соwith
D (л Изобретение относитс к медицине а именно к гистохимическим исследовани м в области офтальмологии. Известен способ окраски гиалуроновой кислоты, включающий фиксацию, окрашивание альциановым синим и исследование в электронном микроскопе .1. Однако данный способ не дает спе цифичной окраски гиалуроновой кисло ты, а вы вл ет весь комплекс мукополисахаридов . Наиболее близким к предлагаемому вл етс способ окраскиjгиалуроново кислоты, включающий фиксацию, окрашивание рутениевым красным и исслед вание в электронном,микроскопе 2. Однако известный способ не дает возможности четко дифференцировать гиалуроновую кислоту в ткан х глаза так как рутениевый красный, вступа в комплекс с гиалуроновой кислотой, дает грубый осадок, что мешает вы в лению точного расположени и количества гиалуроновой кислоты. Цель изобретени - повьшение диф ференцировки гиалуроновой кислоты от других мукополисахаридов. Указанна цель достигаетс тем, что согласно способу окраски гиалз)роновой кислоты в ткан х глаза окра шивание провод т до фиксации в 2550%-ном водном растворе полиэтиленимина 18-24 ч при 10-15°С. Полиэтиленимин вл етс синтетическим продуктом полимеризации этиленимина . В химической промьшшеннос ти полизтиленимин используетс при .производстве бумаги дл ускорени обезвоживани бумажной массы, а так же- в качестве флокул та при очистке промьшшенных и бытовых сточных вод. Вы влено, что полиэтиленимин, соедин сь с гиалуроновой кислотой, восстанавливает осмиевую кислоту с образованием электронно-плотного осадка. Способ осуществл ют следующим образом . Ткань глаза помещают в растворы полиэтиленимина (25-50%) на 18-24 ч при 10-15®С. Далее ткань перейос т в 1%-ный раствор осмиевой кислоты на фосфатном буфере с рН 7,3 на 30 мин. Затем перенос т во вторую смену того же раствора осмиевой кислоты на 60 мин. После чего ткань обезвоживают в спиртах Возрастающей концентрации и заключают в эпоксидные смолы. Ультратонкие срезы перед просмотром под электронным микроскопом дополнительно контрастируют растворами цитрата свинца. Применение полиэтиленимина в концентраци х менее 25% при времени .обработки меньше 18 ч и температуре ниже значительно снижает контрастность продукта реакции, а применение полизтиленимина в концентраци х больше 50% при времени обработки больше 24 ч и температуре вьш1е 15°С приводит к сильному высушиванию ткани и по влению больших артефактов. Применение полиэтиленимина в концентраци х 25-50% при времени обработки 18-24 ч и 10-15С приводит к образованию четкого электронно-плотного осадка в о.бласти нахождени гиалуроновой кислоты и регистрируетс на электроннограммах. Контролем дл вы влени гиалуроновой кислоты слзЫит предварительна обработки исследуемой ткани ферментом гиалуронидазой, дл чего ткань помещают в раствор гиалуронидазы на 18 ч при . Обработанна гиалуронидазой ткань глаза при последующей окраске полиэтиленимином недает выпадени осадка в области наличи гиалуроновой кислоты, что подтверждает специфичность взаимосв зи полиэтиленимина с гиалуроновой кислотой. Пример 1. Фрагмент роговицы помещают в 25%-ный раствор полиэтиленимина на 24 ч при- . Далее роговицу перенос т в 1%-ный раствор осмиевой кислоты на фосфатном буфере с рН 7,3 на 30 мин. Затем роговицу помещают во вторую порцию того же раствора на 60 мин, после чего обёзвожир ют в спиртах возрастающей концентрации и заключают в эпоксидные смолы. Прим ер .2. Фрагмент роговицы помещают в 35%-ный раствор полиэтиенимина на 24 ч при iO°C, далее обработка материала проводитс анаогично примеру 1. П р и м е р 3. Фрагмент стеклоидного тела помещают в 50%-ньй растор полиэтиленимина на 24 ч при . алее обработка проводитс аналогичо примеру 1.D (l) The invention relates to medicine, namely to histochemical studies in the field of ophthalmology. A method of dyeing hyaluronic acid is known, including fixation, staining with Alcian blue and electron microscopy. 1. However, this method does not give a specific hyaluronic acid staining, and The whole complex of mucopolysaccharides is revealed. The closest to the proposed method is the method of coloring hyaluronic acid, including fixation, staining with ruthenium red and electron microscopy 2. This known method makes it impossible to clearly differentiate hyaluronic acid in the tissues of the eye, since ruthenium red, entering into a complex with hyaluronic acid, gives a coarse precipitate, which prevents the exact location and amount of hyaluronic acid from being detected. from other mucopolysaccharides. This goal is achieved by the fact that according to the method of dyeing hyalz-ronic acid in eye tissues, staining is carried out before fixation in 2550% aqueous solution of polyethylenium and 18-24 hours at 10-15 ° C. Polyethyleneimine is a synthetic product for the polymerization of ethyleneimine. In the chemical industry, polystylenimine is used in the production of paper to accelerate the dewatering of the pulp and also as flocculant in the treatment of industrial and domestic wastewater. Polyethyleneimine, combined with hyaluronic acid, has been found to reduce osmic acid to form an electron-dense precipitate. The method is carried out as follows. Eye tissue is placed in solutions of polyethylenimine (25-50%) for 18-24 h at 10-15 ° С. The tissue is then transferred to a 1% osmic acid solution in phosphate buffer pH 7.3 for 30 minutes. Then transferred to the second shift of the same osmic acid solution for 60 minutes. After that, the fabric is dehydrated in alcohols of increasing concentration and enclosed in epoxy resins. Ultra-thin sections before viewing under an electron microscope are additionally contrasted with lead citrate solutions. The use of polyethyleneimine in concentrations of less than 25% at a treatment time of less than 18 hours and a temperature below significantly reduces the contrast of the reaction product, and the use of polystilenimine in concentrations greater than 50% at a treatment time of more than 24 hours and a temperature of 15 ° C leads to a strong drying of the fabric. and the appearance of large artifacts. The use of polyethylenimine in concentrations of 25–50% with a treatment time of 18–24 h and 10–15 ° C leads to the formation of a clear electron-dense precipitate in the region of hyaluronic acid and is recorded on electron diffraction patterns. A control for detecting hyaluronic acid would be to pretreat the treated tissue with the enzyme hyaluronidase, for which the tissue was placed in a solution of hyaluronidase for 18 h at. The hyaluronidase-treated tissue of the eye during subsequent staining with polyethylene imine does not precipitate precipitation in the region of the presence of hyaluronic acid, which confirms the specificity of the interrelation of polyethylenimine with hyaluronic acid. Example 1. A fragment of the cornea is placed in a 25% solution of polyethyleneimine for 24 hours at. Next, the cornea is transferred to a 1% solution of osmic acid in phosphate buffer with a pH of 7.3 for 30 minutes. Then the cornea is placed in the second portion of the same solution for 60 minutes, after which it is baked in alcohols of increasing concentration and enclosed in epoxy resins. Note er .2. A fragment of the cornea is placed in a 35% solution of polyethylenimine for 24 hours at iO ° C, then the material is processed in the same manner as Example 1. EXAMPLE 3 A fragment of the vitreous body is placed in a 50% solution of polyethyleneimine for 24 hours. Further processing is carried out similarly to Example 1.
310910564310910564
Предлагаемый способ найдет приме- ческого состо ни глаза, обуслрвленнонение в офтальмологических клиниках го наруйением обмена сахароз в ткаи лаборатори х при оценке патологи- н х глазного блока.The proposed method will find the ocular state of the eye, which is observed in ophthalmologic clinics by disrupting the exchange of sucrose in tissue laboratories when assessing the pathological ocular block.