SK50042015A3

SK50042015A3 - Two-chamber preparation with haemostatic effect

Info

Publication number: SK50042015A3
Application number: SK5004-2015A
Authority: SK
Inventors: Andrej Murányi; Eduard Tichý; Jana Pšenková; Ján Kochan
Original assignee: Hameln-Rds, A. S.
Priority date: 2015-01-21
Filing date: 2015-01-21
Publication date: 2016-08-01

Abstract

Podstatou vynálezu je dvojkomorový prípravok s hemostatickým účinkom, ktorý v prvej komore obsahuje lyofilizovaný trombín a pomocné látky a v druhej komore obsahuje gélové alebo gél tvoriace základy. Po mechanickom odstránení priečky medzi komorami je možné rýchle premiešanie oboch komôr za vzniku sterilného gélu alebo viskózneho roztoku. Takto je možné aplikovať prípravky aj na zle dostupné miesta a vnútorné orgány, kde vďaka mechanickým a reologickým vlastnostiam gélu nedochádza k jeho stečeniu či odplaveniu.SUMMARY OF THE INVENTION The subject of the invention is a two-chamber formulation with a hemostatic effect which comprises lyophilized thrombin and excipients in the first chamber and contains gel or gel forming bases in the second chamber. After mechanical removal of the partition between the chambers, it is possible to rapidly mix both chambers to form a sterile gel or viscous solution. Thus, it is possible to apply the preparations to poorly accessible sites and internal organs, where the mechanical and rheological properties of the gel do not cause it to flow or wash away.

Description

Dvojkomorový prípravok s hemostatickým účinkomTwo-chamber preparation with hemostatic effect

Oblasť technikyTechnical field

Vynález sa týka dvojkomorového prípravku s hemostatickým účinkom, ktorý obsahuje polotuhé, sterilné a stabilné formulácie trombínu v dvojkomorových plastových obaloch. Trombín je serínová proteáza s nezastupiteľným miestom v procese hemokoagulácie, pričom sa terapeuticky používa na zastavenie krvácania v chirurgii a urgentnej medicíne. Podstatou vynálezu je dvojkomorová tuba s obsahom stabilného lyofilizovaného prášku trombínu aexcipientov v jednej komore agélovým alebo gél-tvoriacim základom kompatibilným s trombínom v komore druhej. Po mechanickom odstránení priečky medzi komorami je možné jednoduché a rýchle premiešanie priamo v tube za vzniku homogénnej zmesi. Tento aplikačný systém, umožňuje jednoduchú manipuláciu, aplikáciu, skladovanie pri bežnej teplote a použitie aj mimo zdravotníckych zariadení ako napr. pri dopravných nehodách alebo bojových konfliktoch.BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention relates to a bicameral formulation having hemostatic action comprising semisolid, sterile and stable thrombin formulations in bicameral plastic containers. Thrombin is a serine protease with an irreplaceable site in the hemocoagulation process and is therapeutically used to stop bleeding in surgery and emergency medicine. The present invention provides a bicameral tube containing a stable lyophilized powder of thrombin and excipients in one chamber with an agel or gel-forming base compatible with thrombin in the other chamber. After mechanical removal of the partition between the chambers, simple and rapid mixing is possible directly in the tube to form a homogeneous mixture. This application system allows easy handling, application, storage at normal temperature and use outside of medical facilities such as medical devices. in traffic accidents or combat conflicts.

Doterajší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Trombín je serínová proteáza katalyzujúca konverziu fibrinogénu na fibrín. Podieľa sa na zosieťovaní fibrínových vlákien a aktivácií trombocytov. Terapeuticky sa používa najmä v urgentnej medicíne a chirurgií ako lokálne hemostatikum. Väčšina komerčne dostupných aktívnych hemostatík s obsahom trombínu je vo forme roztoku (Evicel®, Evithrom®) alebo prášku na prípravu roztoku (Beriplast®, Recothrom®, Thrombin-JMI®). Niektoré formulácie a spôsoby prípravy týchto produktov sú bližšie popísané v patentoch US 20060002918, US 20080311104 Al, US 5130244, US 469812 A2 alebo WO 2014087394 Al. Nevýhodou roztoku je nevyhnutnosť aplikácie s použitím aplikačných pomôcok ako napr. kvapkadla, sterilnej špongie alebo sterilnej gázy, nemožnosť aplikovať ich na zle dostupné miesta ako aj možné stečenie či odplavenie. Problém čiastočne rieši nanesenie trombínu, alebo jeho inkorporácia do vhodného nosiča za vzniku špongie, matrice, alebo krytia na rany. Široko dostupné sú materiály na báze kolagénu (Tachosil®) alebo želatíny (Floseal®, Surgiflo®, Thrombi-Gel®). Produkty s ich obsahom sú predmetom aj množstva patentov ako napr. US 4515637, US 6649162 BI, WO 1990013320 Al, US 8092820, WO 2002058750 A2, US 7923031 B2. Potenciálnou nevýhodou použitia nosičov živočíšneho pôvodu je však imunologická reakcia a riziko prenosu patogénov. Využitie iných biokompatibilných a bioabsorbovateľných polymérov neživočíšneho pôvodu sa spomína napr. v patente WO 2013059341, alebo WO 2010136818 A3, W02013082073 Al, US 8021684 B2. VoThrombin is a serine protease catalysing the conversion of fibrinogen to fibrin. It is involved in the crosslinking of fibrin fibers and platelet activation. It is used therapeutically especially in emergency medicine and surgery as a local haemostatic. Most commercially available active thrombin-containing hemostats are in the form of a solution (Evicel®, Evithrom®) or a powder for solution preparation (Beriplast®, Recothrom®, Thrombin-JMI®). Some formulations and methods of preparing these products are described in more detail in US 20060002918, US 20080311104 A1, US 5130244, US 469812 A2 or WO 2014087394 A1. A disadvantage of the solution is the necessity of application using application aids such as e.g. dropper, sterile sponge or sterile gauze, inability to apply them to poorly accessible areas as well as possible runoff or flushing. The problem is partially solved by the application of thrombin or its incorporation into a suitable carrier to form a sponge, matrix, or wound dressing. Collagen-based materials (Tachosil®) or gelatin (Floseal®, Surgiflo®, Thrombi-Gel®) are widely available. A number of patents such as e.g. US 4515637, US 6649162 B1, WO 1990013320 A1, US 8092820, WO 2002058750 A2, US 7923031 B2. However, a potential drawback of the use of carriers of animal origin is the immunological response and the risk of transmission of pathogens. The use of other biocompatible and bioabsorbable polymers of non-animal origin is mentioned e.g. in WO 2013059341, or WO 2010136818 A3, WO2013082073 A1, US 8021684 B2. within

-2všeobecnosti však stále popisujú suché, práškové formulácie alebo tvarovo určité mechanicky pevné krytia s hemostatickým účinkom. Ich nevýhodou je aj často krát náročný spôsob homogenizácie a zmiešavania s nosičom, pri ktorom môže potenciálne dôjsť k state sterility a poklesu užívateľského komfortu. Polotuhá formulácia prináša výhody v podobe jednoduchého dávkovania, aplikácie, možnosti aplikovať v požadovanej vrstve na požadovanej ploche a adhezívnych vlastností na rane a v jej okolí. Navyše použitie a aplikácia topických liekových foriem ako napr. hydrogélov v kelímkoch či tubách je široko zaužívaná, a akceptovaná zdravotníckymi pracovníkmi aj laickou verejnosťou v terapii rozličných ochorení. Patent US 5595735 A popisuje prípravu hemostatickej pasty s obsahom trombínu na báze polyetylénglykolu. Po lyofilizácií roztoku dochádza k vzniku polotuhej relatívne zle rozpustnej pasty s dispergovaným trombínom a zachovaným hemostatických účinkom. Vynález nepopisuje spôsob sterilizácie formulácie.Generally, however, dry, powder formulations or certain mechanically solid hemostatic coatings are still described. Their disadvantage is also the often time-consuming method of homogenization and mixing with the carrier, in which state sterility and a decrease in user comfort can potentially occur. The semi-solid formulation provides the advantages of simple dosing, application, the ability to apply in a desired layer on a desired area, and adhesive properties to and around the wound. In addition, the use and application of topical dosage forms such as e.g. hydrogels in pots or tubes are widely used and accepted by healthcare professionals and the general public in the treatment of various diseases. US 5595735 A discloses the preparation of a thrombin-containing hemostatic paste based on polyethylene glycol. After lyophilization of the solution, a semi-solid, relatively poorly soluble paste is formed with dispersed thrombin and retained hemostatic effects. The invention does not disclose a method of sterilizing a formulation.

Predložený vynález popisuje dvojkomorový prípravok s hemostatickým účinkom , ktorý obsahuje polotuhé formulácie trombínu na báze konvenčných gólových základov ako aj termosenzitívneho gél-tvoriaceho základu, v ktorých je účinná látka priamo rozpustená a je možná ich príprava s použitím konvenčných techník sterilizácie ako autoklávovanie či antimikrobiálna filtrácia.The present invention describes a bicameral hemostatic formulation comprising semisolid thrombin formulations based on conventional goal bases as well as a thermosensitive gel-forming base in which the drug is directly dissolved and can be prepared using conventional sterilization techniques such as autoclaving or antimicrobial filtration.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Podstatou vynálezu je dvojkomorový prípravok s hemostatickým účinkom, ktorý v prvej komore obsahuje lyofilizovaný trombín a pomocné látky a v druhej komore obsahuje gélové alebo gél-tvoriace základy.The present invention provides a two-chamber formulation with a hemostatic effect, comprising in the first chamber lyophilized thrombin and excipients and in a second chamber gel or gel-forming bases.

Lyofilizovaný trombín je ľudského, alebo hovädzieho pôvodu, t.j. izolovaný z ľudskej alebo bovínnej plazmy, alebo rekombinantný t.j. pripravený technikami rekombinantnej DNA v koncentrácii 500 - 10000 IU/300 mg lyofilizátu, výhodne 2000 - 4000 IU/300 mg lyofilizátu.Lyophilized thrombin is of human or bovine origin, i. isolated from human or bovine plasma, or recombinant i.e. prepared by recombinant DNA techniques at a concentration of 500-10000 IU / 300 mg lyophilisate, preferably 2000-4000 IU / 300 mg lyophilisate.

Dvojkomorový prípravok ako stabilizátory obsahuje anorganické soli chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid horečnatý, bromid draselný, výhodne chlorid sodný v koncentrácií 50 -500 mM, výhodne 100-200 mM.The bicameric stabilizer composition comprises inorganic salts sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, potassium bromide, preferably sodium chloride at a concentration of 50 -500 mM, preferably 100-200 mM.

Dvojkomorový prípravok ako stabilizátor obsahuje rozpustný polyvinylpyrolidón s priemernou molekulovou hmotnosťou 2000 - 1500 000, výhodne 2000 - 54 000, najvýhodnejšie 2000 -11000 v koncentrácií 1-10 % m/v, výhodnejšie 2-5% m/v.The bicameric stabilizer composition comprises soluble polyvinylpyrrolidone having an average molecular weight of 2000-1,500,000, preferably 2000-554,000, most preferably 2000-11000 at a concentration of 1-10% w / v, more preferably 2-5% w / v.

Dvojkomorový prípravok s výhodou obsahuje kryštalizujúce excipienty ako manitol, lyzín a/alebo glycín v koncentrácii 5-15 % m/v, výhodne 4-7 % m/v.The bicameric composition preferably comprises crystallizing excipients such as mannitol, lysine and / or glycine at a concentration of 5-15% w / v, preferably 4-7% w / v.

-3Dvojkomorový prípravok ďalej obsahuje chlorid vápenatý alebo uhličitan vápenatý v koncentrácii 0,002-0,2 mM, výhodne 0,005-0,05 mM chloridu vápenatého.The dual-chamber preparation further comprises calcium chloride or calcium carbonate at a concentration of 0.002-0.2 mM, preferably 0.005-0.05 mM calcium chloride.

Dvojkomorový prípravok podľa ďalšieho uskutočnenia v druhej komore obsahuje sterilizovateľný gél na báze prírodných polymérov (alginát sodný, iota a lambda karagénan, xantánová guma, traganth, agar, pektín, guarová guma, gelánová guma), polosyntetických polymérov (sodná soľ karboxymetylcelulózy, metylcelulóza, hydroxypropylmetylcelulóza) alebo syntetických polymérov (karbomér, polykarbofil, poly(metylvinyléter/maleín anhydrid) dekadién krospolymér) v koncentrácií 0,1 - 10 hmotn. %, výhodne 1-3 hmotn. % a fyziologicky akceptovateľný tlmivý systém s pH 5 až 8, výhodne 6 až 7 a anorganickú soľ v koncentrácií 50 -500 mM, výhodne 100-200 mM.The bicameral formulation according to another embodiment in the second chamber comprises a sterilizable gel based on natural polymers (sodium alginate, iota and lambda carrageenan, xanthan gum, tragacanth, agar, pectin, guar gum, gellan gum), semisynthetic polymers (sodium methylcellulose, carboxymethylcellulose, ) or synthetic polymers (carbomer, polycarbophil, poly (methyl vinyl ether / maleic anhydride) decadiene crospolymer) in a concentration of 0.1 - 10 wt. %, preferably 1-3 wt. % and a physiologically acceptable buffer system at a pH of 5-8, preferably 6-7, and an inorganic salt at a concentration of 50-500 mM, preferably 100-200 mM.

Dvojkomorový prípravok podľa iného uskutočnenia v druhej komore obsahuje roztok s obsahom termosenzitívneho polyméru poloxaméru v koncentrácii 12-22 hmotn. %, výhodne 15-18 hmotn. %, hydrofilné rozpúšťadlo ako voda, alebo fyziologicky akceptovateľný tlmivý systém s pH 5 až 8, výhodne 6 až 7 a anorganickú soľ v koncentrácií 50 -500 mM, výhodne 100-200 mM.The bicameral formulation according to another embodiment in the second chamber comprises a solution containing a thermosensitive poloxamer polymer in a concentration of 12-22 wt. %, preferably 15-18 wt. %, a hydrophilic solvent such as water, or a physiologically acceptable buffer system at a pH of 5-8, preferably 6-7, and an inorganic salt at a concentration of 50-500 mM, preferably 100-200 mM.

Dvojkomorový prípravok podľa ďalšieho uskutočnenia v druhej komore obsahuje roztok polysacharidov napr. pektínu a/alebo alginátu sodného v koncentrácií 0,1 až 5 hmotn. %, výhodne 0,5 až 3 %, hydrofilného rozpúšťadla ako voda, alebo fyziologicky akceptovateľný tlmivý systém s pH 5 až 8, výhodne 6 až 7 a anorganickú soľ v koncentrácií 50 až 500 mM, výhodne 100 až 200 mM.The bicameral formulation according to another embodiment in the second chamber comprises a polysaccharide solution e.g. % pectin and / or sodium alginate at a concentration of 0.1 to 5 wt. %, preferably 0.5 to 3%, of a hydrophilic solvent such as water, or a physiologically acceptable buffer system at a pH of 5-8, preferably 6-7, and an inorganic salt at a concentration of 50-500 mM, preferably 100-200 mM.

Toto riešenie popisuje dvojkomorový prípravok s hemostatickým účinkom, ktorý obsahuje formulácie trombínu v dvojkomorových plastových primárnych obaloch. Dvojkomorový systém pozostáva z komory naplnenej lyofilizovanou zmesou trombínu a pomocných látok zabezpečujúcich jeho stabilitu a druhej komory s obsahom gélových alebo gél-tvoriacich základov na báze prírodných, syntetických a polosyntetických polymérov kompatibilných s trombínom. Po odstránení priečky medzi dvoma komorami plastovej tuby je možné rýchle premiešanie gélového alebo gél-tvoriaceho základu s lyofilizovaným práškom za vzniku homogénnej zmesi. Nakoľko k premiešaniu a homogenizácií dochádza priamo v tube nehrozí riziko mikrobiálnej kontaminácie sterilného produktu. Vzniknutý gél, alebo viskózny roztok je možné aplikovať priamo z tuby či prstami v sterilnej rukavici, bez nutnosti použiť aplikačné pomôcky (sterilné gázy, špongie) ako je to v prípade roztoku. V prípade termosensitívneho gél-tvoriaceho základu je možné jeho premena na gél krátkym zahriatím v dlani, alebo aplikácia vo forme viskózneho roztoku, pričom k zmene štruktúryThis solution describes a bicameral formulation having a hemostatic effect comprising thrombin formulations in bicameral plastic primary containers. The bicameral system consists of a chamber filled with a freeze-dried mixture of thrombin and excipients ensuring its stability, and a second chamber containing gel or gel-forming bases based on thrombin-compatible natural, synthetic and semi-synthetic polymers. After removal of the partition between the two chambers of the plastic tube, it is possible to rapidly mix the gel or gel-forming base with the lyophilized powder to form a homogeneous mixture. As the mixing and homogenization takes place directly in the tube, there is no risk of microbial contamination of the sterile product. The resulting gel or viscous solution can be applied directly from the tube or toes in a sterile glove, without the need for application devices (sterile gauze, sponges) as is the case with the solution. In the case of a thermosensitive gel-forming base it is possible to convert it into a gel by briefly heating it in the palm or applying it in the form of a viscous solution, while changing the structure

-4dochádza bezprostredne po aplikácií. Takto je možné aplikovať prípravky aj na zle dostupné miesta a vnútorné orgány, kde vďaka mechanickým a Teologickým vlastnostiam gélu nedochádza k jeho stečeniu či odplaveniu, ale k rýchlej hemokoagulácií. Navyše po topickej aplikácii trombínu vo forme gélu dochádza k nižšej absorbcii aktívneho liečiva do systému (plazma, tkanivá), ako je v prípade podania vo forme roztoku, čo vedie k vyššej bezpečnosti pre pacienta.-4That occurs immediately after application. Thus it is possible to apply the preparations also to poorly accessible places and internal organs, where due to the mechanical and theological properties of the gel, it does not run off or wash away, but rather rapid blood coagulation. Moreover, after topical application of thrombin in the form of a gel, the active drug is less absorbed into the system (plasma, tissues) than when administered as a solution, resulting in greater patient safety.

Prášok v jednej komore dvojkomorového systému pozostáva z lyofilizovanej zmesi trombínu a pomocných látok. Pomocné látky slúžia ako stabilizátory a plnivá vytvárajúce dostatočný objem práškovej zmesi aj pri nízkej koncentrácií liečiva. pH po rekonštitúcií je v rozmedzí 5 až 8, výhodne 6 až 7, čo je zabezpečené prítomnosťou fyziologicky a farmaceutický akceptovateľných tlmivých prísad ako napr. fosforečnanový, citrátový, sukcinátový, histidínový, acetátový tlmivý systém a pod. Ako stabilizátor brániace agregácií/ precipitácií počas prípravy roztoku a jeho následnej lyofilizácií a ako plnivo je v zložení prítomná anorganická soľ, polyvinylpyrolidón acukomý alkohol alebo aminokyselina, kryštalizujúca počas procesu lyofilizácie.The powder in one chamber of the bicameral system consists of a lyophilized mixture of thrombin and excipients. The excipients serve as stabilizers and fillers to form a sufficient powder mixture volume even at low drug concentrations. The pH after reconstitution is in the range of 5 to 8, preferably 6 to 7, which is ensured by the presence of physiologically and pharmaceutically acceptable buffers such as e.g. phosphate, citrate, succinate, histidine, acetate buffer and the like. As the stabilizer preventing aggregation / precipitation during solution preparation and subsequent lyophilization, and as a filler, an inorganic salt, polyvinylpyrrolidone and any alcohol or amino acid crystallizing during the lyophilization process is present in the composition.

Trombín ako liečivo v zložení môže byť ľudského, alebo hovädzieho pôvodu, t.j. izolovaný z ľudskej alebo bo vinnej plazmy, alebo rekombinantný t.j. pripravený technikami rekombinantnej DNA v koncentrácií 500 až 10000 IU/300 mg lyofilizátu, výhodne 2000 až 4000 IU/300 mg lyofilizátu.The thrombin as a drug in the composition may be of human or bovine origin, i. isolated from human or bovine plasma, or recombinant i.e. prepared by recombinant DNA techniques at a concentration of 500 to 10000 IU / 300 mg lyophilisate, preferably 2000 to 4000 IU / 300 mg lyophilisate.

Ako anorganická soľ je vhodný chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid horečnatý, bromid draselný, výhodne chlorid sodný v koncentrácií 50 až 500 mM, výhodnejšie 100 až 200 mM.Suitable inorganic salts are sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, potassium bromide, preferably sodium chloride in a concentration of 50 to 500 mM, more preferably 100 to 200 mM.

Ako polyvinylpyrolidón je vhodný rozpustný polyvinylpyrolidón s priemernou molekulovou hmotnosťou 2000 až 1500 000, výhodne 2000 až 54 000, najvýhodnejšie 2000 až 11000 v koncentrácií 1-10 % m/v, výhodnejšie 2-5% m/vSuitable polyvinylpyrrolidone is soluble polyvinylpyrrolidone having an average molecular weight of 2000 to 1500,000, preferably 2000 to 54,000, most preferably 2000 to 11,000 in a concentration of 1-10% w / v, more preferably 2-5% w / v

Súčasťou zloženia môžu byť aj kryštalizujúce pomocné látky ako manitol, lyzín a/alebo glycín v koncentrácií 5-15 % m/v, výhodne 4-7 % m/v.Crystallizing excipients such as mannitol, lysine and / or glycine may also be included in the composition at a concentration of 5-15% w / v, preferably 4-7% w / v.

Súčasťou zloženia môže byť aj chlorid vápenatý alebo uhličitan vápenatý ako aktívna látka podporujúca zosieťovanie gél-tvoriacich polymérov a fibrínových vlákien v koncentrácií 0,002 až 0,2 M, výhodne 0,005 až 0,05 M chloridu vápenatého.The composition may also comprise calcium chloride or calcium carbonate as the active agent promoting the crosslinking of the gel-forming polymers and fibrin fibers in a concentration of 0.002 to 0.2 M, preferably 0.005 to 0.05 M calcium chloride.

Sterilita roztoku trombínu a pomocných látok pred lyofilizáciou a plnením je zabezpečená sterilnou filtráciou cez vhodný membránový filter s nízkou sorpciou proteínov a s veľkosťou pórov 0,2 pm a menej.The sterility of the thrombin solution and excipients prior to lyophilization and filling is ensured by sterile filtration through a suitable membrane filter with low protein sorption and a pore size of 0.2 µm or less.

-5Gélový alebo gél-tvoriaci základ v druhej komore dvojkomorového systému je gél alebo roztok, ktorý tvorí gél buď po krátkom zahriatí alebo in-situ na mieste aplikácie tzv. termosenzitívny gél alebo roztok tvoriaci gél po zmiešaní s práškom obsahujúcim Ca²⁺ , alebo iné dvojmocné ióny.The gel or gel-forming base in the second chamber of the bicameral system is a gel or solution that forms a gel either after brief heating or in-situ at the site of application. a thermosensitive gel or gel-forming solution after mixing with a powder containing Ca ²⁺ , or other divalent ions.

Gélové základy v druhej komore dvojkomorovej tuby pozostávajú z biokompatibilných gélov na báze prírodných polymérov (alginát sodný, iota a lambda karagénan, xantánová guma, tragant, agar, pektín, guarová guma, gelánová guma), polosyntetických polymérov (sodná soľ karboxymetylcelulózy, metylcelulóza, hydroxypropylmetylcelulóza) alebo syntetických polymérov (karbomér, polykarbofil, poly(metylvinyléter/maleín anhydrid) dekadién krospolymér) v koncentrácií 0,1 až 10 hmotn. %, výhodne 1-3 hmotn. % a hydrofilného rozpúšťadla, ako destilovaná voda alebo fyziologicky akceptovateľný tlmivý systém s pH 5 až 8, výhodne 6 až 7 a anorganickej soli v koncentrácií 50 až 500 mM, výhodne 100 až 200 mM.The gel bases in the second chamber of the bicameral tube consist of biocompatible gels based on natural polymers (sodium alginate, iota and lambda carrageenan, xanthan gum, tragacanth, agar, pectin, guar gum, gellan gum), semi-synthetic methyl cellulose, sodium cellulose, cellulose methyl cellulose, sodium cellulose, %) or synthetic polymers (carbomer, polycarbophil, poly (methyl vinyl ether / maleic anhydride) decadiene crospolymer) in a concentration of 0.1 to 10 wt. %, preferably 1-3 wt. % and a hydrophilic solvent such as distilled water or a physiologically acceptable buffer system at a pH of 5-8, preferably 6-7, and an inorganic salt at a concentration of 50-500 mM, preferably 100-200 mM.

Gél-tvoriaci in-situ základ v druhej komore pozostáva z roztoku s obsahom termosenzitívneho polyméru poloxaméru v koncentrácií 12 až 22 hmotn. %, výhodne 15 až 18 hmotn. %, hydrofilného rozpúšťadla ako je voda, alebo fyziologicky akceptovateľný tlmivý systém s pH 5 až 8, výhodne 6 až 7 a anorganickej soli v koncentrácií 50 až 500 mM, výhodne 100 až 200 mM.The gel-forming in-situ base in the second chamber consists of a solution containing a thermosensitive poloxamer polymer in a concentration of 12 to 22 wt. %, preferably 15 to 18 wt. %, a hydrophilic solvent such as water, or a physiologically acceptable buffer system at a pH of 5-8, preferably 6-7, and an inorganic salt at a concentration of 50-500 mM, preferably 100-200 mM.

Gél-tvoriaci základ zosieťovaný kontaktom s divalentnými iónmi kovov v druhej komore pozostáva z roztoku polysacharidov ako napr. pektín a/alebo alginát sodný v koncetrácií 0,1 až 5 hmotn. %, výhodne 0,5 až 2 hmotn. % a hydrofilného rozpúšťadla ako je voda, alebo fyziologicky akceptovateľný tlmivý systém s pH 5 až 8, výhodne 6 až 7 a anorganickej soli v koncentrácií 50 až 500 mM, výhodne 100 až 200 mM.The gel-forming base crosslinked by contact with divalent metal ions in the second chamber consists of a solution of polysaccharides such as e.g. pectin and / or sodium alginate at a concentration of 0.1 to 5 wt. %, preferably 0.5 to 2 wt. % and a hydrophilic solvent such as water, or a physiologically acceptable buffer system at a pH of 5-8, preferably 6-7, and an inorganic salt at a concentration of 50-500 mM, preferably 100-200 mM.

Gélové základy sa sterilizujú autoklávovaním alebo inou vhodnou metódou, géltvoriace základy je možné sterilizovať filtráciou cez vhodný membránový filter s veľkosťou pórov 0,2 pm a menej.The gel bases are sterilized by autoclaving or other suitable method, the gel-forming bases can be sterilized by filtration through a suitable membrane filter having a pore size of 0.2 µm or less.

Dvojkomorová plastová tuba pozostáva z materiálov bežne používaných pri výrobe túb na polotuhé liekové formy, ako polyetylén, polypropylén, alebo polyetylén s polaminovaným povrchom. Priehradka medzi komorami vznikne zatavením tuby pri nižšej teplote a tlaku tak, aby ju bolo možné jednoduchým stlačením rozdeliť, pričom dôjde k zmiešaniu obsahov oboch komôr.A two-chamber plastic tube consists of materials commonly used in the manufacture of tubes for semi-solid dosage forms such as polyethylene, polypropylene, or polyethylene with a laminated surface. The compartment between the chambers is formed by sealing the tube at a lower temperature and pressure so that it can be divided by simple compression, mixing the contents of the two chambers.

-6Prehľad obrázkov na výkresoch-6Overview of figures in drawings

Obrázok 1: Graf kompatibility gélových základov s rh trombínom.Figure 1: Graph of compatibility of gel bases with rh thrombin.

Obrázok 2: In-vivo hodnotenie hemostatického efektu rh trombínu (povrchové krvácanie, v.jugularis) v termosenzitívnom in-situ gél-tvoriacom základe (Pluronic® F 127)Figure 2: In-vivo assessment of the hemostatic effect of rh thrombin (superficial bleeding, v.jugularis) in a thermosensitive in-situ gel-forming base (Pluronic® F 127)

Obrázok 3 In-vivo hodnotenie hemostatického efektu rh trombínu (hĺbkové krvácanie, pečeň) v termosenzitívnom in-situ gél-tvoriacom základe (Pluronic® F 127)Figure 3 In-vivo evaluation of the hemostatic effect of rh thrombin (deep bleeding, liver) in a thermosensitive in-situ gel-forming base (Pluronic® F 127)

Obrázok 4: In-vivo hodnotenie hemostatického efektu rh trombínu (povrchové krvácanie, v.jugularis) vo forme polyakrylátového géluFigure 4: In-vivo assessment of the hemostatic effect of rh thrombin (superficial bleeding, v. Jugularis) in the form of a polyacrylate gel

Obrázok 5'- Pomer obsahu [¹²⁵I]-rh trombínu v tkanive pečene ku plazmatickým hladinám (T/P) po lokálnej aplikácií testovaných formulácií na poškodenú pečeň Wistar potkanovFigure 5'- Ratio of [ ¹²⁵ I] -rh thrombin content in liver tissue to plasma levels (T / P) after topical application of test formulations to damaged liver of Wistar rats

Príklady uskutočnenia vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Predmet vynálezu je objasnený v príkladoch bez toho aby sa na ne obmedzoval.The subject matter of the invention is illustrated in the examples without being limited thereto.

Príklad 1: Rekombinantný ľudský trombín (rh trombín) a termosenzitívny in-situ gél-tvoriaci základ na báze blokového kopolyméru etylénoxidu a propylénoxidu (poloxamér)Example 1: Recombinant human thrombin (rh thrombin) and thermosensitive in-situ gel-forming base based on block copolymer of ethylene oxide and propylene oxide (poloxamer)

a) Zloženie(a) Composition

Komora 1: rh trombínChamber 1: rh thrombin

Prísada additive Množstvo na 1 ml roztoku Quantity per ml of solution Množstvo na 1 tubu Quantity per tube rh trombín rh thrombin 0,3 mg 0.3 mg 0,9 mg 0,9 mg Glycín glycine 0,05 g 0.05 g 0,15 g 0.15 g Polyvinylpyrolidón (Kollidon® 17 PF) Polyvinylpyrrolidone (Kollidon® 17 PF) 0,03 g 0,03 g 0,09 g 0.09 g Kyselina jantárová Succinic acid 0,00295 g 0.00295 g 0,0089 g 0.0089 g Chlorid sodný Sodium chloride 0,009 g 0.009 g 0,0270 g 0,0270 g Hydroxid sodný Sodium hydroxide do pH 6,2 to pH 6.2 do pH 6,2 to pH 6.2 Voda na injekcie Water for injections do 1 ml to 1 ml do 3 ml to 3 ml

Komora 2: Gél-tvoriaci základChamber 2: Gel-forming base

Prísada additive Množstvo na 1 g roztoku Amount per 1 g of solution Množstvo na 1 tubu Quantity per tube Poloxamér 407 (Pluronic® F 127) Poloxamer 407 (Pluronic® F 127) 0,16 g 0.16 g 0,48 g 0.48 g Kyselina jantárová Succinic acid 0,00248 g 0.00248 g 0,00744 g 0.00744 g Chlorid sodný Sodium chloride 0,0076 g 0.0076 g 0,0228 g 0.0228 g

-Ί --Ί -

Hydroxid sodný Sodium hydroxide do pH 6,2 to pH 6.2 Voda na injekcie Water for injections do 1 8 to 1 8

b) Postup prípravy:(b) Preparation procedure:

Príprava lyofilizátu do komory 1: Vo vode na injekcie sa rozpustí kyselina jantárová, chlorid sodný a pH sa upraví na 6,2 s použitím roztoku 1 M NaOH. V roztoku sa rozpustí polyvinylpyrolidón, glycín, skontroluje sa pH (6,i až 6,3), v prípade potreby sa upraví roztokom IM NaOH/HCl. Nakoniec sa v roztoku rozpustí trombín a doplní sa do požadovaného objemu. Roztok sa v čistých priestoroch prefiltruje cez 0,2 pm membránový filter. Pripravený roztok sa lyofilizuje na táckach pri teplote -25 °C/O,1 mbar (primárne sušenie) a +30 °C /0,01 mbar (sekundárne sušenie) do konečného obsahu vlhkosti menej ako 2 %. Získaný prášok sa aseptický plní po 270 až 330 mg do plastových túb.Preparation of lyophilisate in chamber 1: Succinic acid, sodium chloride are dissolved in water for injection and the pH is adjusted to 6.2 using 1M NaOH solution. Dissolve polyvinylpyrrolidone, glycine in the solution, check the pH (6 to 6,3), adjust if necessary with 1M NaOH / HCl solution. Finally, thrombin is dissolved in the solution and made up to the desired volume. The solution is filtered through a 0.2 µm membrane filter in clean rooms. The prepared solution is lyophilized on trays at -25 ° C / 0.1 mbar (primary drying) and +30 ° C / 0.01 mbar (secondary drying) to a final moisture content of less than 2%. The powder obtained is aseptically filled at 270 to 330 mg in plastic tubes.

Príprava náplne do Komory 2: Vo vode na injekcie sa rozpustí kyselina jantárová, chlorid sodný a pH sa upraví na 6,2 s použitím roztoku 1 M NaOH. Do takto pripraveného roztoku sa pridá poloxamér 407 a zmes sa nechá hydratovať po dobu 12 hodín pri 2 až 8 °C. pH sa skontroluje a v prípade potreby upraví roztokom IM NaOH/HCl na 6,1 až 6,3. Roztok sa prefiltruje pri teplote do 20 °C cez 0,2 pm membránový filter a aseptický plní do druhej komory plastovej tuby.Preparation of Chamber Fill 2: Succinic acid, sodium chloride are dissolved in water for injection and the pH is adjusted to 6.2 using 1 M NaOH solution. Poloxamer 407 was added to the thus prepared solution and the mixture was allowed to hydrate for 12 hours at 2-8 ° C. The pH is checked and adjusted to 6.1-6.3 with 1M NaOH / HCl solution if necessary. The solution is filtered at a temperature of up to 20 ° C through a 0.2 µm membrane filter and aseptically filled into a second chamber of the plastic tube.

Spôsobom podľa prezentovaného vynálezu sa získa lyofilizovaný stabilný prášok so zachovanou koagulačnou aktivitou, obsahom a čistotou a vyhovujúcim vzhľadom. Stabilitné dáta lyofilizovaného prášku sú uvedené v Tabuľke 1.By the method of the present invention, a lyophilized stable powder is obtained with retained coagulation activity, content and purity and a satisfactory appearance. The stability data of the lyophilized powder is shown in Table 1.

Tabuľka 1: Stabilita rh trombínu v lyofilizovanom stave (príklad 1)Table 1: Stability of rh thrombin in lyophilized state (Example 1)

Parameter parameter Vstup entry Po 1 mesiaci (40 °C/75 % R.H.) After 1 month (40 ° C / 75% R.H.) Po 2 mesiacoch (25 C/60 % R.H.) Mon 2 months (25 C / 60% RH) Po 2 mesiacoch (40 C/75 % R.H.) Mon 2 months (40 C / 75% R.H.) Po 3 mesiacoch (25 °C/60 % R.H.) Mon 3 months (25 ° C / 60% RH) Po 3 mesiacoch (40 °C/75 % R.H.) Mon 3 months (40 ° C / 75% RH) Špecifická aktivita fIU/ml] Specific activity fIU / ml] 971 971 892 892 891 891 936 936 935 935 887 887 Koagulačná aktivita f IU/ml ] Coagulation activity f IU / ml] 1130 1130 984 984 1108 1108 1005 1005 982 982 966 966 Obsah trombínu fmg/mll Thrombin content fmg / ml 0,31 0.31 0,33 0.33 0,31 0.31 0,31 0.31 0,31 0.31 0,30 0.30 Čistota r%l Purity r% l 88,5 88.5 89,3 89.3 89,8 89,8 91,3 91.3 92,1 92.1 92,5 92.5 pH pH 6,11 6.11 6,08 6.08 6,05 6.05 6,03 6.03 6,12 6,12 6,15 6.15 Vzhľad appearance Homogénny, biely prášok Homogeneous, white powder Homogénny, biely prášok Homogeneous, white powder Homogénny, biely prášok Homogeneous, white powder Homogénny, biely prášok Homogeneous, white powder Homogénny, biely prášok Homogeneous, white powder Homogénny, biely prášok Homogeneous, white powder

-8Použité metódy:-8 Methods used:

Obsah a čistota sa merala metódou RP HPLC. Chromatografické podmienky: stacionárna fáza: Zorbax SB-C8 (150 x 3mm, 3pm), mobilná fáza: A - 0.1% kyselina mravčia vo vode, B - 0,085 % kyselina mravčia v acetonitrile. Teplota kolóny: 25 °C, prietok: 0.5ml/min, nástrek: 10μ1, detekcia: DAD (280nm). Gradient: 0 min - 5% B, 82 min - 60% B, 83 min - 5% B, 92 min - 5% B.Content and purity were measured by RP HPLC. Chromatographic conditions: stationary phase: Zorbax SB-C8 (150 x 3mm, 3pm), mobile phase: A - 0.1% formic acid in water, B - 0.085% formic acid in acetonitrile. Column temperature: 25 ° C, flow rate: 0.5ml / min, injection: 10μ1, detection: DAD (280nm). Gradient: 0 min - 5% B, 82 min - 60% B, 83 min - 5% B, 92 min - 5% B.

Špecifická aktivita sa merala po potrebnom riedení s použitím chromogénneho substrátu S-2238. Kinetika hydrolýzy substrátu bola monitorovaná v 1 min. intervaloch meraním absorbancie pri 405 nm. Nárast absorbancie je úmerný enzymatickej aktivite trombínu vo vzorke. Výsledná špecifická aktivita bola prepočítaná podľa priemerného nárastu absorbancie cez kalibračnú krivku pripravenú z trombínu z ľudskej plazmy.Specific activity was measured after the necessary dilution using the chromogenic substrate S-2238. The kinetics of substrate hydrolysis was monitored at 1 min. intervals by measuring absorbance at 405 nm. The increase in absorbance is proportional to the enzymatic activity of thrombin in the sample. The resulting specific activity was calculated according to the mean increase in absorbance over a calibration curve prepared from human plasma thrombin.

Koagulačný čas sa meral s použitím koagulometra CL4 (Behnk Elektroník, Nemecko). Vzorky boli riedené 0,025 M CaCL na teoretickú aktivitu 2,5 IU/ml. . Prídavok vzorky do ľudskej plazmy aktivuje koagulačnú kaskádu, vedúcu k vzniku precipitátu, ktorý bol detegovaný zastavením rotujúcej kovovej guľôčky v magnetickom poli na dne reakčnej kyvety. Koagulačný čas je úmerný množstvu, alebo aktivite trombínu. Výsledká aktivita bola prepočítaná cez kalibračnú krivku pripravenú z trombínu z ľudskej plazmy.Coagulation time was measured using a CL4 coagulometer (Behnk Elektronik, Germany). Samples were diluted with 0.025 M CaCL to a theoretical activity of 2.5 IU / ml. . Addition of the sample to human plasma activates the coagulation cascade, resulting in the formation of a precipitate that has been detected by stopping the rotating metal ball in the magnetic field at the bottom of the reaction cuvette. The clotting time is proportional to the amount or activity of thrombin. The resultant activity was recalculated through a calibration curve prepared from human plasma thrombin.

Po perforácií priehradky medzi komorami tuby vzniká viskózny roztok, ktorý po aplikácií alebo krátkom zahriatí napr. v dlani mení štruktúrne a reologické vlastnosti a zastavuje krvácanie. Hodnoty štruktúrnych vlastností a viskozity pri laboratórnej teplote (20 °C) a aplikačnej teplote (32 °C) sú uvedené v Tabuľke 2. Pevnosť, kompresibilita a adhezivita boli merané analyzátorom štruktúry Brookfield CT3 pri teplote 20±l°C s použitím TPA test (dvojitá kompresia), cieľová vzdialenosť 4,0 mm, rýchlosť pohybu sondy 0,5 mm/s. Viskozita bola meraná rotačným viskozimetrom so senzorovým systémom SV2, pri teplote 20±l°C a rýchlostnou gradiente 1 až 20,00 s'¹.After the perforation of the compartment between the tube chambers, a viscous solution is formed which, after application or brief heating, e.g. in the palm it changes the structural and rheological properties and stops the bleeding. The structural properties and viscosity values at room temperature (20 ° C) and application temperature (32 ° C) are shown in Table 2. Strength, compressibility and adhesion were measured with a Brookfield CT3 structure analyzer at 20 ± 1 ° C using a TPA test ( double compression), target distance 4.0 mm, probe movement speed 0.5 mm / s. The viscosity was measured with a rotary viscometer with the SV2 sensor system, at a temperature of 20 ± 1 ° C and a velocity gradient of 1 to 20.00 s ^-1 .

Tabuľka 2 : Štruktúrne a reologické vlastnosti termosensitívneho in-situ gél-tvoriaceho základu na báze blokového kopolyméru etylénoxidu a propylénoxidu (poloxamér) pri laboratórnej a aplikačnej teploteTable 2: Structural and rheological properties of a thermosensitive in-situ gel-forming base based on a block copolymer of ethylene oxide and propylene oxide (poloxamer) at room and application temperatures

Teplota temperature Pevnosť [g] Strength [g] Kompresibilita [mJ] Compressibility [mJ] Adhezivita [mJ] Adhesion [mJ] Viskozita [mPa.s] D = 19,94 s’¹ Viscosity [mPa.s] D = 19.94 sec ^-1 20 + 1 °C 20 ° C 6,7 ± 0.3 6.7 ± 0.3 0,13 ± 0,01 0.13 ± 0.01 0,09 ± 0.02 0.09 ± 0.02 85 ± 11 85 ± 11 32 ± 1 °C 32 ° C ± 1 ° C 70,5 ± 1.7 70.5 ± 1.7 1,22 ± 0,06 1.22 ± 0.06 2,85 ± 0.13 2.85 ± 0.13 9746 ± 628 9746 ± 628

-9In-vivo hodnotenie hemostatického účinku je zhrnuté v obrázkoch 2, 3. Model povrchového krvácania - anestezovaní (2,5% izofluran v zmesi plynom 70% N₂O a 30% O?) potkaní boli premedikovaný heparínom (100 IU) 5 minút pred zákrokom. Termosenzitívny gél bol aplikované priamo na krvácajúcu prepichnutú venu jugularis v koncentráciách 500, 800 a 1000 IU. Čas do dosiahnutia hemostázy (TTH) sa zmeral a vyjadril ako % poklesu TTH oproti kontrole.The in-vivo assessment of hemostatic effect is summarized in Figures 2, 3. Surface bleeding model - anesthetized (2.5% isoflurane in a mixture of 70% N ₂ O and 30% O 2) rats were premedicated with heparin (100 IU) for 5 minutes before the procedure. The thermosensitive gel was applied directly to the bleeding punctured jugular vein at concentrations of 500, 800 and 1000 IU. The time to haemostasis (TTH) was measured and expressed as% decrease in TTH versus control.

Model hĺbkového krvácania - anestezovaní (2,5% izofluran v zmesi plynom 70% N₂O a 30% O₂) potkaní boli premedikovaný heparínom (100 IU) 5 minút pred zákrokom.. Prípravok bol aplikovaný na poškodenú pečeň v koncentráciách 500, 800 a 1000 IU. Sledoval sa čas do zastavenia krvácania. Namerané hodnoty boli porovnané s kontrolou a vyjadrené ako % poklesu voči kontrole - obrázok č. 4.Deep bleeding model - anesthetized (2.5% isoflurane in a mixture of 70% N ₂ O and 30% O ₂ ) rats were premedicated with heparin (100 IU) 5 minutes before surgery. The preparation was applied to the damaged liver at 500, 800 and 1000 IU. The time to stop bleeding was monitored. The measured values were compared to the control and expressed as% decrease relative to the control - FIG. 4th

Biodistribúcia trombínu po topickej aplikácií gél-tvoriacej formulácie sa testovala v modeli poškodenia pečene u potkanov Wistar. Cieľom testovania bolo porovnať množstvo trombínu absorbovaného do plazmy a hepatálneho tkaniva po jeho aplikácií vo forme géltvoriacej formulácie a roztoku. Potkanom, Wistar, samce, bol in situ aplikovaný [¹²⁵I]-rh trombín na poškodený lalok pečene v rôznych formuláciách. Jodácia trombínu sa robila použitím IODO-GEN metódy (Markwell, M.A.K. and Fox, C.F. (1978). Surface - SpecificThrombin biodistribution following topical application of the gel-forming formulation was tested in a liver injury model in Wistar rats. The aim of the testing was to compare the amount of thrombin absorbed into plasma and hepatic tissue after its application in the form of a gel-forming formulation and solution. The rat, Wistar, male, was injected in situ with [ ¹²⁵ I] -rh thrombin on the damaged liver lobe in various formulations. Thrombin iodination was performed using the IODO-GEN method (Markwell, MAK and Fox, CF (1978).

Iodination of Membráne Proteins of Viruses and Eucaryotic Cells Using 1, 3, 4, 6-tetrachloro3a, 6a-diphenylglycouril. Biochem 17: 4807-17). Po otvorení brušnej dutiny chirurgicky v narkóze (2,5% izofluran, 70% oxid dusný a 30% kyslík, inhalačné) sa vystrihlo nožnicami tkanivo (trojuholník ~1 cm ) na hornom laloku pečene. Na miesto poškodenia sa priložila gáza (~1 cm²) nasiaknutá roztokom [¹²⁵I]-rh trombínu pomocou pinzety v dávke: 315 pg bielkovín/zviera, 1025 U/zviera, ~10 pCi/zviera. Hydrogély boli aplikované na poškodené miesto laloka pečene injekčnou striekačkou: termosenzitívny 16 % poloxamér gél pomocou kovovej injekčnej ihly v dávke 157,5 pg bielkovín/zviera, 504 U/zviera, ~5 pCi/zviera a polyakrylátový (karbomér) gél priamo striekačkou v dávke: 155 pg bielkovín/zviera, 500Iodination of Membrane Proteins of Viruses and Eucaryotic Cells Using 1,3,4,6-tetrachloro3a, 6a-diphenylglycouril. Biochem. 17: 4807-17). After opening the abdominal cavity surgically under anesthesia (2.5% isoflurane, 70% nitrous oxide and 30% oxygen, by inhalation), the tissue (triangle ~ 1 cm) was excised by scissors on the upper lobe of the liver. A lesion (~ 1 cm ² ) soaked with [ ¹²⁵ I] -rh thrombin solution with tweezers at a dose of 315 µg protein / animal, 1025 U / animal, ~ 10 pCi / animal was applied to the lesion site. Hydrogels were applied to the damaged lobe of the liver by syringe: thermosensitive 16% poloxamer gel using a metal injection needle at 157.5 µg protein / animal, 504 U / animal, ~ 5 pCi / animal and polyacrylate (carbomer) gel directly by syringe : 155 pg protein / animal, 500

U/zviera, ~ 5 pCi/zviera. Expozícia rôznymi formuláciami trombínu trvala 5 minút. Po tomto čase bola pinzetou odstránená gáza respektíve gély otreté tampónom a brušná dutina bola uzatvorená zošitím. Biologický materiál (krv a tkanivo pečene ~0,5g) boli odobraté v určitých časových intervaloch v dietyléterovej narkóze. Priamo v biologických vzorkách bola meraná rádioaktivita ¹²⁵I na gama automate Wizard 2 (Perkin Elmer, USA). Rádioaktivita 125 [ ' I] bola meraná v cpm a prepočítaná na dpm použitím hodnoty efektívnosti prístroja (dpm = cpm/efektívnosť). Z hodnôt dpm sa vypočítala rádioaktivita v jednotkách Ci (1 pCi = 2,22.106 dpm). Koncentrácia je vyjadrená v percentách celkovej aplikovanej aktivity (AA)U / animal, ~ 5 pCi / animal. Exposure to various thrombin formulations lasted 5 minutes. After this time, the gauze or swabs were removed with tweezers and the abdominal cavity was closed by suturing. The biological material (blood and liver tissue ~ 0.5g) was collected at certain time intervals under diethyl ether anesthesia. Radioactivity of ¹²⁵ L was measured directly in biological samples on Wizard 2 gamma automat (Perkin Elmer, USA). The radioactivity of 125 [mu] L was measured in cpm and converted to dpm using the instrument efficiency value (dpm = cpm / efficiency). Radioactivity in Ci units (1 pCi = 2.22.106 dpm) was calculated from dpm values. Concentration is expressed as a percentage of total applied activity (AA)

-10[^I25I]-rh trombínu na celý orgán alebo na 1 g tkaniva (t.j. afinita) resp. na 1 ml plazmy. Pomer T/P udáva obsah [¹²⁵I]-rh trombínu v príslušnom tkanive (T) prepočítaný priamo z nameranej rádioaktivity v cpm na 1 g tkaniva ku rádioaktivite v 1 ml plazmy (P). Výsledky sú sumarizované na obrázku 8. Na základe získaných výsledkov sa vypočítali farmakokinetické parametre v plazme resp. v tkanivách ako maximálna koncentrácia (C_max), čas pre dosiahnutie maximálnej koncentrácie (T_max) a plochy pod krivkou koncentrácie vyjadrené ako funkcia času (AUCo-t), Pre výpočet farmakokinetických parametrov bola použitá nonkompartmentová analýza a Software KineticaTM TermoFisher Scientific. Výsledky porovnania farmakokinetických parametrov medzi roztokom a inovatívnymi gél-tvoriacimi a gélovými formuláciami sú sumarizované v Tabuľke 3.-10 [ ^I25 I] -rh of thrombin per whole organ or per 1 g of tissue (ie affinity) resp. per ml of plasma. The T / P ratio indicates the [ ¹²⁵ I] -rh of thrombin in the respective tissue (T), calculated directly from the measured radioactivity in cpm per g of tissue to radioactivity in 1 ml of plasma (P). The results are summarized in Figure 8. Based on the results obtained, the pharmacokinetic parameters in plasma and plasma were calculated. in tissues such as maximum concentration (C _max ), time to maximum concentration (T _max ) and area under the concentration curve expressed as a function of time (AUC 0-t). Non-compartmental analysis and KineticaTM TermoFisher Scientific software were used to calculate pharmacokinetic parameters. The results of the comparison of pharmacokinetic parameters between the solution and the innovative gel-forming and gel formulations are summarized in Table 3.

Tabuľka 3 : Základné farmakokinetické parametre testovaných formuláciíTable 3: Basic pharmacokinetic parameters of the formulations tested

Parameter parameter Formulácia [ ¹²⁵I]- rh trombínu[ ¹²⁵ I] - rh thrombin formulation Roztok solution Poloxamér gél (Príklad 1) Poloxamer gel (Example 1) Polyakrylát gél (príklad 3) Polyacrylate gel (Example 3) Cmax (%AA/ml) Cmax (% AA / mL) 0,0833 0.0833 0,0742 0.0742 0,0777 0.0777 T_max (h)T _m ax (h) 2 2 2 2 2 2 AUCq-24 (%AA.h/ml) AUCq-24 (% AA.h / ml) 1,0136 1.0136 0,7699 .7699 0,6198 .6198

Príklad 2: Rekombinantný ľudský trombín a gél-tvoriaci základ na báze alginátuExample 2: Recombinant human thrombin and gel-forming alginate base

a) Zloženie(a) Composition

Komora 1: rh trombínChamber 1: rh thrombin

Prísada additive Množstvo na 1 ml roztoku Quantity per ml of solution Množstvo na 1 tubu Quantity per tube rh trombín rh thrombin 0,3 mg 0.3 mg 0,9 mg 0,9 mg Manitol mannitol 0,05 g 0.05 g 0,15 g 0.15 g Polyvinylpyrolidón polyvinylpyrrolidone 0,03 g 0,03 g 0,09 g 0.09 g Kyselina jantárová Succinic acid 0,00295 g 0.00295 g 0,0089 g 0.0089 g Chlorid sodný Sodium chloride 0,009 g 0.009 g 0,0270 g 0,0270 g Chlorid vápenatý dihydrát Calcium chloride dihydrate 0,00245 g 0.00245 g 0,0074 g 0.0074 g Hydroxid sodný Sodium hydroxide do pH 6,2 to pH 6.2 do pH 6,2 to pH 6.2 Voda na injekcie Water for injections do 1 ml to 1 ml do 1 ml to 1 ml

- 11Komora 2: Gél-tvoriaci základ- 11Chamber 2: Gel-forming base

Prísada additive Množstvo na 1 g roztoku Amount per 1 g of solution Množstvo na 1 tubu Quantity per tube Alginát sodný - nízka viskozita Sodium alginate - low viscosity 0,02 g 0,02 g 0,06 g 0,06 g Kyselina jantárová Succinic acid 0,00248 g 0.00248 g 0,00744 g 0.00744 g Chlorid sodný Sodium chloride 0,0076 g 0.0076 g 0,0228 g 0.0228 g Hydroxid sodný Sodium hydroxide do pH 6,2 to pH 6.2 Do pH 6,2 Up to pH 6.2 Voda na injekcie Water for injections .Pol g .Pol g ^Do3g ^Do3 g

b) Postup prípravy:(b) Preparation procedure:

Príprava lyofilizátu do komory 1: Vo vode na injekcie sa rozpustí kyselina jantárová, chlorid sodný a pH sa upraví na 6,2 s použitím roztoku 1 M NaOH. V roztoku sa rozpustí polyvinylpyrolidón, manitol, chlorid vápenatý, skontroluje sa pH (6,1 až 6,3) a v prípade potreby sa upraví roztokom IM NaOH/HCl. Rozpustí sa trombín a doplní sa do požadovaného objemu. Roztok sa v čistých priestoroch prefiltruje cez 0,2 pm membránový filter. Pripravený roztok sa lyofilizuje na táckach pri teplote -25 °C/O,1 mbar (primárne sušenie) a +30 °C /0,01 mbar (sekundárne sušenie) do konečného obsahu vlhkosti menej ako 2 %. Získaný prášok sa aseptický plní po 270 až 330 mg do plastových túb. Stabilné dáta lyofilizovaného prášku z príkladu 2 sú uvedené v Tabuľke 4. Na hodnotenie sa použili analytické metódy popísané v príklade 1.Preparation of lyophilisate in chamber 1: Succinic acid, sodium chloride are dissolved in water for injection and the pH is adjusted to 6.2 using 1M NaOH solution. Dissolve polyvinylpyrrolidone, mannitol, calcium chloride in the solution, check the pH (6.1 to 6.3) and adjust if necessary with 1M NaOH / HCl solution. Thrombin is dissolved and made up to the required volume. The solution is filtered through a 0.2 µm membrane filter in clean rooms. The prepared solution is lyophilized on trays at -25 ° C / 0.1 mbar (primary drying) and +30 ° C / 0.01 mbar (secondary drying) to a final moisture content of less than 2%. The powder obtained is aseptically filled at 270 to 330 mg in plastic tubes. Stable data of the lyophilized powder of Example 2 are shown in Table 4. The analytical methods described in Example 1 were used for evaluation.

Príprava náplne do komory 2: Vo vode na injekcie sa rozpustí kyselina jantárová, chlorid sodný a pH sa upraví s použitím roztoku 1 M NaOH. Do takto pripraveného roztoku sa pridá alginát sodný, zmes sa mieša s použitím mechanického miešadla pri 75 ± 5 °C do úplného rozpustenia. pH sa skontroluje a v prípade potreby upraví roztokom IM NaOH/HCl na 6,0 až 6,5. Roztok sa filtruje cez 0,2 pm membránový filter a aseptický plní do druhej komory plastovej tuby.Preparation of Chamber Fill 2: Succinic acid, sodium chloride are dissolved in water for injection and the pH is adjusted using 1M NaOH solution. Sodium alginate is added to the thus prepared solution, the mixture is stirred using a mechanical stirrer at 75 ± 5 ° C until complete dissolution. The pH is checked and adjusted to 6.0-6.5 with 1M NaOH / HCl solution if necessary. The solution is filtered through a 0.2 µm membrane filter and aseptically filled into a second chamber of the plastic tube.

Po perforácií priehradky medzi komorami tuby dochádza vplyvom Ca²⁺ iónov k výraznej zmene Teologických a štruktúrnych vlastností roztoku alginátu, vzniká gél vhodný na priamu aplikáciu na rany. Hodnoty štruktúrnych vlastností a viskozity roztoku alginátu bez a s obsahom vápenatých iónov sú uvedené v Tabuľke 5. Pevnosť, kompresibilita, adhezivita a viskozita boli merané analyzátorom štruktúry resp. rotačným viskozimetrom.After the perforation of the septum between the tube chambers, the theological and structural properties of the alginate solution change significantly under the influence of Ca ²⁺ ions, resulting in a gel suitable for direct application to wounds. The values of the structural properties and viscosity of the alginate solution without and containing calcium ions are shown in Table 5. Strength, compressibility, adhesion and viscosity were measured with a structure analyzer or a viscosity analyzer. rotary viscometer.

-12Tabuľka 4: Stabilita rh trombínu v lyofilizovanom stave (príklad 2)Table 12: Stability of rh thrombin in lyophilized state (Example 2)

Parameter parameter Vstup entry Po 1 mesiaci (40 °C/75 % R.H.) After 1 month (40 ° C / 75% RH) Po 2 mesiacoch (25 °C/60 % R.H.) Mon 2 months (25 ° C / 60% RH) Po 2 mesiacoch (40 °C/75 % R.H.) Mon 2 months (40 ° C / 75% RH) Po 3 mesiacoch (25 °C/60 % R.H.) Mon 3 months (25 ° C / 60% RH) Po 3 mesiacoch (40 C/75 % R.H.) Mon 3 months (40 C / 75% R.H.) Špecifická aktivita flU/ml) Specific activity (flU / ml) 1004 1004 874 874 830 830 894 894 947 947 795 795 Koagulačná aktivita [IU/ml] Coagulation activity [IU / ml] 1140 1140 1088 1088 1118 1118 1042 1042 928 928 909 909 Obsah trombínu fmg/mll Thrombin content fmg / ml 0,31 0.31 0,30 0.30 0,30 0.30 0,32 0.32 0,32 0.32 0,32 0.32 Čistota [%] Purity [%] 92,7 92.7 95,2 95.2 95,7 95.7 95,7 95.7 89,3 89.3 91,7 91.7 pH pH 6,08 6.08 6,15 6.15 6,10 6.10 6,09 6.09 6,16 6.16 6,15 6.15 Vzhľad appearance Homogénny, biely prášok Homogeneous, white powder Homogénny, biely prášok Homogeneous, white powder Homogénny, biely prášok Homogeneous, white powder Homogénny, biely prášok Homogeneous, white powder Homogénny, biely prášok Homogeneous, white powder Homogénny, biely prášok Homogeneous, white powder

Tabuľka 5: Štruktúrne a reologické vlastnosti gél-tvoriacich roztokov na báze polysacharidovTable 5: Structural and rheological properties of gel-forming solutions based on polysaccharides

Formulácia statement Pevnosť[g] Strength [g] Kompresibilita [mJ] Compressibility [mJ] Adhezivita [mJ] Adhesion [mJ] Viskozita [mPa.s] D = 19,94 s'¹ Viscosity [mPa.s] D = 19.94 sec ^-1 Alginát sodný s nízkou viskozitou 2 % w/w, bez Ca²⁺ Sodium alginate with low viscosity 2% w / w, without Ca ²⁺ 5,5 ± 0,0 5.5 ± 0.0 0,11 ±0,00 0.11 ± 0.00 0,13 ± 0,01 0.13 ± 0.01 198 ±22 198 ± 22 Alginát sodný s veľmi nízkou viskozitou 3 % w/w, bez Ca²⁺ Sodium alginate with very low viscosity 3% w / w, without Ca ²⁺ 5,8 ± 0,1 5.8 ± 0.1 0,11 ±0,01 0.11 ± 0.01 0,12 ± 0,01 0.12 ± 0.01 54 ±39 54 ± 39 Alginát sodný s nízkou viskozitou 2 % w/w, 0,02 M CaCl₂ Sodium alginate with low viscosity 2% w / w, 0.02 M CaCl ₂ 12,0 ± 0,4 12.0 ± 0.4 0,29 ± 0,02 0.29 ± 0.02 0,53 ± 0,06 0.53 ± 0.06 2533 ± 39 2533 ± 39 Alginát sodný s veľmi nízkou viskozitou 3 % w/w, 0,04 M CaCl₂ Sodium alginate with very low viscosity 3% w / w, 0.04 M CaCl ₂ 12,4 ± 0,4 12.4 ± 0.4 0,29 ± 0,01 0.29 ± 0.01 0,45 ± 0,02 0.45 ± 0.02 1453 ± 28 1453 ± 28

Príklad 3: Rekombinantný ľudský trombín a gélový základ na báze polyakrylátuExample 3: Recombinant human thrombin and polyacrylate-based gel basis

a) Zloženie(a) Composition

Komora 1: rh trombínChamber 1: rh thrombin

Komora 2: Gélový základChamber 2: Gel base

Prísada additive Množstvo na 1 g roztoku Amount per 1 g of solution Množstvo na 1 tubu Quantity per tube Karbopol® 980 Karbopol® 980 0,015 g 0.015 g 0,045 g 0.045 g Kyselina jantárová Succinic acid 0,00248 g 0.00248 g 0,00744 g 0.00744 g Chlorid sodný Sodium chloride 0,0076 g 0.0076 g 0,0228 g 0.0228 g Hydroxid sodný Sodium hydroxide do pH 6.2 to pH 6.2 do pH 6.2 to pH 6.2 Voda na injekcie Water for injections Jq 1 g Jq 1 g do 3 g up to 3 g

b) Postup prípravy:(b) Preparation procedure:

Príprava lyofilizátu do komory 1: Vo vode na injekcie sa rozpustí kyselina jantárová, chlorid sodný a pH sa upraví na 6,2 s použitím roztoku 1 M NaOH. V roztoku sa rozpustí polyvinylpyrolidón, glycín, skontroluje sa pH (6,1 až 6,3), v prípade potreby sa upraví roztokom IM NaOH/HCl. Nakoniec sa rozpustí trombín a doplní sa do požadovaného objemu. Roztok sa v čistých priestoroch prefiltruje cez 0,2 pm membránový filter. Pripravený roztok sa lyofilizuje na táckach pri teplote -25 °C/O,1 mbar (primáme sušenie) a +30 °C /0,01 mbar (sekundárne sušenie) do konečného obsahu vlhkosti menej ako 2 %. Získaný prášok sa aseptický plní po 270 až 330 mg do plastových túb.Preparation of lyophilisate in chamber 1: Succinic acid, sodium chloride are dissolved in water for injection and the pH is adjusted to 6.2 using 1M NaOH solution. Dissolve the polyvinylpyrrolidone, glycine in the solution, check the pH (6.1 to 6.3), adjust if necessary with 1M NaOH / HCl solution. Finally, thrombin is dissolved and made up to the desired volume. The solution is filtered through a 0.2 µm membrane filter in clean rooms. The prepared solution is lyophilized on trays at -25 ° C / 0.1 mbar (primary drying) and +30 ° C / 0.01 mbar (secondary drying) to a final moisture content of less than 2%. The powder obtained is aseptically filled at 270 to 330 mg in plastic tubes.

Príprava náplne do komory 2: Vo vode na injekcie sa rozpustí kyselina jantárová, chlorid sodný a pH sa upraví na 6,2. Do takto pripraveného roztoku sa pridá Carbopol® 980 a mieša sa do rozpustenia. Za sústavného miešania sa neutralizuje disperzia roztokom 1 M NaOH na pH 6,2 do vzniku gélu. Gél sa autoklávuje v sklenenej nádobe pri 121 °C/15 minút. Následne sa aspeticky plní do druhej komory plastovej tuby.Preparation of the cartridge for chamber 2: Succinic acid, sodium chloride are dissolved in water for injection and the pH is adjusted to 6.2. To the solution thus prepared, Carbopol® 980 is added and mixed until dissolved. With continuous stirring, the dispersion is neutralized with 1M NaOH solution to pH 6.2 to form a gel. The gel is autoclaved in a glass jar at 121 ° C / 15 minutes. Subsequently, it is aspetically filled into the second chamber of the plastic tube.

In-vivo hodnotenie hemostatického účinku je zhrnuté na obrázku 4. Hemostatický účinok polakrylátového gélu bol hodnotení s použitím modelu povrchového krvácania anestezovaní (2.5% izofluran v zmesi plynom 70% N2O a 30% O2) potkaní boli premedikovaný heparínom (100 IU) 5 minút pred zákrokom. Gél bol aplikovaný priamo na krvácajúcu prepichnutú vena jugularis v koncentráciách 500, 800 a 1000 IU. Čas do dosiahnutia hemostázy (TTH) sa zmeral a vyjadril ako % poklesu TTH oproti kontrole.The in-vivo assessment of haemostatic effect is summarized in Figure 4. The hemostatic effect of the acrylic gel was evaluated using a superficial bleeding model and anesthetized (2.5% isoflurane in a mixture of 70% N2O and 30% O2) rats premedicated with heparin (100 IU) 5 minutes before surgery. The gel was applied directly to bleeding punctured jugular veins at concentrations of 500, 800 and 1000 IU. The time to haemostasis (TTH) was measured and expressed as% decrease in TTH versus control.

Biodistribúcia trombínu po topickej aplikácii hydrogélovej formulácie na báze polyakrylátu sa testovala rovnakým spôsobom ako je opísané v príklade 1. Výsledky sú sumarizované v Tabuľke 3 a obrázkuThrombin biodistribution after topical application of a polyacrylate-based hydrogel formulation was tested in the same manner as described in Example 1. The results are summarized in Table 3 and Figure

-14Príklad 4: Rekombinantný ľudský trombín a gélový základ na báze metylcelulózyExample 4: Recombinant human thrombin and methylcellulose-based gel basis

a) Zloženie(a) Composition

Komora 1: rh trombínChamber 1: rh thrombin

Prísada additive Množstvo na 1 ml roztoku Quantity per ml of solution Množstvo na 1 tubu Quantity per tube rh trombín rh thrombin 0,1 mg (330 IU) 0.1 mg (330 IU) 0,3 mg (1000 IU) 0.3 mg (1000 IU) Glycín glycine 0,05 g 0.05 g 0,15 g 0.15 g Polyvinylpyrolidón (Kollidon® 17 PF s Mw 700011000) Polyvinylpyrrolidone (Kollidon® 17 PF with Mw 700011000) 0,03 g 0,03 g 0,09 g 0.09 g Kyselina jantárová Succinic acid 0,00295 g 0.00295 g 0,0089 g 0.0089 g Chlorid sodný Sodium chloride 0,009 g 0.009 g 0,0270 g 0,0270 g Hydroxid sodný Sodium hydroxide do pH 6,2 to pH 6.2 do pH 6,2 to pH 6.2 Voda na injekcie Water for injections do 1 ml to 1 ml do 3 ml to 3 ml

Komora 2: Gélový základChamber 2: Gel base

Prísada additive Množstvo na 1 g gélu Quantity per 1 g of gel Množstvo na 1 tubu Quantity per tube Metylcelulóza methylcellulose 0,03 g 0,03 g 0,09 g 0.09 g Kyselina jantárová Succinic acid 0,00248 g 0.00248 g 0,00744 g 0.00744 g Chlorid sodný Sodium chloride 0,0076 g 0.0076 g 0,0228 g 0.0228 g Hydroxid sodný Sodium hydroxide do pH 6,2 to pH 6.2 do pH 6,2 to pH 6.2 Voda na injekcie Water for injections -dol g -dol g dp.3 g dp.3 g

b) Postup prípravy:(b) Preparation procedure:

Príprava lyofilizátu do komory 1: Vo vode na injekcie sa rozpustí kyselina jantárová, chlorid sodný a pH sa upraví na 6,2 s použitím roztoku 1 M NaOH. V roztoku rozpustíme polyvinylpyrolidón, glycín, skontrolujeme pH (6,1 až 6,3), v prípade potreby sa upraví roztokom IM NaOH/HCl. Nakoniec sa rozpustí trombín a doplní sa do požadovaného objemu. Roztok sa v čistých priestoroch prefiltruje cez 0,2 pm membránový filter. Pripravený roztok sa lyofilizuje na táckach pri teplote -25 °C/0,l mbar (primáme sušenie) a +30 °C /0,01 mbar (sekundárne sušenie) do konečného obsahu vlhkosti menej ako 2 %. Získaný prášok sa aseptický plní po 270 až 330 mg do plastových túb.Preparation of lyophilisate in chamber 1: Succinic acid, sodium chloride are dissolved in water for injection and the pH is adjusted to 6.2 using 1M NaOH solution. Dissolve polyvinylpyrrolidone, glycine in the solution, check pH (6.1 to 6.3), adjust if necessary with 1M NaOH / HCl solution. Finally, thrombin is dissolved and made up to the desired volume. The solution is filtered through a 0.2 µm membrane filter in clean rooms. The prepared solution is lyophilized on trays at -25 ° C / 0.1 mbar (primary drying) and +30 ° C / 0.01 mbar (secondary drying) to a final moisture content of less than 2%. The powder obtained is aseptically filled at 270 to 330 mg in plastic tubes.

Príprava náplne do komory 2: Vo vode na injekcie sa rozpustí kyselina jantárová, chlorid sodný a pH sa upraví na 6,2. Do takto pripraveného roztoku zahriateho na 80 °C sa pridá metylcelulóza a pomaly sa mieša do vychladnutia. Gél sa autoklávuje v sklenenej nádobe pri 121 °C/15 minút. Následne sa aspeticky plní do druhej komory plastovej tuby.Preparation of the cartridge for chamber 2: Succinic acid, sodium chloride are dissolved in water for injection and the pH is adjusted to 6.2. To the thus prepared solution heated to 80 ° C, methylcellulose is added and stirred slowly to cool. The gel is autoclaved in a glass jar at 121 ° C / 15 minutes. Subsequently, it is aspetically filled into the second chamber of the plastic tube.

Hodnota špecifickej aktivity trombínu po premiešaní s gélovým základom na báze metylcelulózy je uvedená na Obrázku 1.The specific activity value of thrombin after mixing with the methyl cellulose gel base is shown in Figure 1.

-15Príklad 5: Ľudský trombín a gélový základ na báze hydroxypropylmetyl celulózyExample 5: Human thrombin and a hydroxypropylmethyl cellulose gel base

a) Zloženie(a) Composition

Komora 1: TrombínChamber 1: Thrombin

Prísada additive Množstvo na 1 ml roztoku Quantity per ml of solution Množstvo na 1 tubu Quantity per tube Ľudský trombín Human thrombin 1 mg (3300IU) 1mg (3300IU) 3 mg (10000 IU) 3 mg (10000 IU) Mannitol mannitol 0,05 g 0.05 g 045 g 045 g Polyvinylpyrolidón (Kollidon® 12 PF s Mw 20003000) Polyvinylpyrrolidone (Kollidon® 12 PF with Mw 20003000) 0,03 g 0,03 g 0,09 g 0.09 g Kyselina jantárová Succinic acid 0,00295 g 0.00295 g 0,0089 g 0.0089 g Chlorid sodný Sodium chloride 0,009 g 0.009 g 0,0270 g 0,0270 g Hydroxid sodný Sodium hydroxide do pH 6,2 to pH 6.2 do pH 6,2 to pH 6.2 Voda na injekcie Water for injections do 1 ml to 1 ml do 3 ml to 3 ml

Komora 2: Gélový základChamber 2: Gel base

Prísada additive Množstvo na 1 g gélu Quantity per 1 g of gel Množstvo na 1 tubu Quantity per tube Hydroxypropyl metyl celulóza Hydroxypropyl methyl cellulose 0,02 g 0,02 g 0,04 g 0,04 g Kyselina jantárová Succinic acid 0,00248 g 0.00248 g 0,00744 g 0.00744 g Chlorid sodný Sodium chloride 0,0076 g 0.0076 g 0,0228 g 0.0228 g Hydroxid sodný Sodium hydroxide do pH 6,2 to pH 6.2 do pH 6,2 to pH 6.2 Voda na injekcie Water for injections do 1 g up to 1 g do 3 g up to 3 g

b) Postup prípravy:(b) Preparation procedure:

Príprava lyofilizátu do komory 1: Vo vode na injekcie sa rozpustí kyselina jantárová, chlorid sodný a pH sa upraví na 6,2 s použitím roztoku 1 M NaOH. V zmesi sa rozpustí polyvinylpyrolidón, manitol, skontroluje sa pH (6,1 až 6,3), v prípade potreby sa upraví roztokom IM NaOH/HCl. Nakoniec sa rozpustí trombín a doplní sa do požadovaného objemu. Roztok sa v čistých priestoroch prefiltruje cez 0,2 pm membránový filter. Pripravený roztok sa lyofilizuje na táckach pri teplote -25 °C/0,l mbar (primáme sušenie) a +30 °C /0,01 mbar (sekundárne sušenie) do konečného obsahu vlhkosti menej ako 2 %. Získaný prášok sa aseptický plní po 270 až 330 mg do plastových túb.Preparation of lyophilisate in chamber 1: Succinic acid, sodium chloride are dissolved in water for injection and the pH is adjusted to 6.2 using 1M NaOH solution. Dissolve the polyvinylpyrrolidone, mannitol in the mixture, check the pH (6.1-6.3), adjust if necessary with 1M NaOH / HCl solution. Finally, thrombin is dissolved and made up to the desired volume. The solution is filtered through a 0.2 µm membrane filter in clean rooms. The prepared solution is lyophilized on trays at -25 ° C / 0.1 mbar (primary drying) and +30 ° C / 0.01 mbar (secondary drying) to a final moisture content of less than 2%. The powder obtained is aseptically filled at 270 to 330 mg in plastic tubes.

Príprava náplne do komory 2: Vo vode na injekcie sa rozpustí kyselina jantárová, chlorid sodný a pH sa upraví na 6,2. Do takto pripraveného roztoku zahriateho na 80 °C sa pridá hydroxypropylmetylcelulóza a pomaly sa mieša do vychladnutia. Gél sa autoklávuje v sklenenej nádobe pri 121 °C/15 minút. Následne sa aseptický plní do druhej komory plastovej tuby.Preparation of the cartridge for chamber 2: Succinic acid, sodium chloride are dissolved in water for injection and the pH is adjusted to 6.2. To the thus prepared solution heated to 80 ° C, hydroxypropylmethylcellulose is added and stirred slowly to cool. The gel is autoclaved in a glass jar at 121 ° C / 15 minutes. Subsequently, it is aseptically filled into the second chamber of the plastic tube.

Hodnota špecifickej aktivity trombínu po premiešaní s gélovým základom na báze hydroxypropylmetyl celulózy je uvedená na Obrázku 1.The specific activity value of thrombin after mixing with the hydroxypropylmethyl cellulose gel base is shown in Figure 1.

-16Priemyselná využiteľnosť-16Industrial utility

Vynález je priemyselne využiteľný pri výrobe aktívnych hemostatík s obsahom trombínuThe invention is industrially applicable in the manufacture of active thrombin-containing hemostatics

Claims

A bicameral formulation having a hemostatic effect, characterized in that it comprises lyophilized thrombin and excipients in the first chamber and contains gel or gel-forming bases in the second chamber.

A bicameral formulation according to claim 1 wherein the lyophilized thrombin is of human or bovine origin, i. isolated from human or bovine plasma, or recombinant i.e. prepared by recombinant DNA techniques at a concentration of 500-10000 IU / 300 mg lyophilisate, preferably 2000-4000 IU / 300 mg lyophilisate.

A bicameral preparation according to claims 1 and 2, characterized in that the stabilizers comprise inorganic salts sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, potassium bromide, preferably sodium chloride in a concentration of 50 -500 mM, preferably 100-200 mM.

A bicameral formulation according to claims 1 to 3, characterized in that it contains soluble polyvinylpyrrolidone with an average molecular weight of 2000 - 1500 000, preferably 2000 - 54 000, most preferably 2000 - 11000 in a concentration of 1-10% w / v, more preferably 2 -5% m / v.

A bicameral formulation according to claims 1 to 4, characterized in that it contains crystallizing excipients such as mannitol, lysine and / or glycine at a concentration of 5-15% w / v, preferably 4-7% w / v.

A bicameral formulation according to claims 1 to 5, characterized in that it contains calcium chloride or calcium carbonate in a concentration of 0.002-0.2 mM, preferably 0.005-0.05 mM calcium chloride.

A bicameral preparation according to claims 1 to 6, characterized in that in the second chamber it contains sterilizable gel based on natural polymers (sodium alginate, iota alambda carrageenan, xanthan gum, traganth, agar, pectin, guar gum, gellan gum), semisynthetic polymers (sodium salt of carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose) or synthetic polymers (carbomer, polycarbophil, poly (methyl vinyl ether / maleic anhydride) decadiene crospolymer) in a concentration of 0.1 - 10 wt. %, preferably 1-3 wt. % and a physiologically acceptable buffer system at a pH of 5-8, preferably 6-7, and an inorganic salt at a concentration of 50-500 mM, preferably 100-200 mM.

A bicameral formulation according to claims 1 to 6, characterized in that it comprises a solution containing a thermosensitive poloxamer polymer in the second chamber.

-18 at a concentration of 12-22 wt. %, preferably 15-18 wt. %, a hydrophilic solvent such as water, or a physiologically acceptable buffer system at a pH of 5-8, preferably 6-7, and an inorganic salt at a concentration of 50-500 mM, preferably 100-200 mM.

A bicameral preparation according to claims 1 to 6, characterized in that in the second chamber it contains a solution of polysaccharides e.g. % pectin and / or sodium alginate at a concentration of 0.1 to 5 wt. %, preferably 0.5 to 3%, of a hydrophilic solvent such as water, or a physiologically acceptable buffer system at a pH of 5-8, preferably 6-7, and an inorganic salt at a concentration of 50-500 mM, preferably 100-200 mM.