synthesis of ethanol, is 77 mg of ethanol / ml of gel / h. Immobilized anaerobic microorganisms 20 ml in contact with a nutrient medium containing 10%. l glucose (20 ml), for 45 min. When the concentration of the remaining glucose in the medium drops to 2 mg / ml, an additional amount of fresh nutrient medium containing 40% c is added. about. glucose (5 ml), and the conversion of glucose to ethanol continues for 40 minutes under the same conditions. The next step is the addition of a nutrient medium containing 40% of. about. glucose (5 ml), repeated three times at 40-minute intervals. B (As a result of immobilization, anaerobic microorganisms retain their activity aimed at ethanol synthesis at the level of 77 mg of ethanol / ml of gel / h and after reacting for 200 minutes, a broth is obtained containing ethanol with a concentration of 125 mg / ml (40 W). Example 9 The immobilized anaerobic microorganisms obtained according to example 8 were decanted. The operations of example 8 were repeated using the immobilized microorganisms used to obtain ethanol. The activity of the isolated immobilized anaerobic microorganisms, aimed at the synthesis of ethanol, does not decrease even after the extraction and preparation of ethanol for ten times, as a result, at the end of each conversion reaction lasting 200 minutes, a medium containing 125 mg / mp (40%) is obtained. ml) Example 10 The method is carried out analogously to example 1, only immobilized anaerobic microorganisms according to example 9 in an amount of 20 ml are placed in the column, and then the nutrient medium containing 10% c is supplied. l glucose at a rate of 30 ml / h at 30 ° C for 90 h. The columns are then connected to the sequence n1.
но. Питательную среды, содержащую 10% в.о. глюкозы, подают в нижнюю часть колонны через трубу дл подачи ее со скоростью 30 мл/ч при , Вытекающую из колонны жидкость направл ют во вторую колонну вместе с питательной средой, содержащей 40% в.л. глюкозы, подаваемой через трубу со скоростью 7 мл/ч. Вытекающую из второй колонны жидкость подают в третью колонну вместе с питательной средой, содержащей 40% в.о. глюкозы, через трубу со скоростью 7 мл/ч. Таким образом , вытекающа жвдкость,содержаща этанол сконцентрацией 100мг/мл,непрерывно поступает из третьей колонны че- рез выходную трубу со скоростью 44мл/ч.but. Nutrient medium containing 10% v.o. glucose, is fed into the lower part of the column through a pipe for feeding it at a rate of 30 ml / hr. The liquid flowing out of the column is sent to the second column along with a nutrient medium containing 40% v. glucose supplied through a tube at a rate of 7 ml / h. The liquid flowing out of the second column is supplied to the third column together with the nutrient medium containing 40% of v. O. glucose through a tube at a rate of 7 ml / h. Thus, the effluent liquid containing ethanol with a concentration of 100 mg / ml continuously flows from the third column through the outlet pipe at a rate of 44 ml / h.
Пример 11. Способ осуществл ют аналогично примеру 8, только вместо глюкозы в питательной среде (100 мг/мл в пересчете на глюкозу) используют 20% в.о. водньй раствор мелассы, причем концентраци последнего постепенно увеличиваетс до 60%Б.о.с цельюполучени среды,содержащей этанол в концентрации 125 мг/мл (40мл),в результате реакциипревращени мелассы в этанол в течение 3 ч.Example 11. The method is carried out analogously to example 8, except that instead of glucose in a nutrient medium (100 mg / ml in terms of glucose), 20% of b.o. water solution of molasses, and the concentration of the latter is gradually increased to 60% B. o. with the aim of obtaining a medium containing ethanol at a concentration of 125 mg / ml (40 ml), as a result of the conversion of molasses to ethanol for 3 hours.
Пример 12. Способ осуществл ют аналогично примеру 7. В колон5512Example 12. The method is carried out analogously to example 7. In column 5512
ну помещают иммобилизованные анаэробные микроорганизмы 25 мл, которые получают по примеру 9, в нижнюю часть колонны через трубу подают 20% в.о. водный раствор мелассы (100 мг/мл в пересчете на глюкозу) со скоростью 40 мг/ч при в течение 90 ч. Поток , поступающий из верхней части колонны через трубу, имеет ту же скорость . Затем в колонну подают 50% в.о. раствор мелассы (250 мг/мл в пересчете на глюкозу) со скоростью 15 МП/ч, одновременно часть среды, вытекающей из колонны, циркулирует в нижнюю часть колонны через циркул ционную трубу со скоростью 100 мл/ч. Концентраци водного раствора меласы, циркулирующего через трубу, снижаетс до величины, не превышающей 10 мг/мл в пересчете на глюкозу. При этих услови х активность иммобилизованных анаэробных микроорганизмов, направленна на синтез этанола, не снижаетс и через трубу непрерывно вытекает поток, содержащий этанол в концентрации 125 мг/мл, так как концентраци водного раствора мелассы, который загружаетс в колонну , снижаетс за счет циркулирующей среды.Well placed immobilized anaerobic microorganisms 25 ml, which is prepared according to example 9, in the lower part of the column through the tube serves 20% v.o. an aqueous solution of molasses (100 mg / ml in terms of glucose) at a rate of 40 mg / h at 90 h. The flow from the upper part of the column through the tube has the same rate. Then in the column serves 50%. A molasses solution (250 mg / ml in terms of glucose) at a speed of 15 MP / h, at the same time a part of the medium flowing from the column circulates to the bottom of the column through a circulation pipe at a rate of 100 ml / h. The concentration of the aqueous solution of melas circulating through the tube is reduced to a value not exceeding 10 mg / ml in terms of glucose. Under these conditions, the activity of immobilized anaerobic microorganisms aimed at ethanol synthesis does not decrease, and a stream containing 125 mg / ml of ethanol continuously flows through the tube, because the concentration of the aqueous solution of molasses that is loaded into the column is reduced by the circulating medium.