СХ)CX)
соwith
О) Изобретение относитс к микробиологической промышленности, в частнос ти к получению нового штамма, исполь зуемого дл получени протеаз. Целью изобретени вл етс получение нового штамма Bacillus thurin qiensis var. galleriae GFP-51, обладающего высокой протеолитической активностью . Штамм Вас. thurinqiensis GFP-51 продуцент протеолитических ферментов вьделен из генетически нестабильного штамма Вас. thurinqiensis var. galle riae 26 путем рассева его и отбора морфологически отличающихс колоний. Штамм GFP-51 отличаетс от родительского штамма 26 отсутствием плазмидных гономов, обладающих свойством интегрировать с хромосомным геномом клетки, в результате чего полученный штамм GFP-5t отличаетс генетической стабильностью по сравнению с родительским генетическим нестабильным штаммом Вас. thurinqiensis v. galleriae 26, Ытамм хран т в споровом состо нии в физиологическом растворе при 4°С, а также в лиофилизированном виде. Полученный штамм Вас, thuriqiensi V, galleriae GFP-51 - продуцент протеолитических ферментов депонирован в коллекции Центрального музе промьшшенных микроорганизмов ВНИИ генетики и селекции промьшшенных микро , организмов, коллекционньй номер В-3004. Штамм характеризуетс следующими признаками. Культурально-морфологические признаки. Вегетативные клетки размером (0,3 0,6)х(1,5-2) мкм расположены отдельно или небольшими цепочками. Образую споры, расположенные эксцентрально, споры овальной формы. Перитрих, Акристаллйческий , М со-пептонньй агар. Образует колонии белого цвета. Рост неебильный, наблюдаетс врастание в агар. М со-пептонный бульон. Образует кольцеобразную пленку, наблюдаетс равномерное помутнение бульона. Картофельный агар. Рост обильный, сплошной. Цвет колоний белый. Врастани в агар не наблюдаетс Сухой питательный агар. Рост обильный, сплошной-. Цвет колоний белый с серым оттенком. Форма колоний - неправильна , профиль колонии - изогнутый, край колонии - волнистый, структура колонии - однородна . Физиолого-биохимические признаки. Факультативньш анаэроб. Грамположительный . Дает хороший рост при 30t. Крахмал гидролизует. Желатину разжижает, Молоко пептонизирует. Уреазоотрицательный. Лецитиназоотрицательный. Эскулиноположительный. Усваивает; глюкозу, лактозу, ара- бинозу, целлобиозу. Не усваивает ман1|ит , Нитриты восстанавливает в нитриты . Антигенные свойства. Относитс к У серотипу вида Bacillus thurinqieftsis Не продуцирует те1:)мостабильного - экзотоксина . Штамм Вас, thurinqiensis v, galleriae GFP-51 синтезирует протеолитические ферменты, Протеолитическую активность культуральной жидкости определ ли по расщеплению азоказеина. В табл. 1 приведены сравнительные данные по активности ферментов предлагаемого штамма и ранее известных. За единицу брали активность фермента, необходимую дл расщеплени 1 мг азоказеина в течение 60 мин при 30°С, Из табл. 1 видно. что предлагаемый штамм GFP-51 обладает протеолитической активностью, котора в 3 раза вьшхе, чем у известного продуцента Вас, subtilis 203. Культура Вас, thurinqiensis v. galleriae GFP-51 - продуцента протеолитических ферментов обладает устойчивостью к вирулентным фагам, самопроизвольно фаг не ввдел ет (см. табл. 2). Пример, Дл приготовлени посевного материала используют культуРУ выращенную до спорового состо ни на питательном агаре. Перед засевом в МИБ дл получени инокул та споры прогревают при 15 мин. Культуру подращивают в МПБ при 220 об/мин, температуре ЗОС в колбак емкостью 750 мг (100 мл питательной среды), Полученную посевную вегетативную культуру используют дл засева ферментационной среды. Состав ферментационной среды и услови ферментации при биосинтезе протеазы, %: MgSO, 0,05 0,04 , 3 11813164 0 23Протеолитическа активность ацеCaCl , 008тонового порошка, определ ема модиК НРО 113фицированнь1м методом Ансона, составKHjPO О 001л ет 90-180 ед/г. Синтез экзопротеоCuSO Na-цитрат 0,015 литических ферментов осуществл етс ( NH4)SO 0,02штаммом GFP-51 стабильно. Дрожжи кормо-Т а б л и ц а 1 вые сухие 2 КукурузныйПротеолитическа активность экстракт 0,5, культуральной жидкости штамСобва мука 0,5мов Вас. subtilis и Вас. thuptf среды до 7,2-7,3 довод т 40% NaOH.rinqiensis Культивирование провод т при - температуре 30 С, 220 об/мин в кача-Штамм Активность лочных колбах емкостью 750 мл со протеаз по 100 МП питательной среды, Длитель-расщеплению ферментации, т,е. до 95% высы-азоказеина, пани спор, 44-48 ч. После оконча-ад/мл им ферментации биомассу отдел ют от--. культуральной жидкости центрифугиро- Вас. subtilis 203 52,5 ванием. Из культуральной жидкости методом оса здени ацетоном белков вВас, thurinqienсоотношении 1:2 получают ацетоновый.sis v. galleriae GFP-51 120+20 порошок - ферментный препарат.,; Устойчивость штаммов 26 и GFP-51 Вас. thuringiensis к производственным фагам ШтаммыПроизводственные фаги . 4 J 18 25 29 148Т Д8Т Д4Тд1бТд29Тн кТи-77Гэ-5 26 + + + ++ + + ++++ + GFP-51--- Условные обозначени : знак + чувствителен к фагу; - устойчив к фагу. Таблица2:O) The invention relates to the microbiological industry, in particular to the preparation of a new strain used to produce proteases. The aim of the invention is to obtain a novel strain of Bacillus thurin qiensis var. galleriae GFP-51, which has high proteolytic activity. Strain you. thurinqiensis GFP-51 producing proteolytic enzymes is derived from a genetically unstable strain You. thurinqiensis var. galle riae 26 by sieving it and selecting morphologically distinct colonies. The GFP-51 strain differs from the parental strain 26 by the absence of plasmid gonoms, which have the property of integrating with the chromosomal genome of the cell, with the result that the resulting GFP-5t strain is distinguished by genetic stability compared to the parental genetic unstable strain You. thurinqiensis v. galleriae 26, Ytamm is stored in a spore state in physiological solution at 4 ° C, as well as in a lyophilized form. The resulting strain you, thuriqiensi V, galleriae GFP-51 - producing proteolytic enzymes is deposited in the collection of the Central Museum of Industrial Microorganisms, All-Russia Research Institute of Genetics and Breeding of Microorganisms, collection number B-3004. The strain is characterized by the following features. Cultural and morphological features. Vegetative cells of size (0.3 0.6) x (1.5-2) microns are located separately or in small chains. Form spores, located eccentrically, oval-shaped spores. Peritrich, Akristallic, M co-peptone agar. Forms a colony of white. Growth is not stable, ingrowth in agar is observed. M so-peptone broth. Forms an annular film, a uniform turbidity of the broth is observed. Potato agar. Growth plentiful, continuous. The color of the colonies is white. Agar growth is not observed. Dry nutrient agar. Growth is plentiful, continuous. The color of the colonies is white with a gray tint. The shape of the colonies is irregular, the profile of the colony is curved, the edge of the colony is wavy, the structure of the colony is uniform. Physiological and biochemical signs. Optional anaerobic. Gram-positive. Gives good growth at 30t. Starch hydrolyzes. Thins gelatine, Peptonized milk. Ureazootritsatelny Lecithin is negative. Esculin positive Assimilates; glucose, lactose, arabinose, cellobiose. Does not assimilate man1 | it, restores nitrite to nitrite. Antigenic properties. It relates to the serotype of the species Bacillus thurinqieftsis. It does not produce a te1 of:) stable - exotoxin. Strain You, thurinqiensis v, galleriae GFP-51 synthesizes proteolytic enzymes. The proteolytic activity of the culture fluid was determined by the splitting of azocasein. In tab. 1 shows a comparative data on the activity of the enzymes of the proposed strain and previously known. The unit took the enzyme activity necessary for the cleavage of 1 mg of azocasein within 60 minutes at 30 ° C. 1 seen. that the proposed strain GFP-51 has a proteolytic activity that is 3 times higher than that of the well-known producer of you, subtilis 203. Culture of you, thurinqiensis v. galleriae GFP-51, a producer of proteolytic enzymes, is resistant to virulent phages; the phage does not introduce spontaneously (see Table 2). Example, For the preparation of seed, a culture grown to a spore condition on nutrient agar is used. Before sowing in MIB to obtain inoculum, the spores are heated at 15 min. The culture is grown in BCH at 220 rpm, the temperature of the AIA in a 750-milliliter flask (100 ml of nutrient medium). The resulting seed vegetative culture is used for inoculation of the fermentation medium. The composition of the fermentation medium and the fermentation conditions during protease biosynthesis,%: MgSO4, 0.05 0.04, 3 11813164 0 23 ActeCaCl proteolytic activity, 008 ton powder, determined by Anson's modified NRO 113 by the method of Anson, the composition KHjPO O 001 is 90-180 units / g. Synthesis of exoproteoCuSO Na-citrate of 0.015 lytic enzymes is carried out (NH4) SO 0.02 by the strain of GFP-51 stably. Yeast fodder-T a b l and c a 1 e dry 2 CornProteolytic activity extract 0.5, the culture fluid strain Sobna flour 0.5m Vas. subtilis and you. thuptf of the medium to 7.2-7.3 is adjusted to 40% NaOH.rinqiensis. Cultivation is carried out at a temperature of 30 ° C, 220 rpm in a kacha-Strain. The activity of 750 ml flasks with proteases of 100 MP nutrient medium, Duration splitting fermentation, t, e. up to 95% of vysy-azocaseine, pani spores, 44-48 hours. After the end of the fermentation, the biomass is separated from the biomass. the culture fluid centrifuged you. subtilis 203 52.5 From the culture fluid by precipitating proteins with acetone into Bac, a 1: 2 thurinqien ratio is acetone.sis v. galleriae GFP-51 120 + 20 powder - enzyme preparation; The resistance of strains 26 and GFP-51 Vas. thuringiensis to production phages Strains Production phages. 4 J 18 25 29 148Т Д8Т Д4Тд1бТд29Тн кТи-77Гэ-5 26 + + + ++ + + ++++ + GFP-51 --- Legend: the + sign is phag-sensitive; - resistant to phage. Table 2: