SU1062218A1

SU1062218A1 - Process for preparing ampholite carrier for isoelectrical focusing and isotachophoresis

Info

Publication number: SU1062218A1
Application number: SU823437857A
Authority: SU
Inventors: Гервидас Йонович Денис; Гинтарас Адольфович Гавенас; Казимера Казимеровна Янулайтене; Антанас-Скайстутис Антанович Глемжа; Игнас Иполитович Кюдулас; Викторас Йонович Лауцюс
Original assignee: Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии
Priority date: 1982-05-06
Filing date: 1982-05-06
Publication date: 1983-12-23

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМФОЛИТАНОСИТЕЛЯ ДЛЯ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ФОКУСИРОВАНИЯ И ИЗОТАХОФОРЕЗА путем модифицировани полиэтиленполиамина непредельным соединением ивзаимодействи модифицированного полиэтиленполиамина с акриловой кислотой , отличающийс тем, что, с целью увеличени эксплуатационных свойств амфолита-носител , в качестве непредельного соединени используют соединени , содержа .щие активированную электроноакцепторными группами этиленовую св зь общей формулы RJ-OH O: X ) где X - rCN ; , -COR-; -CONRR ; ; -PO(OR) ; 2-3- или 4-пиридил; R и R- атом водорода, алкил или ари л; (Л атом водорода, -СН или X, и модифицирование осуществл ют в водной среде при 20-70с в течение 1-20 ч при мол рном соотношении модификатора и полиэтиленполиамина METHOD OF AIR General formula RJ-OH O: X) where X is rCN; -COR-; -CONRR; ; -PO (OR); 2-3 or 4-pyridyl; R and R is a hydrogen atom, alkyl or ari l; (L is a hydrogen atom, -CH or X, and the modification is carried out in an aqueous medium at 20-70 s for 1-20 h at a molar ratio of modifier and polyethylene polyamine

Description

Изобретение относитс к биохимии , а именно: к способам разделени белковых веществ. Известны способы синтеза амфолитов-носителей дл изоэлектрического фокусировани , в частности сп соб получени амфолитов-носителей путем взаимодействи акриловой кис лоты с полиэтиленполиаминами (ПЭПА например с триэтилентетрамином, тетраэтиленпентамином и пентаэтиленгексамином или их смес ми ij . Однако такие амфолиты-носители обладают недостаточной раздел ющей способностьЕо, малой буферной емкостью и малой проводимостью в ней тральной области рН. Наиболее близким к предлагаемому вл етс способ получени амфолита-носител из акриловой кислоты ,и полиэтиленполиаминов, модифицированнь х N,N -метилен-бх/С-акриламидом 2j . ,. Однако N,N -метилен-6iic-акриламид св зывает амины и noBHUjaeT но лекул рную массу амфолита-носител что усложн ет его отделение от ана лизируемых белков. Амфолиты-носители , полученные известным способо обладают недостаточной буферной ем костью в нейтральной области рН, ь образуют недостаточно линейный гра диент рН. Цель изобретени - улучшение эксплуатационных свойств амфолитаносител . Дл достижени цели согласно способу получени амфолита-носител дл изоэлектрического фокусиров ни и изотахофореза путем модифицировани полиэтиленполиамина непредельным соединёние.м и взаимодей остви модифицированного полиэтилен полиамина с акриловой кислотой, в качестве непредельного соединени используют соединени , содержащие активированную электроноакцепторными группами этиленовую св зь общ формулы Rj-OH e где X - CN; -COOR; -сок,- -CONRR , -POCOR) 2-3- или 4 пиридил R и R - атом водорода, алкил или арил; .. R(И атом водорода, -СН-з или Х,: и модифицирование осуществл ют в водной среде при 20-70 С в течение 1-20 ч при мол рном соотношении модификатора и полиэтиленполиамина ( 1-3):1. В ходе модификаций происходит присоединение .первичных и вторичны аминогрупп полиэтиленполиаминов к активированной этиленовой св зи с образованием смеси веществ формулы UH -OH -N-feT , где Y Н или -CR,, п 1-6, Модификацию ПЭПА предпочтительно проводить перед их взаимодействием с акриловой кислотой, так как при этом обеспечиваетс быстра и полна реакци модификаторов, но возможна модификаци в ходе действи и после действи акриловой к-ислоты , Раздел юща способность изоэлектрического фокусировани определ етс как разность наиболее близких изоэлектрических точек белков, еще раздел е мых фокусированием. Согласно .теории изоэлектрического фокусиров ,ани ,два амфотерных электролита (амфолита) с различными изо|электрическими точками не могут |быть разделены путем изоэлектрического фокусировани на отдельные зоны. Дл этого необходим третий амфолит, имеющий изоэлектрическую точку в интервале между изоэлектрическими точками раздел емых веществ . Например, дл разделени белков с близкими значени ми изоэлектрических точек в амфолитеносйтеле должны быть вещества с промежуточными значени ми изоэлектрических точек. Поэтому дл достижени высокой раздел ющей способности изоэлектрического фокусировани необходимо, чтобы в составе амфолитаносител было возможно большее количество компонентов, распределенных во всем рабочем интервале рН. Это обеспечивает и пр молинейность градиента рН, Изоэлектрическа точка амфотерног .о вещества определ етс константами диссоциации его кислой и основной групп. Изменение констант диссоциации обуславливает изменение изоэлектрических точек амфотерных электролитов. Сближение констант диссоциации кислотной и основной группы увеличивает буферную емкость и проводимость амфотерного электролита . Это создает возможность снижени концентрации амфолита-носи-тел , уменьшает выдел емое во врем анализа тепло, стабилизирует градиенты рН Предлагаемый способ получени амфолитов-носителей улучшает их свойства, так как увеличиваетс число индивидуальных амфотерных соединений в составе амфолита-носител . Например, при взаимодействии ,1 моль триэтилентетрамина с 1 мольThe invention relates to biochemistry, namely to methods for the separation of proteinaceous substances. Methods are known for synthesizing carrier ampholytes for isoelectric focusing, in particular, for preparing the carrier ampholytes by reacting acrylic acid with polyethylene polyamines (PEPA, for example, with triethylene tetramine, tetraethylene pentamine and pentaethylene hexamine or their mixtures ij. , low buffer capacity and low conductivity in the neutral pH region. The closest to the one proposed is the method of obtaining an ampholyte carrier from acrylic acid, and polyethylene polyamines modified with N, N-methylene-bx / C-acrylamide 2j. However, N, N-methylene-6iic-acrylamide binds amines and noBHUjaeT non-therapeutic mass of ampholyte carrier, which complicates separation from analytes of proteins. Ampholytes-carriers obtained by a known method have an insufficient buffer capacity in the neutral pH region and do not form an insufficiently linear pH gradient. The purpose of the invention is to improve the performance properties of the ampholytic carrier. To achieve the goal, according to the method of obtaining an ampholyte carrier for isoelectric focusing and isotachophoresis by modifying polyethylene polyamine with an unsaturated compound. OH e where X is CN; -COOR; - juice, - -CONRR, -POCOR) 2-3 - or 4 pyridyl R and R - a hydrogen atom, alkyl or aryl; .. R (And hydrogen atom, -CH-z or X,: and the modification is carried out in an aqueous medium at 20-70 ° C for 1-20 h with a molar ratio of modifier and polyethylene polyamine (1-3): 1. B During the modification, the primary and secondary amino groups of polyethylene polyamines are attached to the activated ethylene bond to form a mixture of substances of the formula UH –OH –N – feT, where Y H or –CR ,, n 1-6. Modification of PEPA is preferably carried out before their interaction with acrylic acid, because it provides a quick and complete reaction modifiers, but it is possible and the modification during the action and after the acrylic acid action, the separation capacity of the isoelectric focusing is defined as the difference between the closest isoelectric points of the proteins, which are also separated by focusing. According to the theory of isoelectric focusing, an, two amphoteric electrolytes (ampholyte) with different iso | electric points cannot | be separated by isoelectric focusing into separate zones. For this, a third ampholyte is necessary, having an isoelectric point in the interval between the isoelectric points of the substances to be separated. For example, to separate proteins with similar values of isoelectric points in an ampholithocheater, there should be substances with intermediate values of isoelectric points. Therefore, in order to achieve a high separation capacity of isoelectric focusing, it is necessary that the ampholythanide medium contains as many components as possible, distributed over the entire working pH range. This ensures that the pH gradient is straightforward. The isoelectric point of an amphoteric substance is determined by the dissociation constants of its acidic and basic groups. A change in dissociation constants causes a change in the isoelectric points of amphoteric electrolytes. The convergence of the dissociation constants of the acid and the main group increases the buffer capacity and conductivity of the amphoteric electrolyte. This creates the possibility of reducing the concentration of ampholyte-carriers, reduces the heat released during the analysis, stabilizes pH gradients. The proposed method of obtaining ampholytes-carriers improves their properties, as the number of individual amphoteric compounds in the ampholyte carrier increases. For example, in the interaction, 1 mole of triethylentetramine with 1 mole

акриловой кислоты образуетс две амфотерные аминокислоты, содержащие в молекуле по одному J-карбоксиэтильному остатку и. меньше п ти аминокислот, содержании; по два таких остатка. Таким образом, в амфолите-носителе содержатс в заметных количествах 7 амфотерных соединений. Если же на 1 моль тркэтилентетрамина подействовать 1 моль модификатора (например, акрилонитрила ) и 1 моль акриловой кислоты , число образующихс амфотерных производных возрастает до 56, т.е. увеличиваетс восьмикратно . Если использовать не один модификатор, а несколько, число производных еще многократно увеличитс . Таким, образом, предлагаема модификаци дает возможность увеличить на пор док и более число амфотерных компонентов амфолита-носител . Это улучшает линейность градиента рН и раздел ющую способность при изоэлектрическом фокусировании.acrylic acid forms two amphoteric amino acids containing one J-carboxyethyl residue and one in the molecule. less than five amino acids, content; two such residue. Thus, 7 amphoteric compounds are contained in noticeable amounts in an ampholyte carrier. If 1 mole of modifier (e.g., acrylonitrile) and 1 mole of acrylic acid act on 1 mole of tricethylenetetramine, the number of amphoteric derivatives increases to 56, i.e. increases eightfold. If not one modifier is used, but several, the number of derivatives will increase many times over. Thus, the proposed modification makes it possible to increase by an order of magnitude or more the number of amphoteric components of the ampholyte carrier. This improves the linearity of the pH gradient and the separation ability with isoelectric focusing.

Кроме того, при модификации смещаютс константы диссоциации аминогрупп. Известно, что присоединение к аминам веществ, содержащих активированную этиленовую св зь, измен ет константу диссоциации данного амина. Так, присоединение винилметидсулъфона уменьшает кон станту диссоциации (pKq) на 2,823 ,13 ед-. , присоединение акрилонитрила - на 2,21-2,50, 2-метилакрилонитрила - на 2,37-2,65, р, р-дихлорэтилового эфира винилфосфиновой кислоты - на 1,70, винилметилкетона - на 0,40. Предлагаема , модификаци понижает значени pKq аминогрупп и сближает их с константами диссоциации кислотных групп. Поэтому предлагаемый амфо .лит носитель приобретает большую бу ферную емкость и проводимость, по сравнению с известными.In addition, when modified, the dissociation constants of the amino groups are shifted. It is known that the addition of compounds containing an activated ethylene bond to amines changes the dissociation constant of a given amine. Thus, the addition of vinyl methydsulfone reduces the dissociation constant (pKq) by 2,823, 13 units. , addition of acrylonitrile - by 2.21-2.50, 2-methyl acrylonitrile - by 2.37-2.65, p, p-dichloroethyl vinylphosphonic acid ester - by 1.70, vinyl methyl ketone - by 0.40. The proposed modification lowers the pKq values of the amino groups and brings them closer to the dissociation constants of the acid groups. Therefore, the proposed ampholetite carrier acquires a large buffer capacity and conductivity, as compared to the known ones.

Предлагаемый амфолит-носитель готов т следующим образом.The proposed ampholyte carrier is prepared as follows.

Пример. В трехгорлой колбе емкостью 100 мл с мешалкой, капельной воронкой и приспособлением дл продувки азотом помещают 9,0 г {0,06 моль) триэтилентетрамина и 20 мл деионизированной воды. При перемешивании по капл м ввод т 1,59 г (0,03 моль) акрилонитрила и 4,9 г (0,03 моль) метилового эфира винилфосфоновой кислоты. Смесь перемешивают 2 ч при 70с, затем охлаждают до комнатной температуры, добавл ют по капл м 6,46 г - . (0,09 моль) свежеперегнанной акриловой кислоты и перемешивают 16 ч, при . Продукт реакции разбавл ют до 88 мл, трижды обрабатывают активированным углем (в атмосфере азота) при бО-ЭО С и фильтруют .Example. In a 100 ml three-neck flask with a stirrer, an addition funnel and a nitrogen purge device, 9.0 g {0.06 mol) of triethylentetramine and 20 ml of deionized water are placed. Under stirring, 1.59 g (0.03 mol) of acrylonitrile and 4.9 g (0.03 mol) of methyl phosphonate are added dropwise. The mixture is stirred for 2 hours at 70 ° C, then cooled to room temperature, 6.46 g is added dropwise. (0.09 mol) of freshly distilled acrylic acid and stirred for 16 h, at. The reaction product is diluted to 88 ml, treated three times with activated carbon (under a nitrogen atmosphere) at a BE-EO C and filtered.

Полученный таким образом амфолит-носитель образует пр молинейный градиент рЧ в интервале 3-9 при изоэлектрическом фокусировании в градиенте плотности. При изоэлектрическом фокусировании в тонком слое сефадекса амфолитноситель образует примерно пр мо0 линейный градиент рН в интервале 5,5-8,0. Аналогичные амфолиты-носители , изготовленные по известным методикам, дают нелинейные градиенты рН.The ampholyte carrier obtained in this way forms a rectilinear rF gradient in the range of 3–9 with isoelectric focusing in a density gradient. With isoelectric focusing in a thin layer of Sephadex, the ampholytic carrier forms an approximately straight linear pH gradient in the range of 5.5–8.0. Similar ampholytes carriers, made by known methods, give nonlinear pH gradients.

Пример 2. В аппаратуру, Example 2. In hardware

5 описанную в примере 1, помещают 9,45. г (0,4 моль) смеси полиэтиленполиаминов (фракци , кип ща при 100-220°С/1 мм), 30 мл деионизированной воды, 3,3 г (0,025 моль) 5 described in example 1, placed 9.45. g (0.4 mol) of a mixture of polyethylene polyamines (fraction boiling at 100-220 ° C / 1 mm), 30 ml of deionized water, 3.3 g (0.025 mol)

0 вийилфенилчетона, 2,65 г (0,032 моль виЕ илметилсульфона, 2,15 г (0,025 моль) метилового эфира акриловой кислоты и 1,75 г (0,035 моль) винилметилкетона. Смесь перемеши5 вают в течение 5 ч при комнатной температуре, затем по капл м до ,бавл ют 1,2 г акриловой кислоты и перемешивают 20 ч при 70°С. Реакционную смесь разбавл ют до 100 мл 0 viylphenylcheton, 2.65 g (0.032 mol of VE or methylmethyl sulfone, 2.15 g (0.025 mol) of acrylic acid methyl ester and 1.75 g (0.035 mol) of vinyl methyl ketone. Mix the mixture for 5 hours at room temperature, then drop by drop 1.2 g of acrylic acid and stirred at 70 ° C for 20 h. The reaction mixture is diluted to 100 ml.

0 и o6pa6a.LHBamT как описано в примере 1.0 and o6pa6a.LHBamT as described in example 1.

Синтезированный таким путем амфолит-носитель образует пр молинейный градиент рН в интервале 3-8.Synthesized in this way, the ampholyte carrier forms a rectilinear pH gradient in the range of 3–8.

Пример 3. В аппаратуру, описанную в примере 1, помещают 11,3 г (0,07 моль) смеси полиэтт;ленполиаминов (фракци , кип ща при 100-200 c/l мм) и 20 мл деионизи.рованной воды. Через капельную воронку ввод т смесь 7,0 г (0,04 моль) акрилоилморфолина, 3,44 г (0,04 моль) кротононитрила, 5,.15 г (0,04 моль) винилсульфонамида и 6,48 г (0,09 моль) акриловой кислоты. Смесь перемешивают при 50°С в течение 18 ч, разбавл ют деионизированной водой до 110 мл и обрабатывают как описано в примере 1.Example 3. In the apparatus described in example 1, 11.3 g (0.07 mol) of a mixture of polyett, lenpolyamines (fraction boiling at 100–200 s / l mm) and 20 ml of deionized water are placed. A mixture of 7.0 g (0.04 mol) of acryloylmorpholine, 3.44 g (0.04 mol) of crotononitrile, 5, .15 g (0.04 mol) of vinyl sulfonamide and 6.48 g (0, 09 mol) of acrylic acid. The mixture was stirred at 50 ° C for 18 hours, diluted to 110 ml with deionized water and treated as described in Example 1.

Синтезированный таким образом . амфолит-носитель образует пр молинейный градиент рН в интервале 3-9.Synthesized in this way. the ampholyte carrier forms a linear pH gradient in the range of 3-9.

, Снижение температуры дистилл ции До исключает образование окрашенных смол, что улучшает качество амфолита-носител .The lowering of the distillation temperature Do eliminates the formation of colored resins, which improves the quality of the ampholyte carrier.

П р и м е р 4. (изоэлектрическое фокусирование белков).PRI me R 4. (isoelectric focusing of proteins).

С помощью амфолита-носител , полученного по предлагаемому способу, .провод т изоэлектрическое фокусирование модельных белков в тонком слое сефадекса и в градиенте плотности . Определ ют изоэлектрические 65 точки белков изоэлектрическим фоку-.Using an ampholyte carrier obtained by the proposed method, isoelectric focusing of model proteins is carried out in a thin layer of Sephadex and in a density gradient. Isoelectric 65 points of proteins are determined by isoelectric focus.

сированием в тонком слое сефадекса с использованием амЛолита-носител ,with the use of sephadex in a thin layer using amLolite-carrier,

изготовленного по примеру 2, Данные приведены в таблице.manufactured according to example 2, the Data are given in the table.

Изоэлектрические точки белков, полученный с использованием предлагаемого амфолита-носител , хорошо совпадают с литературными данными .The isoelectric points of proteins, obtained using the proposed ampholyte carrier, are in good agreement with the literature data.

Paздeл ющs o способность амфолитаносител определ ют изоэлектрическим фокусированием гемоглобина в градиенте плотности. Визуальное сравнение разделенных полос гемоглобина показало, что оно выше, чем в предлагаемом экг:перименте с амфолитрмносителем , полученным по известному способу.The separating ability of the ampholytic carrier is determined by the isoelectric focusing of hemoglobin in a density gradient. A visual comparison of the divided bands of hemoglobin showed that it is higher than in the proposed ECG: periment with an ampholytic carrier obtained by a known method.

Преимуществом предлагаемого способа вл етс также упрощение процесса изготовлени амфолитов-носителей за счет использовани более легкокип щих фракций технической смеси полиэтиленполиаминов при сохранении достаточно хорошей, линейности градиента рН, Снижение температуры перегонки упрощает этот процесс, кроме того, уменьшаетс возможность образовани побочных окрашенных продуктов, что улучшает качество амфолита-носител .The advantage of the proposed method is also to simplify the process of manufacturing ampholytes-carriers by using lighter fractions of the technical mixture of polyethylene polyamines while maintaining a sufficiently good pH gradient linearity. Lowering the distillation temperature simplifies this process, also reduces the possibility of forming side colored products, which improves quality of ampholyte carrier.

Claims

METHOD FOR PRODUCING AMPHOLITANE CARRIER FOR IZOELECTRIC FOCUSING AND ISOTACHOPHORESIS by modifying polyethylene polyamine with an unsaturated compound and interacting with modified polyethylene polypolyamines with acrylic acid, characterized in that the non-active compound is used as an ampholyte to increase the operational properties of the carrier electron-withdrawing groups ethylene bond of the General formula

Rp SI = C

L * ^X x where X is r-CN J -COOR, '-COR-,' -CONRR ¹ , · -so? r; -so? nrr '; -po (or)? ; _t —NO ?; 2-3- or 4-pyridyl;

R and R are a hydrogen atom, alkyl or aryl;

R (and R? Is a hydrogen atom, -CH ^ or X, and the modification is carried out in an aqueous medium at 20-70 ° C for 1-20 hours at a molar ratio of modifier and polyethylene polyamine (1-3): 1.

| 00

106221 8