SU1138412A1

SU1138412A1 - Method for preparing hybrid cells

Info

Publication number: SU1138412A1
Application number: SU833628117A
Authority: SU
Inventors: Александр Наумович Наровлянский; Алефтина Михайловна Амченкова; Ольга Николаевна Щегловитова; Яков Ефимович Хесин
Priority date: 1983-07-21
Filing date: 1983-07-21
Publication date: 1985-02-07

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК, включающий сли ние клеток, элиминацию родительских клеток, последующее выращивание и клонирование гибридных клеток, отличающ и и с тем, что, с целью упрощени способа и сокращени во времени, элиминащоо родительских клеток провод т поеледов1ательным использованием интерферонов и цитоцидных вирусов.A METHOD FOR OBTAINING HYBRID CELLS, including cell fusion, elimination of parental cells, subsequent cultivation and cloning of hybrid cells, is also distinguished by the fact that, in order to simplify the method and reduce it in time, eliminative parental cells are spent using interferons and cytocidal viruses.

Description

Изобретение относитс к медицине, «5иЬлогии, сельскому хоз йству, иммунологии , в частности к генетике соматических клеток. Метод гибридизации соматических клеток в последние годы приобрел ирключительно важное значение при решении практических и теоретических задач биологии, медицины к сельского хоз йстба. Он используетс дл ка тировани локализации генов в хромосомах , дл анализа регул ции генов в клетках эукариотов, изучени механизмов контрол роста и дифферен цировки клеток в процессах развити зародьшей, заживлении ран, образовании опухолей. Пр именение этого метода в медицинской практике расшир ет возможности генетического консультировани , вы влени латентных опухолеродных вирусов, проверки опухолевы клеток на присутствие в них онкогенных вирусов. Наконец, гибридизаци клеток лежит в основе получени гибридом продуцирующих моноклональные актитела, которые наход т разнообраз ное применение в иммунологии и биоХШ4ИИ . Известен способ получени гибридных клеток, в котором используетс селективна система, характеризующа с тек, что в.ней маркируетс одна родительска клетка, представл юща собой двойной мутант, устойчивый как к тиогуанину, и к уабаину (Уа). При сли нии такой мутантной клетки с но1 1альной клеткой, чувствительной к уабаину ГГФРТ, Уа), образуютс гибриды, способные ; расти в селективной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин, так называемой среде ТАТ, в которую также добавлен уаба н. Родительские клетки в этих услови х элимини , руютс О. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату вл етс способ получени гибридных клеток с помощью выращивани мутантных клеток, устой чивых к азагуанину (АГ) (в клетках отсутствует фермент ГГФРТ) и бромдезоксиуридину (БУдР) (в клетках отсутствует фермент тимидинкиназа ТК ), их сли ни с применением полиэтиленгликол (ПЭГ) или вируса Сендай и выращивани на селективной среде ГАТ, где родительские мутантные клетки погибают, а гибридные выживают С2j. Недостатками известных способов вл ютс необходимость получени и выращивани мутантных клеток, длительность процесса получени и изучени мутантных клеток, необходимость использовани дорогосто щих биологически активных веществ. Цель изобретени - упрощение способа и сокращение во времени. Поставленна цель достигаетс тем, что согласно способу получени гибридных клеток, включающему сли ние клеток, элиминацию родите1п ских клеток , последующее выращивание и клонирование гибридных клеток, элиминацию родительских клеток провод т последовательным использованием интерферонов и цитоцидных вирусов. Способ осуществл ют следующим образом . Родительские клетки скрещивают, вьфащивают на питательной среде до моносло , состо щего из смеси родительских и гибридных клеток, удал ют из культурапьных флаконов клетки сначала одного родител , а затем другого и культивируют оставшиес клетки до .образовани колоний . Дл скрещивани используют интерферончувствительные клетки родительских линий. Удаление родительских клеток производ т путем последовательной обработки сначала интерфероном, специфическим дл одного ввда родительских клеток, и заражени цитоцидным вирусом, элиминйфу таким образом родительские клетки другого ввда, и далее, после отмывани культуры, внесением в нее интерферона , специфического дл второго вида клеток, заражением цитоцидным вирусом, который элиминирует родительские клетки первого вида, в результате чего сохран ютс лишь гибридные клетки. / Пример. Выделение гибридных клеток при скрещивании в суспензии перевиваемых клеток мыши L и перевиваемых человеческих клеток J... Дл сли ни используют культуру человеческих клеток J-96, чувствительную к человеческому лейкоцитарному интерферону, и линию мышиных клеток Laja чувствительную к действию мышиного интерферона. Сли ние провод т с: помощью 50%-ного раствора ПЭГ-1550. Сн тые трипсином и отмытые клетйи J-96 в количестве 6 10 и Uj29 количестве 9-10 перемешивают, центрифугируют 10 14ин при 250jg;-, надосадок отсасывают и . на клетки наслаивают 1 мл раствора ПЭГ, перемешивают легким потр хиванием 80 с, кваащы промывают средой . 199 с последуюпщм центрифугированием и высевают во флаконы или чашки Петри из расчета 310 клеток/мл с 20% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (КРС), через 2 ч мен ют среду на свежую того же состаЬа. .The invention relates to medicine, biology, agriculture, immunology, in particular to the genetics of somatic cells. The method of hybridization of somatic cells in recent years has acquired an exceptional importance in solving practical and theoretical problems of biology and medicine for agriculture. It is used to locate genes in chromosomes, to analyze gene regulation in eukaryotic cells, to study the mechanisms of growth control and cell differentiation in the development of embryo, wound healing, and the formation of tumors. The use of this method in medical practice extends the possibilities of genetic counseling, the detection of latent tumor-like viruses, and the testing of tumor cells for the presence of oncogenic viruses in them. Finally, hybridization of cells underlies the production of hybridomas producing monoclonal antibodies, which find various uses in immunology and bio-C4I4. A method for producing hybrid cells is known, in which a selective system is used, which is characterized by the fact that one parental cell is labeled, which is a double mutant, resistant to both thioguanine and ouabain (VA). Upon fusion of such a mutant cell with a no1 1 cell sensitive to ouabain GGFRT (Va), hybrids capable of being formed; grow in selective medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine, the so-called TAT medium, to which uaba n. Parental cells in these conditions are eliminated, ruled by O. The closest to the invention in its technical essence and the achieved result is a method for producing hybrid cells by growing mutant cells resistant to azaguanine (AG) (the cells lack the enzyme GHGFT) and bromodeoxyoxyuridine ( BUDR) (thymidine kinase TK enzyme is absent in cells), they are fused with the use of polyethylene glycol (PEG) or Sendai virus and grown on GAT selective medium, where the parental mutant cells die and the hybrid survives C2j. The disadvantages of the known methods are the necessity of obtaining and growing mutant cells, the duration of the process of obtaining and studying mutant cells, the need to use expensive biologically active substances. The purpose of the invention is to simplify the method and shorten it in time. This goal is achieved in that according to the method of producing hybrid cells, including cell fusion, elimination of parental cells, subsequent cultivation and cloning of hybrid cells, elimination of parental cells is carried out by the sequential use of interferons and cytocidal viruses. The method is carried out as follows. Parental cells are crossed, infused on a nutrient medium to a monolayer consisting of a mixture of parental and hybrid cells, the cells of one parent are removed from the culture flasks first and then the other are cultured until the colonies are formed. For crossing, interferon-sensitive cells of the parental lines are used. The removal of the parent cells is carried out by sequential treatment first with interferon specific for one species of the parent cells and infection with a cytocidal virus, thus eliminating the parent cells of the other species, and then, after washing the culture, introducing interferon specific for the second type of cell into it, infection a cytocidal virus that eliminates the parent cells of the first type, resulting in only hybrid cells being retained. / Example. Isolation of hybrid cells when crossed in a suspension of transplantable mouse L cells and transplanted human J ... cells. For fusion, a J-96 human cell culture sensitive to human leukocyte interferon and a Laja mouse cell line sensitive to the action of mouse interferon are used. The fusion is carried out with: using a 50% PEG-1550 solution. Trypsin and washed J-96 stands in the amount of 6 10 and Uj29 in the amount of 9-10 are mixed, centrifuged 10 14 in at 250jg; -, the supernatant is sucked off and. 1 ml of a PEG solution is layered on the cells, mixed by lightly rubbing for 80 s, and washed with medium. 199 followed by centrifugation and seeded into vials or Petri dishes at the rate of 310 cells / ml with 20% fetal bovine serum (C), after 2 hours, change the medium to fresh with the same composition. .

Полученна в результате сли ни смесь клеток состоит из родительских клеток обоих вцдов и двух групп много дерных клеток: гомокарионов, содер ащих дра одного типа клеток, и гетерокарионов (или гибридных клеток ), содержащих дра обоих родительских типов. Дл избирательного выделени и размножени гибридных клеток необходимо добитьс гибели всех названных типов клеток, кроме гетерокарионов . Через 18 ч среду замен ют на среду 199 с 2% эмбриональной сыворотки КРС с добавлением мьш1иного интерферона из расчета 50 ед/мл. Через 6 ч ввод т вирус везикул рного The resulting cell fusion mixture consists of the parent cells of both vtsdov and two groups of multi-nucleated cells: homocarions containing the nuclei of the same type of cells, and heterokaryons (or hybrid cells) containing the nuclei of both parental types. In order to selectively isolate and multiply hybrid cells, it is necessary to achieve the death of all of these cell types, except for heterocarions. After 18 h, the medium is replaced with medium 199 with 2% fetal bovine serum with the addition of lung interferon at the rate of 50 units / ml. After 6 hours, vesicular virus is introduced.

.стоматита (BBC) из расчета 2-10 Через 18 ч, т.е. после- гибели человеческих клеток и гомокарионов, не несущих рецепторов к мышиному интерферону, клетки отмывают от вируса раствором Хенкса (или освобождаютс от вируса введением антисыворотки ) . Заливают среду 199 с 20% эмбриональной сыворотки КРС с добавлением человеческого лейкоцитарного интерферона из расчета 80 МЕ/мл. После б ч ввод т вирус ВВС из расчета 2 -10 . Через 18 ч клетки отмывают от вируса раствором Хенкса (или освобождаютс от вируса введением антисыворотки) и запивают средой 199 с 20% эмбриональной сыворотки.somatite (BBC) at the rate of 2-10 After 18 h, i.e. After the death of human cells and homocarions that do not carry receptors for the murine interferon, the cells are washed from the virus with Hanks solution (or released from the virus by administering antisera). Wednesday 199 is filled with 20% of fetal bovine serum with the addition of human leukocyte interferon at the rate of 80 IU / ml. After bh, the air force virus is introduced at the rate of 2 -10. After 18 hours, the cells are washed from the virus with Hanks solution (or released from the virus by the administration of antiserum) and washed down with medium 199 with 20% fetal serum

|КРС с добавлением глютамина.Колонки гибридных клеток, по вл ютс через 2 недели, их реклонируют и размножают 11редлагаемый способ позвол ет получить гибриды соматических клеток.Cattle with the addition of glutamine. Columns of hybrid cells, which appear after 2 weeks, are recloned and multiplied by the proposed method, which makes it possible to produce somatic cell hybrids.

.Метод применим как дл получени межвидовых гибридных клеток, когда родительские культуры чувствительны к интерферону, так и дл получени внутривидовых гибридов в случае,. The method is applicable to both interspecific hybrid cells, when the parental cultures are sensitive to interferon, and to obtain intraspecific hybrids in the case

.если один из родительских партнеров не чувствителен к интерферону .If one of the parent partners is not sensitive to interferon.

Claims

METHOD FOR PRODUCING HYBRID CELLS, including cell fusion, elimination of parental cells, subsequent cultivation and cloning of hybrid cells, characterized in that, in order to simplify the method and reduce time, elimination of parental cells is carried out by sequential use of interferons and cytocidal viruses.

1 1138412