SU1140787A1

SU1140787A1 - Method of separating glycosaminoglycans from leukocytes

Info

Publication number: SU1140787A1
Application number: SU833560974A
Authority: SU
Inventors: Марина Федоровна Харченко; Татьяна Львовна Шатская; Светлана Степановна Остроумова; Гарик Яковлевич Гдалевский
Priority date: 1983-01-11
Filing date: 1983-01-11
Publication date: 1985-02-23

Abstract

СПОСОБ ВВДЕЛЕНИЯ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ путем экстракции липидов органическими растворител ми, обработки протеолитическими ферментами, оСаждени балластных белков с последующей обработкой продукта четвертичноаммонийными основани ми и этанолом, о тл и ч а ю щ и и с тем, что, с целью повышени чистоты целевого продукта, упрощени и ускорени способа , экстракцию липидов провод т ацетоном, протеолитическое расщепление - папаином в присутствии ЭДТА и цистеина, целевой продукт получают дифференциальной экстракцией растворами солей возрастающей ионной силы. (ЛA METHOD FOR IMPLEMENTING GLYCOSAMINOGLICANES FROM BLOOD LEUKOCYTES by extracting lipids with organic solvents, treating with proteolytic enzymes, precipitating ballast proteins, followed by treating the product with quaternary ammonium bases and ethanol, tl and h and also, in order to improve cleaning, and to improve the cleaning of the product with ethanol, et al. , simplify and speed up the process, extraction of lipids is carried out with acetone, proteolytic cleavage - with papain in the presence of EDTA and cysteine, the target product is obtained by differential extraction th salt solutions of increasing ionic strength. (L

Description

vjvj

эоeo

vjvj

Изобретение относитс к клинической биохимии и касаетс способа вьщепени гликозаминогликанов (ГАГ) из лейкоцитов человека.This invention relates to clinical biochemistry and relates to the method for the cleavage of glycosaminoglycans (GAG) from human leukocytes.

Известен способ выделени ГАГ из лейкоцитов, включающий термоденатурацию лейкоцитов, экстрагинирование липидов этанолом и эфиром, переваривание проназой при 55°, обработку щелочью отделение белков и-нуклеиновых кислот трихлоруксусной кислотой, диализ дл освобождени от низкомолекул рных примечей и осаждение конечного продукта цетилпиридинхлоридом с последующим переосаждением этиловым спиртом, насыщенным ацетатом натри 1,A method for isolating GAGs from leukocytes is known, including thermodenaturation of leukocytes, extraction of lipids by ethanol and ether, digestion by pronaza at 55 °, alkaline treatment, separation of proteins and nucleic acids with trichloroacetic acid, dialysis for release from low molecular weight notes, and precipitation of the final product, ize, and the final product. alcohol, saturated with sodium acetate 1,

Однако полученные указанным методом ГАГ х актеризуютс гетерогенностью , что затрудн ет исследование их состава в клетках крови и изучение свойств отдельных видов ГАГ. Кроме того, известный метод не экономичен , как в силу длительности всей процедуры (13-14 дней), так и из-за применени дорогого импортного ферментп (проназы).However, GAG x obtained by this method are subjected to heterogeneity, which makes it difficult to study their composition in blood cells and to study the properties of certain types of GAG. In addition, the known method is not economical, both because of the duration of the entire procedure (13-14 days), and because of the use of expensive imported enzyme (pronase).

Цель изобретени - повьппение чистоты препарата гликозаминогликанов, упрощение и ускорение способа его The purpose of the invention is to increase the purity of the preparation of glycosaminoglycans, to simplify and accelerate its

вьщелени .on the spot.

I , .--,I, .--,

Поставленна цель достигаетс тем, что согласно способу выделени гликозаминогликанов из лейкоцитов крови путем экстракции липидов органическими растворител ми, .обработки протеолитическими ферментами, осаждни балластных белков с последующей обработкой продукта четвертичноаммонийными основани ми и этанолом экстракцию липкдов провод т ацетоном , про-теолитическое расщепление папаиноМ в присутствии ЭДТА и цистеина , целевой продукт получают дифференциальной экстракцией раство рами солей возрастающей ионной силыThis aim is achieved in that according to a method of isolating glycosaminoglycans blood leukocytes by lipid extraction with organic solvents, .obrabotki proteolytic enzymes osazhdni ballast proteins followed by treatment of the product chetvertichnoammoniynymi bases and ethanol lipkdov extraction was carried out with acetone, pro-proteolytic cleavage with papain in the presence of EDTA and cysteine, the target product is obtained by differential extraction with increasing salt ionic strength solutions

Способ осуществл етс следующим образом.The method is carried out as follows.

Лейкоциты крови, вьщеленные дифференциальным центрифугированием, обрабатывают двукратно 10-15 объема ми ацетона, фильтруют на воронке Бюхнера и высушивают на воздухе. Полученный сухой порошок растирают при помощи гомогенизатора с фермент но-буферной смесью, содержащей кристаллический папаин (2 мг Ha,.JOO мг сухого порошка), 5 мМ цистена иLeukocytes of blood, separated by differential centrifugation, are treated twice with 10-15 volumes of acetone, filtered on a Buchner funnel, and dried in air. The obtained dry powder is triturated with a homogenizer with an enzyme-buffer mixture containing crystalline papain (2 mg Ha, .JOO mg dry powder), 5 mM cystan and

4 мМ ЭДТА а в 0,05 М фосфатном буфере , рН 7,5. Ферментно-буферна смесь беретс из расчета 10 мл на 100 мг высушенных клеток. Суспензию клеток перенос т в небольшие флакон и инкубируют при 65°С в ультратермостате в течение 4 ч После окончаг ни переваривани к полученному лизату добавл ют 50%-ную трихлоруксусную кислоту до конечной концентрации 5%, и в течение ночи при происходит осаждение белков и ну .клеиновых кислот. Осадок удал ют центрифугированием при 3000 об/мин при . К супернатанту при интенсивном перемешивании добавл ют 4 объем охлажденного до О-(-5°) 96%-ного этанола и 50%-ного раствора ацетата до конечной концентрации 0,5%. Оставл ют дл формировани осадка при 0-4С в течение 18-24 ч. Сформировавпшйс хлопьевидный осадок, представл ющий собой ГАГ в смеси с гликгеном и другими высокомолекул рными соединени ми, отдел ют центрифугированием при 3000 об./мин при 0-4 в течение 20 мин. Осадок раствор ют в дистиллированной воде, добавл ют NaCl до конечной концентрации не вьш1е 0, 15 М, обеспечива полное растворение, после чего добавл ют 0,2 объема 5%-ного раствора бромистого цетилтриметиламмони (цетавлона ) - chemapol (Чехословаки ). Специфическое формирование комплекс са ГАГ с цетавлоном происходит в течение 30-60 мин при или 8-10 ч при комнатной температуре.4 mM EDTA a in 0.05 M phosphate buffer, pH 7.5. The enzyme-buffer mixture is taken at a rate of 10 ml per 100 mg of dried cells. The cell suspension is transferred to a small vial and incubated at 65 ° C in an ultrathermostat for 4 hours. After digestion, 50% trichloroacetic acid is added to the resulting lysate to a final concentration of 5%, and the precipitates and glucose acids. The precipitate is removed by centrifugation at 3000 rpm at. With vigorous stirring, add 4 volumes of the volume cooled to 0– (–5 °) 96% ethanol and 50% acetate solution to the supernatant to a final concentration of 0.5%. Leave to form a precipitate at 0-4 ° C for 18-24 hours. After forming a flaky precipitate, which is a GAG mixed with glycgen and other high molecular compounds, it is separated by centrifugation at 3000 rpm at 0-4 for 20 minutes. The precipitate is dissolved in distilled water, NaCl is added to a final concentration of not more than 0.15 M, ensuring complete dissolution, after which 0.2 volumes of a 5% aqueous solution of cetyltrimethylammonium bromide (cetavlon) - chemapol (Czechoslovakia) is added. The specific formation of the complex GAG with cetavlon takes place within 30-60 minutes at or 8-10 hours at room temperature.

Дл уплотнени осадка добавл ют 5-10 мг целита и отдел ют комплекс ГАГ - цетавлон центрифугированием . Осадок промывают 0,2 М NaCl дл удалени низкомолекул рных балластных примесей. Дифференциальную экстракцию ГАГ осуществл ют поочередным добавлением к осадку небольших объемов растворов хлористого натри в концентрации 0,5, 0,7, 1,0 и 2,0 М. Вследствие гетерогенности ГАГ (различий их по молекул рной массе и полианионным свойствам) их комплексы с детавлоном различаютс по растворимости, и при помощи дифференциальной экстракции удаетс выделить отдельно разные виды ГАГ. Фракции, экстрагируемые 1М и 2М NaCl, не различаютс , по составу, поэтому их объедин ют. Полученные фракции ГАГ переосаждают и дополнительно очищают от примесей добавлением 4 объемов охла1жденного до О этанола с добавлением ацетата Na в конечной концентрации 0,5-1%. Оса дение очищенных ГАГ происходит в течение ночи при 0-4°С, осадки отде л ют центрифугированием при 3000 об./мин в течение 20 мин. Полу ченные осадки ГАГ раствор ют в дистшшированной воде или физрастворе, при необходимости провод т стерилизующую фильтрацию через мембранные фильтры Миллипор, хран т в замороженном или лиофилизированном состо нии . Дл анализа фракций примен ют электрофорез в ацетатцеллюлозе содержание и выход ГАГ определ ют по концентрации уроновых кислот, определенньй карбазольным методом. Выход ГАГ в среднем составл ет 110130 мкг уроновых кислот на 100 мг ацетонового порошка лейкоцитов. Пример 1. К 280 мл донорской крови, заготовленной на консер винте с цитратом натри , добавл от 70 мл 3%-ного раствора пищевой желатины в физиологическом растворе хлорида натри , после чего в течение 1 ч клетки крови оседают при 37С. Верхний плазменный слой, содержащий лейкоциты и тромбоциты, перенос т в центрифужные стаканы и центрифугируют при 1200 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре на центрифуге К-70. Осадок лейкоцитов (1 мл) двукратно промывают 10 мл физиологического раствора на центрифутер Ш1К-1 при 1000 об./мин. Дл удалени примеси эритроцитов к промытому осадку добавл ют 7 мл охлажденного 0,83%-ног Шу-С в 0,0125 М трис-НСЕ буфере, рН 7,4, затем пробу тщательно перемешивают и удал ют образовавшийс . гёмолизат центрифугир1ованием на ден рифугер Щ1К-1. Осадок промывают физиологическим раствором, Вьзделенные лейкоцитов (в объеме 0,6 мл) обрабатывают 9 мл ацетона, затем растирают в гомогенизаторе и фильтруют через воронку Бюхнера,использу вакуумный насос. Полученный порошок обезвоженных и частично обезж ренных клеток высушивают на воздухе Из 280 мл донорской крови получа ют 100 мг сухого порошка клеток. К 100 мл сухого порошка клеток приливают 10 мл ферментно-буферной смеси, содержащий 2 мг кристаллического папаина, 8,7 мг цистеина и 18,6мг ЭДТА в 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,5, и растирают в гомогенизаторе. Взвесь перенос т во флакон емкостью 20 мл и инкубируют в ультратермостате при 65 С в течение 4 ч. После окончани переваривани к полученному лизату добавл ют 1,0 мл 50% ТХУ. Смесь оставл ют на ночь в холодильнике при 4°С дл осаждени белков и нуклеиновых кислот. Осадок удал ют центрифугированием при 3000 об/мин при . К супернатанту при интенсивном перемешивании добавл ют 40 мл 96%-ного охлажденного этилового спирта и 0,5 мл 50%-ного раствора ацетата Na, Оставл ют до формировани осадка в течение 18 ч при 4°С Сформировавшийс хлопьевой белый осадок отдел ют центрифугированием при 3000 об/Miffl при в течение 20 мин, супернатант отбрасывают. Осадок раствор ют в 2,0 мл дистиллированной воды и добавл ют 3 капли 1,0м раствора хлорвда натри до полного растворени , К пробе добавл ют 0,4 мл 5%-ного водного, раствора цетавлона; Осаждают ГАГ при 37С в течение 1 ч. Дл получени более плотного осадка добавл ют 10 мг целита и провод т центрифугирование пробы при 4000 об/мин в течение 10 мин при комнатной - емпературе, супернатант удал ют, а осадок суспендируют в 2,0 мл 0,2 М раствора NaC, Дифференциальную экстракцию ГАГ из компле сса с цетавлоном осуществл ют добавление- к осадку раствора хлорида Na:1- экстракци проводились 0,5 М NaCl (1,5 мл); 2- экстракци - 1,0 мл 0,7 М NaC, 3- - 1,0 мл 1,0 М NaCl, 4- 0,5 мл 2,0м раствора хлорвда натри , После каждой экстракции пробу центрифугируют . Экстракты ГАГ, полученные при концентрации NaCt 1,0 и 2,0 М, объедин ют. Полученные фракции ГАГ при концентрации хлорида Na 0,5, 0,7 и 1 +2,0 М переосаждают соответственно 6,0; 4,0 и 6,0 мл. переохлажденного до -4С этанола при этом в каждую пробу с ГАГ добавл ют 3 капли 50%-ного раствора ацетата Nd, Осадки, содера цие очищенные ГАГ, раствор ют в дистиллированной воде. После определени содержани ГАГ пробы замора живают или подвергают стерилизук цей фильтрации с последующей лиофилизацией целевого продукта. Выход ГАГ из лейкоцитов составл ет 120 мкг уроновых кислот из 100 мг сухого порошка. Пример 2. Вс процедура получени ГАГ проводитс по примеру 1, за исключением некоторых режимов - параметров способа. Так, например , при полученш лейкоцитов осадок лейкоцитов (1,2 мл) двукратно промывают 15 мл физиологического раствора; дл удалени примеси эритроцитов к промытому осадку добавл ют 10 мл охлажденного 0,83%-ного в 0,0125 М трис-НС буфере...Вьщеленные клетки лейкоцитов (0,7 мл) обрабатывают 7,0 мл ацетона. Из 280 мл донорской крови получают 105 мг сухо го порошка клеток. При получении ГАГ осаждение белков и нуклеиновых кислот провод т при 6°С...После добавлени охлажденного спирта и ацетата натри осадок формируетс в течение 24 ч. Осаждают ГАГ при 37С в течение 30 мин. Дл уплотнени осадка добавл ют 5 мг целита... Выхрд ГАГ из лейкоцитов составл ет 115 мкг уроновых кислот из 100 м сухого порошка. П р и м е р 3. То же самое, что в примере 1, только стадию осаждени ГАГ цетавлоном провод т при комнатной температуре в течение 10 ч. Выход ГАГ из лейкоцитов составл ет 130 мкг уроновых кислот из 100 м ацетонового порошка клеток. Идентификацию гликозаминогликонов осуществл ют следующим образом. Анализ фракций ГАГ включает определение содержани гексазаминрв, галактозаминов, уроновых кислот, сульфата и электрофоретический анаЛИЗ на ацетатцеллюлозных пленках. Электрофорез провод т в 0,25 МTo consolidate the precipitate, 5-10 mg of celite is added and the GAG-cetavlon complex is separated by centrifugation. The precipitate is washed with 0.2 M NaCl to remove low molecular weight ballast impurities. Differential extraction of GAG is carried out by alternately adding to the sediment small volumes of sodium chloride solutions at concentrations of 0.5, 0.7, 1.0 and 2.0 M. Due to the heterogeneity of GAG (their differences in molecular weight and polyanionic properties), their complexes with The differences in solubility are determined by a variety of different types of GAGs by means of differential extraction. The fractions extracted with 1M and 2M NaCl do not differ in composition, so they are combined. The obtained GAG fractions are re-precipitated and are additionally purified of impurities by adding 4 volumes of ethanol cooled to O with the addition of Na acetate in a final concentration of 0.5-1%. The precipitation of purified GAGs occurs overnight at 0–4 ° C, and the precipitates are separated by centrifugation at 3000 rpm for 20 minutes. The resulting GAG precipitates are dissolved in distilled water or saline, if necessary, sterilized by filtration through Millipore membrane filters, stored in a frozen or lyophilized state. For the analysis of fractions, cellulose acetate electrophoresis is used and the content of GAG is determined by the concentration of uronic acids determined by the carbazole method. The yield of GAG is on average 1,10130 µg of uronic acids per 100 mg of leucocyte acetone powder. Example 1. To 280 ml of donated blood, prepared on a conserving screw with sodium citrate, was added from 70 ml of a 3% aqueous solution of edible gelatin in physiological sodium chloride solution, after which the blood cells were deposited at 37 ° C for 1 h. The upper plasma layer containing leukocytes and platelets is transferred into centrifuge cups and centrifuged at 1200 rpm for 15 minutes at room temperature on a K-70 centrifuge. The leukocyte sediment (1 ml) is washed twice with 10 ml of physiological solution per centrifter Sh1K-1 at 1000 rpm. To remove the erythrocyte impurities, 7 ml of cooled 0.83% Shu-C in 0.0125 M Tris-HCE buffer, pH 7.4, are added to the washed precipitate, then the sample is thoroughly mixed and removed. hemolysate centrifugation for den rifuger Shch1K-1. The precipitate is washed with physiological saline, the extracted leukocytes (0.6 ml in volume) are treated with 9 ml of acetone, then triturated in a homogenizer and filtered through a Buchner funnel using a vacuum pump. The obtained powder of dehydrated and partially dehydrated cells is dried in air. From 280 ml of donor blood, 100 mg of dry cell powder is obtained. 10 ml of an enzyme-buffer mixture containing 2 mg of crystalline papain, 8.7 mg of cysteine and 18.6 mg of EDTA in 0.05 M phosphate buffer, pH 7.5, are poured into 100 ml of dry cell powder and triturated in a homogenizer. The slurry is transferred to a 20 ml vial and incubated in an ultrathermostat at 65 ° C for 4 hours. After digestion is complete, 1.0 ml of 50% TCA is added to the resulting lysate. The mixture is left overnight in a refrigerator at 4 ° C to precipitate proteins and nucleic acids. The precipitate is removed by centrifugation at 3000 rpm at. With vigorous stirring, 40 ml of 96% chilled ethyl alcohol and 0.5 ml of 50% Na acetate solution are added to the supernatant. Leave to form a precipitate for 18 hours at 4 ° C. A white flocculent precipitate is separated by centrifugation at 3000 rpm / miffl at for 20 min, the supernatant is discarded. The precipitate is dissolved in 2.0 ml of distilled water and 3 drops of 1.0 m sodium chloride solution are added until complete dissolution. 0.4 ml of 5% aqueous, cetavlon solution is added to the sample; GAG is precipitated at 37 ° C for 1 hour. To obtain a more dense precipitate, 10 mg of celite is added and the sample is centrifuged at 4000 rpm for 10 minutes at room temperature, the supernatant is removed, and the precipitate is suspended in 2.0 ml 0.2 M NaC solution, Differential extraction of GAG from the complex with cetavlon is carried out by adding to the precipitate a solution of Na chloride: 1-extraction was carried out with 0.5 M NaCl (1.5 ml); 2- extraction - 1.0 ml of 0.7 M NaC, 3- - 1.0 ml of 1.0 M NaCl, 4- 0.5 ml of 2.0 m sodium chlorine solution. After each extraction, the sample is centrifuged. The GAG extracts obtained at a NaCt concentration of 1.0 and 2.0 M are combined. The obtained GAG fractions at a Na concentration of 0.5, 0.7, and 1 + 2.0 M are reprecipitated, respectively, 6.0; 4.0 and 6.0 ml. in this case, to each sample with GAG 3 drops of 50% aqueous solution of Nd acetate are added. The precipitates containing purified GAG are dissolved in distilled water. After determining the GAG content, samples are frozen or sterilized by filtration, followed by lyophilization of the target product. The yield of GAG from leukocytes is 120 µg of uronic acids from 100 mg of dry powder. Example 2. The entire procedure for obtaining a GAG is carried out as in Example 1, except for some modes — method parameters. For example, when leukocytes are obtained, the leukocyte sediment (1.2 ml) is washed twice with 15 ml of saline; 10 ml of cooled 0.83% in 0.0125 M Tris-HC buffer are added to the washed precipitate to remove the erythrocyte admixture. Isolated leukocyte cells (0.7 ml) are treated with 7.0 ml of acetone. From 280 ml of donor blood, 105 mg of dried cell powder is obtained. In the preparation of GAG, the precipitation of proteins and nucleic acids is carried out at 6 ° C ... After the addition of chilled alcohol and sodium acetate, a precipitate is formed within 24 hours. GAG is precipitated at 37 ° C for 30 minutes. To compact the precipitate, 5 mg of celite is added ... The excrement of the leukocyte GAG is 115 µg of uronic acids from 100 m of dry powder. EXAMPLE 3: Same as in Example 1, only the step of precipitating GAG with cetavlon is carried out at room temperature for 10 hours. The yield of GAG from leukocytes is 130 µg of uronic acids from 100 m of acetone cell powder. The identification of glycosaminoglycons is carried out as follows. Analysis of the GAG fractions includes determination of the content of hexazaminrv, galactosamines, uronic acids, sulfate and electrophoretic anaLysis on cellulose acetate films. Electrophoresis is carried out in 0.25 M

Са-ацетатном буфере, рН 5,5 при ппот- 50 ьгх лейкозами. ности тока 0,5 Ма/см в течение 4 ч на приборе ПЭФ-3 на ацетатцеллюлозных пленках фирмы Pratiga (Итали ) с перфорацией. Пробы нанос т при помощи амшшкатора этой же фирмы. Окраску электрофореграмм провод т 0,5%-ным раствором Алциан синего в 3%-ном растворе CHjCOOH или 0,2%ным раствором толуидина в 2%-ном CHjCOOH с последующей отмывкой фона 1%-ным раствором , а затем водой. В качестве стандартов ГАГ используетс хондройтин-4-сульфат Sigma (США), гиалуронова кислота, полученна из стекловидного тела кролика, и гепарансульфат из печени крысы.. Электрофоретические исследовани ГАГ, выдел емых из лейкоцитов крови, свидетельствуют о том, что они представлены в основном хондроитинсульфатом , об этом также говор т данные определени гексозаминов, сульфата . и уроновых кислот и их соотношение. Тот факт, что ГАГ расщепл ютс тестикул рной гиалуронидазой без образовани свободного ацетилгексозамина, свидетельствует о том, что ГАГ лейкоцитов представлены хондроитинсульфатом . Предлагаемый метод вьвделенич ГАГ из лейкоцитов крови позвол ет значительно ускорить и упростить процедуру выделени ГАГ (сокращаетс врем вьщелени от 13-14 до 4 сут} исключаетс стади диализа, сокращаетс врем протеолиза с 2-3 сут до 4 ч и т.д.). Кроме того, в предлагаемом методе не используютс дефицитные реактивы, в частности проназы. Предлагаемый метод позвол ет получить целевой продукт в более очицен- ном виде, об этом свидетельствуют данные электрофорбтического анализа. Разработанный способ выделени ГАГ из лейкоцитов крови позвол ет проводить исследовани количественного содержани ГАГ, их состава в клетках крови здоровых людей и больCa-acetate buffer, pH 5.5 at a dose of 50% leukemia. current of 0.5 Ma / cm for 4 h on a PEF-3 device on cellulose acetate films of Pratiga (Italy) with perforation. Samples are applied using an amhshkator of the same company. Electrophoregram painting was carried out with a 0.5% Alcyan blue solution in a 3% CHjCOOH solution or a 0.2% toluidine solution in a 2% CHjCOOH solution, followed by washing the background with a 1% solution, and then with water. The GAG standards used are chondroitin-4-sulfate Sigma (USA), hyaluronic acid obtained from the vitreous of the rabbit, and heparan sulfate from rat liver .. Electrophoretic studies of GAG secreted from blood leukocytes indicate that they are represented mainly chondroitin sulfate, these definitions of hexosamines, sulfate also speak of this. and uronic acids and their ratio. The fact that GAG is cleaved by testicular hyaluronidase without the formation of free acetylhexosamine suggests that GAG leukocytes are chondroitin sulfate. The proposed method of installing GAG from blood leukocytes significantly speeds up and simplifies the procedure for isolating GAG (shortening the time from 13-14 to 4 days} eliminates the dialysis step, reduces the time of proteolysis from 2-3 days to 4 hours, etc.). In addition, the proposed method does not use deficient reagents, in particular pronase. The proposed method allows to obtain the target product in a more precise form, as evidenced by the data of electrophoresis analysis. The developed method for isolating GAGs from blood leukocytes allows the study of the quantitative content of GAGs, their composition in the blood cells of healthy people, and pain

Claims

4 mM EDTA a in 0.05 M phosphate buffer, pH 7.5. The enzyme-buffer mixture is taken at the rate of 10 ml per 100 mg of dried cells. The cell suspension is transferred into small vials and incubated at 65 ° C in an ultra-thermostat for 4 hours. After completion of the digestion, 50% trichloroacetic acid is added to the resulting lysate to a final concentration of 57 ″, and overnight at 4-6 ° C precipitation of proteins and nucleic acids. The precipitate was removed by centrifugation at 3000 rev / min at 0 ^Q C. To the supernatant was added with vigorous stirring to 4 volumes of chilled 0 - (- 5 °) 96% ethanol and 50% sodium acetate solution to a final concentration of 0.5%. Leave to form a precipitate at 0-4 ° C for 18-24 hours. The formed flocculent precipitate, which is a GAG mixed with glycogen and other high molecular weight compounds, is separated by centrifugation at 3000 rpm./min at 0-4 ° for 20 min The precipitate is dissolved in distilled water, NaCl is added to a final concentration of no higher than Q, 15 M, ensuring complete dissolution, after which 0.2 volumes of a 5% solution of cetyltrimethylammonium bromide (cetavlon) - chemapol (Czechoslovakia) are added. The specific formation of the complex: GAG with cetavlon occurs within 30-60 minutes at 37 ° C or 8-10 hours at room temperature.

5-10 mg of celite and the GAG – cetavlon complex is separated by centrifugation. The precipitate is washed with 0.2 M NaCl to remove low molecular weight ballast impurities. Differential GAG extraction is carried out by alternately adding small volumes of sodium chloride solutions to the precipitate at a concentration of 0.5, 0.7, 1.0, and 2.0 M. Due to the heterogeneity of the GAG (their differences in molecular weight and polyanionic properties), their complexes with cetavlon differ by solubility, and by differential extraction, it is possible to separate separately different types of GAG. The fractions extracted with 1M and 2M NaCl do not differ in composition, therefore they are combined. The obtained GAG fractions are reprecipitated and additionally purified from impurities by adding 4 volumes of ethanol cooled to 0 ° with the addition of Na acetate in a final concentration of 0.5-12. Precipitation of purified GAGs occurs during the night at 0–4 ° C; precipitates are separated by centrifugation at 3000 rpm for 20 min. The resulting GAG precipitates are dissolved in distilled water or saline, if necessary, sterilizing filtration is carried out through ’’ Millipore membrane filters, and stored in a frozen or lyophilized state. For analysis of fractions, electrophoresis in cellulose acetate is used, the content and yield of GAG are determined by the concentration of uronic acids determined by the carbazole method. The GAG yield averages 1 среднем1 30 μg of uronic acids per 100 mg of leukocyte acetone powder.