SU1096280A1

SU1096280A1 - Method for detecting damages to microorganisms

Info

Publication number: SU1096280A1
Application number: SU823480628A
Authority: SU
Inventors: Виктор Михайлович Фомченков; Владимир Александрович Чугунов; Андрей Константинович Ажермачев; Пелагея Васильевна Бабаева
Original assignee: Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии
Priority date: 1982-08-05
Filing date: 1982-08-05
Publication date: 1984-06-07

Abstract

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ при внешних воздействи х по степени электроориентации клеток при помещении клеточной суспензии в переменное электрическое поле, отличающийс тем, что, с целью повышени точности анализа , определ ют степень электроориентации образцов интактных и полностью поврежденных микроорганизмов и исследуемого образца по изменению оптической плотности клеточной суспензии при частоте электрического пол соответственно METHOD FOR DETERMINING DAMAGE OF MICROORGANISMS under external influences according to the degree of electrical orientation of cells when placing a cell suspension into an alternating electric field, characterized in that, in order to improve the accuracy of the analysis, determine the degree of electrical orientation of samples of intact and fully damaged microorganisms and the sample under study to change the optical density of the cell suspension at the frequency of the electric field, respectively

Description

Изобретение относитс к микробиологии и может быть использовано в исследовательской работе и микробиологической промышленности дл определени действи на микроорганизмы .поврежданлдих факторов. Известен способ определени микр организмов, способных к размножению после воздействи на них повреждающих факторов путем их посева на пи тательный агар и подсчета выросших колоний l , Недостатками известного способа вл ютс больша длительность (от 1 до 14 сут), св занна с тем, что скорость роста микроорганизмов на агаре невелика и дл образовани заметной колонии требуетс значител ное врем . Кроме того, этот способ имеет недостаточную точность (погрешность измерений до 30% , что обу ловлено неустранимыми погрешност ми при разведении исходного препарата и распределении посевного материала на питательном агаре. Наиболее близким по, технической сущности к предложенному вл етс способ определени повреждени клеток хлореллы при воздействии на них повреждающих факторов по степени электроориентации при помещении суспензии клеток в переменное электри ческое поле, Согласно этому способу клетки помещают Б переменное электрическое поле и наблюдают с помощью микроско па за их поведением в поле. Повреждение микроорганизмов определ ют по степени электроориентации, т.е. по потере ими способности образовывать цепочки вдоль силовых линий пол и по смещению частотных границ, на ко торых наблюдаетс вращение клеток вблизи электродов 2. Наиболее существенными недостатками этого способа, вл ютс отсутствие количественной оценки процента поврежденных микроорганизмов в анализируемом образце и наличие субъективной ошибки вследствие визуального определени повренодени клеток. Цель изобретени - повышение точ ности анализа, т.е. определение поврежденных микроорганизмов в анализируемом образце. Указанна цель достигаетс спосо бом определени повреждени микроор ганизмов при внешних воздействи х по степени электроориентации клеток при помещении клеточной суспензии в переменное электрическое поле, при .чем определ ют степень элейтроориен тации образцов интактных и полность поврежденных микроорганизмов и исследуемого образца по изменению оптической плотности клеточной супензии при частоте электрического ол (SlO -S-lo) и (11о5-1 10) Гц, ычисл ют отношение степеней электрориентации дл каждого образца на тих частотах, а повреждение микрорганизмов в исследуемом образце ценивают по соотношению поврежденых и неповрежденных микроорганизмов огласно формуле Р- PI --;г-7Г оо7о, сб - процент неповрежденных клеток микроорганизмов в исследуемом образце} |J - отношение степени электроориентации клеток микроорганизмов в исследуемом образце в электрическом поле указанных частот; ро - то же, дл клеток интактных микроорганизмов PI - то же,дл клеток полностью поврежденных микроорганизмов , причем определение степени ориентации клеток ведут при рН 4,5-7,5, удельной электропроводности суспензии микроорганизмов (Ю -10 ) Омм и напр женности электрического пол (2-15). На фиг.1 дана частотна зависимость степени электроориентации клеток Pseudomonas aeruginosa, инкубированных при разных температурах в течение 15 мин: 1-25, 2-44, 3-61°С, 6-810 на фиг, 2 - то же, клеток Escherichia co2i, инкубированных при различных температурах в течение 15 мин: 1-37, 2-49, , 6 16 Oмм рН 4,5; на фиг.З - то же, рН 7,5; на фиг,4 - то же, при разной электропроводности суспензии, Otf 1-10, 2--3-10,- 4-10 5 1 ,7±0, рН 6,5-, на фиг. 5 --зависимость степени электроориентации от напр жени на эдектродах чейки дл бактериальных клеток BeclSius thuringiensis (1) И Pseudomonas aeruglnosa (2) при частоте электрического пол 10 Гц,, электропроводности суспензии 10 OMM% рН 5,5;на Лиг.6 схема устройства, реализуюпего предлагаемый способ на фиг.7 - частотна зависимость степени электроориентации клеток Escherichia co2i, инкубированных при различных температурах в течение 15 , 2-47, 3-53, 4-61 С, рН 6, и lOoMVr ;, на фиг.8 - то же,, клеток Escherichia coii интактных (l) и подвергнутых однократному (2) и четырехкратному (3) замораживанию-оттаиванию,рН 6,5, 6 210 ОмV; на Лиг. 9 - то же, клеток Escherichia coli ьтнтактных Ц) и обработанных 0,5%-ой (2) 1%-ой (зУ и 3%-ой .(4) эмульсией толуола (.врем обработки 20 мин) , рН 6,5,6 210 Ом мЧ на фиг. 10 то же, клеток Escherichia coli интактных (l) и обработанных 20%-м (2) и 30%-м (З) раствором этанола (врем обработки 20 мин), рН 6,5, 6 2-10 Ом м. Согласно представленным графикам достаточно достоверное определение степени электроориентации клеток возможно при указанных параметрах электрического пол , так как именно в этих услови х имеют место характе ные изменени кривых частотной зависимости степени электроориентации что и позвол ет использовать отноше ние эффектов, регистрируемых в поле мегагерцевой и килогерцевой частот дл количественной оценки числа поврежденных клеток (по расчетной фор муле) . При указанных напр женности электрического пол ,рН и удельной электропроводности суспензионной среды это отношение имеет максималь ную величину дл интактных клеток, что также повышает точность иэмереИзмерени провод т при напр жени на измерительной чейке, соответств ющем линейному участку ее амплитудной характеристики. Определение килогерцевого и мега герцевого диапазона частот. Килогерцевый диапазон частот включает частоты от 4-10 до 4-10 Г а мегагерцевый от 10 до 10 Гц. Указанные пределы определ ютс тем, что у клеток разных видов область минимума в килогерцевом диапазоне и максимума(в мегагерцевом диапазоне ) частотной зависимости степени электроориентации несколько отличаетс (фиг. 1 и 2), а также тем, что в области максимума и минимума допустима регистраци эффекта на частотах, где имеет место 10%-ое изменение эффекта по отношению к экстремальной величине. Диапазон рН исследуемой суспензи определен в пределах 4,5-7,5, так как в этом случае обеспечиваютс iнаилучшие услови регистрации повреждени клеток, особенно при низких рН (фиг.2 и 3), а также потому, что в этом диапазоне бактериальные клетки наименее подвержены слипанию ухудшающему наблюдение эффекта элек троориентации. Соответствунидими изм рени ми установлено, что в случае Escherichia coli наблюдают слипание клеток при ,0 и рН 7,5. Диапазон удельной электропроводности исследуемой суспензии определен в пределах от 10 до 10 Ом м , так как при этих значени х обеспечи ваетс наиболее надежна регистраци килогерцевого минимума и мега .герцевого максимума частотной зависимости степени электроориентации (фиг.4) . Увеличение электропровод ности свыше 10 нежелательно в св зи с РОСТОМ мешающих факторов (разогревание суспензии, теплова конвекци ), снижающих точность измерени степени электроориентации. Диапазон напр женности электрического пол определен в пределах от 2-10 (и 6 В) до 15-10 В/м{и 45 В , так как он соответствует максимальному изменению эффекта электроориентации в зависимости от напр жени на электродах чейки фиг.5), а именно эта область значений напр жений позвол ет наиболее точно вы вить и зарегистрировать Килогерцевый минимум и мегагерцевый максимум частотной завис.имости степени электроориентации клеток, что в конечном счете обеспечивает достаточно высокую точность при определении повреждени клеток согласно изобретению. Из фиг.5 видно, что область допустимых значений напр жени (заштрихованна ) дл более крупных кле (Ток (крива 1) лежит при меньших, а в случае более мелких клеток (крива 2) ПРИ больших значени х напр жени на электродах чейки, (и, следовательно, напр женности пол в суспензии). Пример. Исследуют тепловое повреждение грамотрицательных бактерий Esoherichia coli НВ-1100. Клетки инкубируют при температуре от 37 до 61°С в течение 15 мин. Измерени электроориентации по пред лагаемому способу можно проводить в средах с удельной электропроводностью от Ом ми ниже и при рН 4-12. Однако опыты показали, что повреждени клеток вы вл ютс лучше , если параметры суспензии выбирают следукадими: удельна электропроводность ниже, рН 7,5 и ниже. Поэтому параметры суспензии следующие: удельна электропроводность 2«10 Ом м, рН 6,0. Степень электроориентации микроорганизмов определ ют на известном устройстве дл контрол лиэкологического состо ни клеток 3j . На фиг.б изображена блок-схема устройства, которое состоит из источника 1 света, измерительной чейки 2 с.решетчатыми электродами 3 и 4 и окнами 5 из оптического стекла, фотоэлемента 6, самопишущего потенциометра 7, генератора 8 переменного напр жени и вольтметра 9. Устройство работает следующим образом . Световой поток от источника 1, пройд диэлектрофоретическую чейку 2, фотоэлементом 6 преобразуетс в электрический сигнал, регистрируемый самописцем 7. Неоднородное элек трическое поле создаетс в заполн ющей чейку клеточной суспензии с помощью решетчатых электродов 3 и 4 При включении генератора 8 клетки ориентируютс вдоль силовых линий пол и самописец регистрирует резко изменение проход щего через чейку светового потока. Величина этого изменени характеризует степень электроориентации клеток. Мен частоту генератора 8 при посто нном напр жении на электродах чейки 2, получают степень ориентации клеток на разных частотах. Как показывают опыты, величина (3 дл неповреж денных клеток значительно уменьшает с , если выбрать напр жение на чей ке соответствующим области насыщени эффекта электроориентации по амплитудной .характеристике чейки. При этом точность измерений значительно уменьшаетс . В св зи с вышеизложенным величину напр жени на электродах чейки выбирают равной 20 В, так как дл клеток кишечной палочки насыщение эффекта электроориентации наступает при напр жении свыше 35 В и напр жение 10-20 В соо ветствует линейному участку ампли:тудной характеристики. Определ ют степень электроориентации клеток в поле мегагерцевой 4105 Гц) и килогерцевой (Ю Гц) частот и отношение степени электроориентации на этих частотах дл сус пензии интактных (37°С), полностью поврежденных (61°С) клеток, а также клеток из суспензий, инкубировавших с при промежуточных температурах. По выражению (1) рассчитывают процент неповрежденных микроорганизмов в анализируемых образцах. Полученные данные приведены в табл. 1. Таблица ТемпураРезультаты определени тура, С повреждени микроорганиз мов, % Из табл. 1 видно, что с увеличением температуры инкубации величины Р и ui уменьшаютс , что св зано с увеличением числа поврежденных клеток . Пример 2 .Исследуют тепловое повреждение грамположительных бактерий BaciJJus thuringiensis ШТ.26. Клетки инкубируют при температуре от 26 до 55°С в течение 20 мин. Удельна электропроводность суспензии 2 10 Ом м рН 6,0. Напр жение на электродах чейки 15 В. Установка, на которой провод т измерени , и последовательность операций аналогичны примеру 1, Результаты приведены в табл.2. Таблица 2 Из табл.2 видно, что ив этом случае с увеличением температуры величины /3 и oi. уменьшаютс , что свидетельствует о повреждении клеток при нагревании. Пример 3. Исследуют тепловое повре щение грамотрицательных бактерий Pseudomonas acruginosa. Клетки инкубируют при температуре от 37 до 61°С в, течение 20 мин. Удвльна электропроводность суспензии 10 Ом Ml, рН 6,0. Напр жение на электродах чейки 15 В. Установка, на которой провод т измерени , и последовательность операций аналогичны примеру 1. Результаты представлены в табл.3. Таблица 3The invention relates to microbiology and can be used in research work and the microbiological industry to determine the effect on microorganisms. Injured factors. The known method of determining microorganisms capable of reproduction after exposure to damaging factors by planting them on nutrient agar and counting grown colonies is l. The disadvantages of this method are longer duration (from 1 to 14 days), due to the fact that the growth of microorganisms on agar is small and considerable time is required to form a noticeable colony. In addition, this method has insufficient accuracy (measurement error is up to 30%, which is caused by unavoidable errors when diluting the original preparation and distributing the seed material on the nutrient agar. The technical approach to the proposed method is the closest to determining the damage of chlorella cells when exposed on them are damaging factors according to the degree of electrical orientation when placing a suspension of cells in an alternating electric field. According to this method, cells are placed B by an alternating electric A microbial is monitored by the degree of electrical orientation, i.e., by their loss of ability to form chains along the field lines and by the shift of the frequency boundaries, on which cells rotate near the electrodes. 2. The most significant disadvantages of this method are the lack of a quantitative assessment of the percentage of damaged microorganisms in the sample being analyzed and the presence of a subjective error due to visual determination of the damaged microorganisms. Deni cells. The purpose of the invention is to improve the accuracy of the analysis, i.e. determination of damaged microorganisms in the analyzed sample. This goal is achieved by determining the damage of microorganisms by external influences according to the degree of electrical orientation of the cells when placing the cell suspension in an alternating electric field, what determines the degree of eleutroorientation of samples of intact and fully damaged microorganisms and the sample under study by changing the optical density of the cell suspension the frequency of the electrical ol (SlO –S-lo) and (11–5–110) Hz, the ratio of the degrees of electrical orientation for each sample at silent frequencies, and the damage e microorganisms in the test sample are valued by the ratio of damaged and intact microorganisms according to the formula Р-PI -; г-7Г оо7о, Sat - the percentage of intact microorganism cells in the test sample} | J - the ratio of the degree of electrical orientation of the microorganism cells in the test sample in the electric field of these frequencies; the same, for cells of intact microorganisms, PI is the same, for cells of completely damaged microorganisms, moreover, determination of the degree of cell orientation is carried out at a pH of 4.5–7.5, specific conductivity of the suspension of microorganisms (10–10) ohm and electric intensity gender (2-15). Figure 1 shows the frequency dependence of the degree of electrical orientation of Pseudomonas aeruginosa cells incubated at different temperatures for 15 minutes: 1-25, 2-44, 3-61 ° C, 6-810 in Fig, 2 is the same, Escherichia co2i cells , incubated at different temperatures for 15 minutes: 1-37, 2-49, 6,16 Om pH 4.5; on fig.Z - the same, pH 7.5; in FIG. 4, the same with different electrical conductivities of the suspension, Otf 1-10, 2--3-10, - 4-10 5 1, 7 ± 0, pH 6.5 -, in FIG. 5 shows the dependence of the degree of electrical orientation on the voltage on the electrodes of the cell for bacterial cells BeclSius thuringiensis (1) AND Pseudomonas aeruglnosa (2) at the frequency of the electric field of 10 Hz, the electrical conductivity of the suspension 10 OMM% pH 5.5; 7, the frequency dependence of the degree of electrical orientation of Escherichia co2i cells incubated at different temperatures for 15, 2-47, 3-53, 4-61 С, pH 6, and lOoMVr;, Fig.8 - the same ,, Escherichia coii cells intact (l) and subjected to a single (2) and fourfold (3) freeze-ot Ivanov, pH 6.5, 6210 OMV; on league. 9 - the same, cells of Escherichia coli intact C) and treated with 0.5% (2) 1% (memory and 3%. (4) toluene emulsion (.treatment time 20 min), pH 6, 5.6 210 Ohm mCh in Fig. 10, the same, Escherichia coli cells intact (l) and treated with 20% (2) and 30% (W) ethanol solution (treatment time 20 min), pH 6.5 , 6–2–10 Ω m. According to the graphs presented, a fairly reliable determination of the degree of electrical orientation of cells is possible with the indicated parameters of the electric field, since it is under these conditions that characteristic changes in the curves of the frequency dependence of the degree of electrical orientation occur. and this allows us to use the ratio of effects recorded in the field of megahertz and kilohertz frequencies to quantify the number of damaged cells (by the calculated formula). At the indicated electric field strength, pH and conductivity of the suspension medium, this ratio has a maximum value for intact cells, which also increases the accuracy of the measure. Measurements are carried out at a voltage across the measuring cell corresponding to the linear portion of its amplitude response. Definition of kilohertz and mega hertz frequency range. The kilohertz frequency range includes frequencies from 4-10 to 4-10 G and megahertz from 10 to 10 Hz. These limits are determined by the fact that, in cells of different species, the minimum range in the kilohertz range and maximum (in the megahertz range) of the frequency dependence of the degree of electrical orientation is somewhat different (Fig. 1 and 2), and also in the region of the maximum and minimum, the effect registration is acceptable. at frequencies where there is a 10% change in effect relative to the extreme value. The pH range of the test suspension is determined in the range of 4.5-7.5, since in this case the best conditions for the registration of cell damage are provided, especially at low pH (Figures 2 and 3), and also because in this range bacterial cells are the least susceptible to sticking to the deteriorating observation of the effect of electro-orientation According to uniform measurements, it was found that in the case of Escherichia coli, cell sticking was observed at, 0 and pH 7.5. The range of electrical conductivity of the tested suspension is determined in the range from 10 to 10 Ω m, since at these values the most reliable registration of the kilohertz minimum and mega-hertz maximum of the frequency dependence of the degree of electrical orientation is provided (Fig. 4). An increase in electrical conductivity over 10 is undesirable in connection with the GROWTH of interfering factors (heating of the suspension, thermal convection), which reduce the accuracy of measuring the degree of electrical orientation. The voltage range of the electric field is defined in the range from 2-10 (and 6 V) to 15-10 V / m {and 45 V, since it corresponds to the maximum change in the effect of electrical orientation depending on the voltage on the electrodes of the cell of Fig. 5), Namely, this range of voltage values allows the Kilohertz minimum and megahertz maximum of the frequency dependence of the degree of electrical orientation of cells to be detected and recorded most accurately, which ultimately provides a sufficiently high accuracy in determining cell damage according to the invention. NIJ. From Fig. 5, it can be seen that the range of allowable voltage values (hatched) for larger adhesives (Current (curve 1) lies at smaller, and in the case of smaller cells (curve 2), with higher voltage values on the cell electrodes, ( and, consequently, the intensity of the sex in the suspension. Example: Examine the thermal damage of Gram-negative bacteria Esoherichia coli HB-1100. Cells are incubated at a temperature of 37 to 61 ° C for 15 minutes. Measurements of the electrical orientation by the proposed method can be performed in media with electrical conductivity from ohm mi n however, at pH 4-12. However, experiments have shown that cell damage is better if the suspension parameters are chosen by the following: specific conductivity is lower, pH 7.5 and lower. Therefore, the suspension parameters are as follows: specific conductivity 2 "10 ohm m, pH 6.0 The degree of electro-orientation of the microorganisms is determined on a known device for monitoring the ecological state of cells 3j. Fig. 1b shows a block diagram of a device that consists of a light source 1, a measuring cell 2 sec. lattice electrodes 3 and 4 and windows 5 of optical of a flat glass, a photocell 6, a self-recording potentiometer 7, an alternating voltage generator 8 and a voltmeter 9. The device operates as follows. The luminous flux from source 1, passed through the dielectrophoretic cell 2, is converted by photocell 6 into an electrical signal recorded by the recorder 7. A non-uniform electric field is created in the cell suspension filling the cell using grid electrodes 3 and 4 When the generator 8 is turned on, the cells are oriented along field lines and the recorder records a sharp change in the light flux passing through the cell. The magnitude of this change characterizes the degree of electrical orientation of the cells. The oscillator frequency 8 at a constant voltage across the electrodes of cell 2 is variable; the degree of cell orientation at different frequencies is obtained. Experiments show that the value of (3 for undamaged cells significantly decreases c, if one chooses the voltage on which corresponds to the saturation region of the effect of electrical orientation on the amplitude characteristic of the cell. At the same time, the measurement accuracy is significantly reduced. Due to the above voltage on the electrodes The cells are chosen equal to 20 V, since for cells of Escherichia coli the saturation of the effect of electrical orientation occurs at voltages above 35 V and a voltage of 10-20 V corresponds to the linear portion of the ampli The degree of electrical orientation of cells in the field of megahertz (4105 Hz) and kilohertz (Yu Hz) frequencies and the ratio of the degree of electrical orientation at these frequencies are determined for suspension of intact (37 ° С), completely damaged (61 ° С) cells, and also cells from suspensions, incubated with at intermediate temperatures. By the expression (1) calculate the percentage of intact microorganisms in the analyzed samples. The data obtained are given in table. 1. Table Tempura Results of the round, C damage of microorganisms,% From tab. 1 that with increasing incubation temperature, the values of P and ui decrease, which is associated with an increase in the number of damaged cells. Example 2. Thermal damage of gram-positive bacteria BaciJJus thuringiensis ShT.26 is investigated. Cells are incubated at a temperature of from 26 to 55 ° C for 20 minutes. The electrical conductivity of the suspension is 2 10 Ohm m pH 6.0. The voltage on the electrodes of the cell is 15 V. The installation on which the measurements are made, and the sequence of operations are similar to Example 1, the results are shown in Table 2 Table 2 From table 2 it can be seen that in this case with an increase in temperature the values of / 3 and oi. reduced, indicating cell damage when heated. Example 3. Thermal damage of the gram-negative bacteria Pseudomonas acruginosa is investigated. Cells are incubated at a temperature of from 37 to 61 ° C for 20 minutes. The electrical conductivity of the suspension is 10 ohms Ml, pH 6.0. The voltage on the electrodes of the cell is 15 V. The installation on which the measurements are made, and the sequence of operations are similar to Example 1. The results are presented in Table 3. Table 3

И в этом примере повреждение кле ток ПРИ нагревании приводит к умень шению и (А .In this example, damage to cells when heated leads to a decrease in and (A.

Использование предложенного способа определени повреждени микроорганизмов обеспечивает в сравнении с известным количественную оценку числа жизнеспособных клеток, а значит, увеличение точности .The use of the proposed method for the determination of microorganism damage in comparison with the known method provides a quantitative estimate of the number of viable cells, and thus an increase in accuracy.

Следует также отметить, что приIt should also be noted that when

анализе бактериальных клеток небольшого размера (менее 10 м) применение известного способа невозможно в св зи с тем, что размер таких клеток наход тс на пределе разрешени светового микроскопа и визуальный анализ их поведени в поле невозможен. Предложенный способ при-) меним дл анализа и таких мелких клеток.analysis of bacterial cells of small size (less than 10 m) the application of this method is impossible due to the fact that the size of such cells is at the limit of resolution of the light microscope and visual analysis of their behavior in the field is impossible. The proposed method is used to analyze such small cells.

, оСooc

SO SO

« "

Фиг. чFIG. h

7 tfff г 3 ff 5 7 Фиг. 8 tgf7 tfff g 3 ff 5 7 FIG. 8 tgf

Claims

METHOD FOR DETERMINING DAMAGE TO MICROORGANISMS under external influences by the degree of electroorientation of cells when placing a cell suspension in an alternating electric field, characterized in that, in order to increase the accuracy of the analysis, the degree of electroorientation of samples of intact and completely damaged microorganisms and the test sample is determined by changing the optical density of cell suspension at the frequency of the electric field, respectively (510 ^ -5 · 10 ⁴ ) and (1 · 10 ⁵ -1 Ί0 ⁷ ) Hz, the ratio of the degrees of electrical orientation for each sample at these frequencies, and damage to microorganisms in the test sample is evaluated by the ratio of damaged and undamaged microorganisms according to the formula where is the percentage of intact cells, the current of microorganisms in the test sample;

ratio of S orientation degree electro- microorganism cells _and nisms in the test The samples ί /} tse in an electric field of said frequencies', the same as for the intact microorganism cells;

same for cells completely damaged by microorganisms. MOV, and the degree of orientation of the cells is determined at pH 4.5-7.5, the electrical conductivity of the suspension of microorganisms (10 ' ⁴ -10' ^g ) ohm ' ^, m *''and the electric field strength' (2-15) · 10 ³ V / m.