;о Изобретение относитс к медицине в частности к ферментному анализу крови человека, и может быть исполь зовано в медицинской практике при изучении биохимических показателей крови в клинике и эксперименте. Известен способ флюорометрического определени активности моноаминоксидазы (МАО) в тромбоцитах путем инкубировани исследуемого фермента с субстратом. Определение проводитс в 0,2 MJ крови после инкубации реакционной смеси в течение 1 ч при fij. К недостаткам известного способа относ тс малый диапазон линейности низка специфичность. Кроме того, использование в качестве реагенФа 1,2-диаминонафталнна вещества с сильными канцерогенными веществами, придает способу большую травматичность . Известен также способ спектрофото метрического определени активности фермента, включающий экстракцию бекзальдегида циклогексаном с последующей детекцией при242 им 2. Недостатком известного способа вл етс относительно низка точность . Цель изобретени - повышение точности способа. Поставленна цель достигаетс тем, что согласно способу определени активности -моноаминоксидазы в тромбоцитах, включающему инкубацию их в присутствии бензиламина с последующим спектрофотометрическим опре делением концентрации образовавшегос бензальдегида, бензальдегид экстрагируют н-гептаном в соотношении (1:2,1) - (1:2,6) , экстракт хроматог рафируют при скорости протока элюента 1,9-2,1 мл/мин, а в качестве элюента используют смесь этанола с ВОДОЙ в соотношении (58:42)-(62:38 Способ осуществл ют следующим образом . Тромбоциты вьщел ют из 10 мл крови , вз той из локтевой вены в пласти ковые стаканчики, куда предварительно добавл ют 0,3 мл 0,27 М ЭДТА-буфера рН 7,4.. -Эритроциты и лейкоциты осаждают центрифугированием крови в течение 5 мин при 300 g. Надосадок повторно центрифугируют 20 мин при 2000 g. Осадок суспендируют и гомогенизируют в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,65. Гомогенат центрифугируют при 20000 g 20 мин. Осадок суспендируют и гомогенизируют в 0,2 М фосфатном буфере рН 8,4. В реакционную среду отбирают 0,1 мл суспензии. Количество белка определ ют по методу Лоури и добавл ют.0,4 мл 0,2 М K-Na фосфатного буфера рН 8,4. Затем к-реакционной смеси добавл ют 0,1 мл (12 ммоль) раствора бензиламина и пробы инкубируют при 37 С в течение 10 мин при посто нном встр хивании . Реакци останавливаетс 0,1 мл 20% ТХУ. Вслед за этим в реакционную смесь добавл ют гептан в отношении 1:2,1-1:2,6. Пробирки интенсивно встр хивают в течение 3 мин и центрифугируют при 1500 g 15 мин. Органическую фазу перенос т в пузырьки автоматического пробоотборника, откуда она поступает в петлю хроматографа (жидкостный хроматограф высокого давлени AnaIyst-7800, фирмы LDC). Объем вводимого в колонку с обращенной фазой (,6 мм Sperisorb ODS-10) раствора равен 20 мкл. В качестве подвижной фазы используют смесь этанола с водой в соотношении 58:42-62:38. Скорость протока элюента 1,9-2,1 мл/мин. Пример 1. Испытуемый М. . Вз тие пробы крови, выделение тромбог цитов, инкубаци их с бензиламином производитс описанным способом. Образовавшийс бензальдегид экстрагируют Н -гептаном (1:2,1), затем хроматографируют при скорости протока 1,9 мл/мин. В качестве подвижной фазы используют смесь этанол-вода (58:42). При этом удельна активность фермента составила 73,33 ммоль/ч/мг белка. Пример 2 . Испытуемый В. Вз тие пробы крови, вьщеление тромбоцитов , инкубаци их с бензиламином проводитс описанным способом. Образовавшийс бензальдегид экстрагируют Н -гептаном (1:2,6), затем хроматографируют при скорости протока 2,1 мл/мин. В качестве подвижной фазы используют смесь этанолвода (62:38), при этом удельна активность фермента составила 65,28 ммоль/ч/мг белка.o The invention relates to medicine in particular to the enzyme analysis of human blood, and can be used in medical practice in the study of blood biochemical parameters in the clinic and in experiment. A known method for the fluorometric determination of monoamine oxidase (MAO) activity in platelets is carried out by incubating the enzyme in question with a substrate. The determination is carried out in 0.2 MJ of blood after incubating the reaction mixture for 1 hour at fij. The disadvantages of this method are the low linearity range and low specificity. In addition, the use of 1,2-diaminonaphthalene substances with strong carcinogenic substances as reagents, gives the method greater trauma. A method of spectrophotometric measurement of enzyme activity is also known, including the extraction of bexaldehyde with cyclohexane followed by detection with 242 to them 2. A disadvantage of the known method is the relatively low accuracy. The purpose of the invention is to improve the accuracy of the method. The goal is achieved by the method of determining the activity of α-monoamine oxidase in platelets, including incubating them in the presence of benzylamine followed by spectrophotometric determination of the concentration of benzaldehyde formed, the benzaldehyde is extracted with n-heptane in a ratio of (1: 2.1) - (1: 2, 6), the chromatog extract is refined at the flow rate of eluent 1.9-2.1 ml / min, and a mixture of ethanol and WATER is used as eluent in the ratio (58:42) - (62:38 The method is carried out as follows. are from 10 ml kr Ova taken from the cubital vein into plastic cups, to which 0.3 ml of 0.27 M EDTA buffer, pH 7.4, are previously added. Red blood cells and white blood cells are precipitated by centrifuging the blood for 5 minutes at 300 g. centrifuged for 20 minutes at 2000 g. The precipitate is suspended and homogenized in 0.01 M phosphate buffer pH 7.65, the homogenate is centrifuged at 20,000 g for 20 minutes the precipitate is suspended and homogenized in 0.2 M phosphate buffer pH 8.4. 0.1 ml of the suspension is taken into the reaction medium. The amount of protein is determined by the method of Lowry and .0.4 ml of 0.2 M K-Na phosphate buffer pH 8.4 is added. Then, 0.1 ml (12 mmol) of the benzylamine solution is added to the k-reaction mixture, and the samples are incubated at 37 ° C for 10 minutes with constant shaking. The reaction is stopped with 0.1 ml of 20% TCA. Following this, heptane is added to the reaction mixture in a ratio of 1: 2.1-1-1: 2.6. The tubes are shaken vigorously for 3 minutes and centrifuged at 1500 g for 15 minutes. The organic phase is transferred to the autosampler vials, from where it enters the chromatograph loop (AnaIyst-7800 high pressure liquid chromatograph, manufactured by LDC). The volume of solution injected into the column with reversed phase (, 6 mm Sperisorb ODS-10) is 20 µl. As the mobile phase using a mixture of ethanol with water in the ratio of 58: 42-62: 38. The flow rate of eluent is 1.9-2.1 ml / min. Example 1. Test M.. The collection of blood samples, the isolation of thrombogocytes, and their incubation with benzylamine is carried out in the manner described. The resulting benzaldehyde is extracted with H-heptane (1: 2.1), then chromatographed at a flow rate of 1.9 ml / min. An ethanol-water mixture (58:42) is used as the mobile phase. The specific enzyme activity was 73.33 mmol / h / mg protein. Example 2 Subject B. Sampling of blood, selection of platelets, incubation with benzylamine is carried out as described. The resulting benzaldehyde is extracted with H-heptane (1: 2.6), then chromatographed at a flow rate of 2.1 ml / min. A mixture of ethanol water (62:38) was used as the mobile phase, while the specific activity of the enzyme was 65.28 mmol / h / mg protein.
3109107131091071
Использование предлагаемого спосо- анализа до 94%. Кроме того, способ ба определени активности МАО в тром- прост в использовании, не тр ебует боцитах позволит повысить точность малодоступных химических реактивов.Using the proposed method of analysis up to 94%. In addition, the method of ba for determining the activity of MAO in thromscine is easy to use; it does not require bocytes, which will increase the accuracy of inaccessible chemicals.