SU1115754A1 - Способ получени конъюгатов гемагглютинина вируса гриппа с синтетическими полиэлектролитами - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЬЮГАТОВ ГЕМАГГЛЮТИНИНА ВИРУСА ГРИППА С СИНТЕТИЧЕСКИМИ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТАМИ путем ковалентного св зывани  гемагглютинина с ащшированкыми карбодиимидом полиэлектролитами , отличающийс  тем, что, с целью пролонгировани  иммуногенности целевого продукта, в качестве полиэлектролитов используют сополимеры акриловой кислоты и N-винилпирролидона. (Л

Description

Изобретение отнсх;итс  к сшгтезу биологиче ки активных соединений, конкретно к способ получени  конъюгатов гемагглютншша i; полимерами - полиэлектролитами. Известен способ получени  коныогатов взаимодействием очень слабого иммуногена - бычьего сывороточного альбумина с кватернизованным поли-Фвинилпиридлном . Иммунизаци  полученными конъюгатами вызывает иммунный ответ с накоплением специфических антителообразующих клеток (на альбумин ), число которых значительно превышает число ютеток, накапливающихс  при раздельном введении животных альбумина и кватер}шзованлого поли-4-ви шлпиридина 1. Однако )Югаты альбумин- поли-4-винилпиридин не могут найти широкого правстического применени , так как кватернизованный поли-4-винилпиридин  вл етс  весьма токсичным полимером (LD - 80 мг/кг) и, кроме того, получение высоких титров против альбу мина не  вл етс  актуальным дл  современной иммунологии. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому положител ному эффекту  вл етс  способ получени  конъюгатов гемагглютинина вируса гриппа с синтетическими полиэлектролитами, заключающийс  в ковалентном св зывании гемагглю тинина с ацилированными карбодиимидом полиэлектролитами, причем в качестве полиэлектролитов используют гетерогенные поли амины 2. Недостатком способа  вл етс  низка  продолжительность иммуногенного действи  полученных конъюгатов - не более 12 сут (табл. 1). Целью изобретени   вл етс  пролонгирование иммуноге1шости делевого продукта. Поставленна  цель достигаетс  тем, что согласно способу получени  конъюгатов гемаггл тинина вируса гриппа с синтетическими полизлектролитами путем ковалетного св зывани  гемагглютинина с ацилированными карбодицидом полизлектролитами, в качестве полиэлектролитов используют сополимеры акриловой кислоты и N-винилпирролидона. CyniHocTb предлагаемого способа состоит в ковалентном св зывании по реакции ацилировани  карбодиимидным способом сополимера акриловой кислоты и N-винилпирролидона с гемагглютинином в буферном растворе (рН 6,8), с ионной силой 0,1 - 1,0 М NaCI при 2-4°С. В качестве ацилируюшего агента используют водорастворимый п-толуолсульфат-N- 2- (4-морфолиний) этил карбо/даимид Ковалентное св зывание гемагглютинина вируса гриппа осуществл ют с полимерами различных составов И молекул рных масс. Используют сополимеры, содержащие 10, 20, 40, 50, 60, 70, 80, 90 мол.% акриловой кислоты и с мол. мае. 10000 и 200000. Конъюгат отдел ют от несв завшегос  белка и сополимера гель-фильтрацией на колонке с сефадексом . Высзшивают лиофильно. Идентифицируют полученные конъюгаты по электрофоретической подвижности, котора  отличаетс  от подвиж- ности гемагглютинина и сополимера. Количест во св завшегос  белка определ ют с помощью УФ-спектроскопии и методом Лоури, количество ковалентных св зей оценивают по результатам спектрофотометрического титровани  свободнь1х аминогрупп тринитробензолсульфокислотой . Дл  иммунологических экспериментов используют конъюгаты, содержащие от 50 мкг до 1 мг гемагглютинина на 1 мг конъюгата с количеством ковалентных св зей 5-209о. Установлено, что полученные конъюгаты устойчивы к биодеструкции и вывод тс  из организма крайне медленно. Эффект вакцины определ етс  величиной и длительностью протективного действи . В случае устойчивых к биодеструкции соединений длительность воздействи  на иммуносистему организма увеличиваетс . Это важно с точки зрени  пролонгировани  эффекта вакцины путем увеличени  времени циркугт ции конъюгата в кровотоке, а также включени  новых клонов клеток иммунной пам ти. Устойчивые к биодеструкции синтетические полимеры позвол ют пролонгировать иммунные и вакцинирующие свойства конъюгатов на их основе. Пример. Сополимеры акриловой кислоты и N-винилпирролидона получают методом радикальной их сополимеризавди в присутствии радикального инициатора - надсернокислого аммони  3. Состав мономерной смеси определ ют с учетом известных констант сополимеризации мономеров. Сополимеры выдел ют осаждением в эфир, затем диатизируют и высушивают лиофильно. Содержание акриловой кислоты в сополимере определ ют ИК-спектроскопии (1720 см ) и потенциометрическим титрованием. Молекул рные массы оценивают вискоэиметрически. Синтез конъюгата провод т по реакции ацилировани  в присутствии водорастворимого карбодиимида - П-толуолсульфоната-Ы-цикло-гексил-N- 2(4-морфолиний) этил карбодиимида. 30 мг сополимера (мол. мае. 100000, эквимольного состава 50:50) раствор ют в 2 мл фосфатного буфера (рН 6,8, ионна  сила 0,1 М NaCl). К раствору сначала добавл ют 2 мг гемагглютинина в 0,5 мл того же буфера, а затем при перемешивании и

охлаждении (2-4С) 20 мг карбодииноща в 0,5 мл буфере. Раствор вьщерживают в течение 24 ч при перемешивании и охлаждении, затем добавл ют 0,1 ммоль ацетата натри .

Несв занные ковалентно белок и ал по лимер раздел ют с помощью гельхроматографии на колонне (1,7x80 см), заполненной се адексом G-150, скорость элюировани  50 мл/ч. Элюирование провод т 0,05 М фосфатным буфером (рН 8,2) с ионной сило 1,0 М NaCl. Раствор диапизуют через полупроницаемую целлофановую мембрану сначала против 0,15 М NaCl, затем против дистиллированной воды в течение 48 ч. Раствор высушивают лиофильно.

Количество св занного белка, определенного по методу Лоури и с помощью УФ-спектроскопии (280 нм), 100 мкг на 1 мг конъюгата. Количество ковалентных св зей, определеш1ых спектрофотометричемким титрованием свободных аминогрупп тринитробензолсульфокислотой , 17%.

Сополимеры различного состава и молекул рной массы, а также конъюгаты на их основе различного состава, содержащие различное количество ковалентных св зей получены способом аналогичным примеру.

Изучение иммуногенности конъюгата, полученных согласно примеру.

Опыты проводили на мышах .линии СВА и СВАХС57 В /F, весом 22-24 г. Мышей иммунизировали внутрибрюшинно изолированным гемагглютинином, смесью гемагглютинин сополимер и конъюгатом гемагглютинин-сополимер . Через 7-8 дней после иммунизации в

селезенке животных определ ли содержание актителообразующих клеток, использу  зритроЩ1ТЫ барана, нагруженные вирусом гриппа.

Реакцию гкперчувствительности заме).1ленного типа против гёмаглютинина индуцировали внутриОрюшинной иммунизацкгй животных изолированным гемагглюнитином, смесью гемаплюганина с сополимером или конъюгатом .

В табл. 1 приведены данные о пролонгирова№1И иммуногенности полученных конгьюгатов по сравнению с иммуногенностью конъюгатов , полученных по известному способу. Получе1шые по предлагаемому способу конъюгаты сохран ют иммунологическую активность по крайней мере в течени 18 сут, тогда как, конъюгаты гемагглютинина с производными гетероцепных полиаминов в течение 12 сут.

При исследопании конъюгатов обнаружено повышение иммуногенности в 44 раза (табл.2) Анализ специфичности указывает на строгую гемагглютинин -специфичность антителообразующих клеток. Иммунизаци  конъюгатом обеспечивает развитие значительно более выраженной реакции гиперчувствительности, высота которой превышает в 11 раз таковую в ответ на введение изолированного гемагглютина.

Таким образом, использование предлагаемого способа позвол ет получить также конъюгаты гемагглютинина с полиэлектролитами, которые обладают прологированными иммуноreifflbiMH свойствами, сохран   при зтом высокую иммуногенность, специфичность и способность обеспечить при этом развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа.

5050100 3244 4444 4060100 2030 3030 6040100 3540 4040 40100 10070 Полиамины

Дл  сравнени  приведены данные по изменению иммунологической активности по времени конъюгатов гемагглютинина вируса гриппа на биодеструктирующих носител х - производных гетероцепных полиаминов

Таблица 1 444040383534323025 303028282525242420 403737373535322525 3020. 10О

30Гемагглютинин100

30Смесь гемаглютинин-сополимер 50:50100

30Конъюгат гемагглютинин-сополимер 50:50100

Таблица 2

80

300

44

3500

Claims (1)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ ГЕМАГГЛЮТИНИНА ВИРУСА ГРИППА С СИНТЕТИЧЕСКИМИ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТАМИ путем ковалентного связывания гемагглютинина с ацилированными карбодиимидом полиэлектролитами, отличающийся тем, что, с целью пролонгирования иммуногенности целевого продукта, в качестве полиэлектролитов используют сополимеры акриловой кислоты и (М-винилпирролидона.

   i