SK282685B6

SK282685B6 - Formulation of stabilised cationic transfection agent(s)/nucleic acid particles

Info

Publication number: SK282685B6
Application number: SK1082-99A
Authority: SK
Inventors: Joel Crouzet; Bruno Pitard
Original assignee: Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Priority date: 1997-02-10
Filing date: 1998-02-06
Publication date: 2002-11-06
Also published as: AU737720B2; ZA981034B; NO993825D0; KR20000070914A; DE69802102T2; IL130765A0; CA2278665A1; HUP0001720A1; ES2166146T3; AU6298798A; CZ282199A3; SK108299A3; JP2001511171A; GR3036919T3; DK1007097T3; FR2759298A1; ATE206932T1; HUP0001720A3; BR9807563A; DE69802102D1

Abstract

The invention concerns a composition containing stabilised particles of cationic transfection agent(s)/nucleic acid complexes characterised in that it includes besides said transfection agent and nucleic acid at least a non-ionic surfactant in sufficient amount for preventing the aggregation of the particles in course of time. In a preferred embodiment, the surfactant is a polyoxyalkylene or a derivative thereof.

Description

Oblasť technikyTechnical field

Vynález sa týka kombinácií tvorených transfekčným činidlom alebo činidlami a DNA, ktorých veľkosť častíc je stabilizovaná pomocou neionogénneho povrchovo aktívneho činidla, a použitia týchto kombinácií v génovej terapii.The invention relates to combinations of transfection agent (s) and DNA whose particle size is stabilized by a non-ionic surfactant, and the use of these combinations in gene therapy.

Doterajší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Mnohé genetické ochorenia sú spôsobené chybnou expresiou a/alebo abnormálnou expresiou, t. j. nedostatočnou alebo nadmernou expresiou jednej alebo niekoľkých nukleových kyselín. Základnou úlohou génovej terapie je napraviť tento typ genetickej abnormality in vivo alebo in vitro expresiou klonovaných génov v bunke.Many genetic diseases are caused by erroneous expression and / or abnormal expression, i. j. insufficient or overexpression of one or more nucleic acids. The basic role of gene therapy is to remedy this type of genetic abnormality by in vivo or in vitro expression of cloned genes in the cell.

V súčasnosti je navrhnutých niekoľko spôsobov na vnútrobunkové dodanie uvedeného typu genetickej informácie. Jedným z týchto spôsobov je spôsob založený na použití chemických alebo biologických vektorov. Syntetické vektory majú dve hlavné funkcie: uvedenie do komplexu DNA, ktorá sa má transfckovať a podporenie jej prichytenia v bunke, ako aj jej prechod cez plazmatickú membránu a prípadne cez obidve jadrové membrány. Z vyvinutých syntetických vektorov sú najvýhodnejšie katiónové polyméry polylyzínového typu a DEAE-dextránu, alebo alternatívne lipofekčného činidla.Several methods are currently proposed for intracellular delivery of said type of genetic information. One such method is a method based on the use of chemical or biological vectors. Synthetic vectors have two main functions: introducing into the DNA complex to be transfected and promoting its attachment in the cell, as well as its passage through the plasma membrane and possibly both nuclear membranes. Among the synthetic vectors developed, the most preferred are cationic polymers of polylysine type and DEAE-dextran, or alternatively a lipofection agent.

Pri uvedenom type transfekcie sa podstatný pokrok dosiahol vyvinutím technológie založenej na použití katiónových transfekčných činidiel typu lipofekčných činidiel a presnejšie katiónových lipidov. Takto sa dokázalo, že pozitívne nabitý katiónový lipid, ktorým je N-[l-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimetylamóniumchlorid (DOTMA), spontánne interferuje vo forme lipozómov alebo malých mechúrikov s DNA, ktorá je nabitá negatívne za vzniku komplexov lipid/DNA, ktoré sú schopné sa spojiť s bunkovými membránami a takto umožniť dodanie DNA do vnútra bunky.In this type of transfection, substantial progress has been made by developing technology based on the use of cationic transfection agents such as lipofection agents and, more specifically, cationic lipids. Thus, it has been shown that the positively charged cationic lipid, N- [1- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA), spontaneously interferes in the form of liposomes or small bladders with DNA which it is negatively charged to form lipid / DNA complexes that are able to associate with cell membranes and thereby allow the delivery of DNA to the interior of the cell.

Na základe uvedenej štruktúry sa neskoršie okrem produktu DOTMA vyvinuli aj ďalšie katiónové lipidy, obsahujúce lipofilnú skupinu kombinovanú s aminoskupinou cez dištančné rameno („spacer”). Ako príklady takýchto štruktúr sa môžu konkrétne uviesť štruktúry' obsahujúce ako lipofilnú skupinu dve mastné kyseliny alebo cholesterolový derivát a obsahujúce okrem toho v prípade, keď je to potrebné, ako aminoskupinu kvartérnu amóniovú skupinu. Ako zástupcovia tejto kategórie katiónových lipidov sa môžu konkrétne uviesť DOTAP, DOBT a ChOTB. Ďalšie zlúčeniny, ako napríklad DOSC a ChOSC, sú charakteristické prítomnosťou cholínovej skupiny namiesto kvartémej amóniovej skupiny.Due to this structure, in addition to DOTMA, other cationic lipids were developed later, containing a lipophilic group combined with an amino group via a spacer arm. Examples of such structures include, in particular, structures containing as the lipophilic group two fatty acids or a cholesterol derivative and, in addition, if necessary, as an amino group, a quaternary ammonium group. Representatives of this cationic lipid category include, in particular, DOTAP, DOBT and ChOTB. Other compounds, such as DOSC and ChOSC, are characterized by the presence of a choline group instead of a quaternary ammonium group.

Rovnako bola opísaná ďalšia skupina lipofekčných činidiel, ktorá zahrnuje lipopolyamíny. Všeobecne ide o amfifilnú molekulu obsahujúcu aspoň jednu hydrofilnú polyamínovú oblasť, ktorá je kombinovaná prostredníctvom tzv. dištančnej oblasti (spacer) s lipofilnou oblasťou. Polyamínová oblasť lipopolyamínov, ktorá je katiónovo nabitá, je schopná reverzibilnej kombinácie s nukleovou kyselinou, ktorá je nabitá negatívne. Táto interakcia výrazne skompaktňuje nukleovú kyselinu. Lipofilná oblasť robí túto iónovú interakciu necitlivú proti vnútornému prostrediu obalením vytvorenej nukleolipidovej častice lipidovým filmom. V tomto type zlúčenín môže katiónovú skupinu predstavovať L-5-karboxyspermínový radikál, ktorý obsahuje štyri amóniové skupiny, z ktorých dve sú primáme amóniové skupiny a dve zvyšné sú sekundárne amóniové skupiny. K týmto zlúčeninám patria DOGS a DPPES. Tieto li popolyamíny sú najúčinnejšie na transfekciu primárnych endokrinných buniek.Another class of lipofectants, including lipopolyamines, has also been described. Generally, it is an amphiphilic molecule comprising at least one hydrophilic polyamine region, which is combined via a so-called " spacer (lipophilic) spacer region. The polyamine region of the lipopolyamines, which is cationically charged, is capable of reversibly combining with a nucleic acid that is negatively charged. This interaction significantly compacts the nucleic acid. The lipophilic region makes this ionic interaction insensitive to the internal environment by encapsulating the formed nucleolipid particle with a lipid film. In this type of compounds, the cationic group may be an L-5-carboxyspermine radical containing four ammonium groups, two of which are primary ammonium groups and the other two are secondary ammonium groups. These compounds include DOGS and DPPES. These li-polyamines are most effective in transfecting primary endocrine cells.

Ako príklady zlúčenín patriacich k tejto naposledy uvedenej skupine sa môžu konkrétne uviesť lipopolyamíny opísané v patentových prihláškach WO96/17823 a WO97/18185.Examples of compounds belonging to this latter group include, in particular, the lipopolyamines described in patent applications WO96 / 17823 and WO97 / 18185.

Napriek tomu je nutné zlepšiť kvalitu týchto syntetických vektorov, a to najmä pokiaľ ide o tvorbu komplexu s nukleovou kyselinou a stabilitu častíc uvedených nukleolipidových komplexov. V skutočnosti pri použití konvenčných formulácií tvorených nukleovou kyselinou a katiónovým transfekčným činidlom, sa môže pozorovať častá a rýchla tvorba agregátov častíc nukleolipidového komplexu. Vznikajúce agregáty majú potom veľkosť, ktorá je len ťažko zlučiteľná s terapeutickou transfekciou. Jedno z riešení, ktoré boli až doteraz navrhnuté, aby sa eliminoval uvedený agrcgačný jav, spočíva v tom, že sa do formulácie vnesie katiónové transfekčné činidlo, ako je napríklad lipofekčné činidlo v nadbytku, t. j. v nábojovom pomere lipofekčné činidlo/nukleová kyselina asi 10 alebo ešte vyššom. Okrem skutočnosti, že takéto riešenie nie je vždy účinné, nie je toto riešenie úplne uspokojivé z hľadiska bezpečnosti. Katiónové transfekčné činidlá, akými sú lipofekčné činidlá a katiónové polyméry, sú totiž samy osebe zlúčeniny, pri ktorých je v prípade ich použitia vo veľkom množstve riziko, že budú relatívne toxické pre bunky, do ktorých sa tieto zlúčeniny inkorporujú.Nevertheless, it is necessary to improve the quality of these synthetic vectors, particularly with respect to nucleic acid complexing and particle stability of said nucleolipid complexes. In fact, using conventional nucleic acid and cationic transfection reagent formulations, frequent and rapid formation of aggregates of nucleolipid complex particles can be observed. The resulting aggregates are then of a size that is difficult to reconcile with therapeutic transfection. One solution proposed hitherto to eliminate this agglomeration phenomenon is to introduce a cationic transfection agent such as an excess lipofection agent into the formulation, e.g. j. in a lipofectant / nucleic acid charge ratio of about 10 or more. Apart from the fact that such a solution is not always effective, it is not entirely satisfactory in terms of safety. Indeed, cationic transfection agents such as lipofectants and cationic polymers are in themselves compounds which, when used in large quantities, are at risk of being relatively toxic to the cells into which they are incorporated.

Bolo by preto veľmi výhodné mať z terapeutického hľadiska k dispozícii formulácie na báze katiónového transfekčného činidla a nukleovej kyseliny, ktoré by mali znížený nábojový pomer a ktoré by aj napriek tomu boli stabilné v priebehu času vo forme neagregovaných častíc. Ako však už bolo uvedené, sú koncentračné zóny nukleová kyselina/lipofekčné činidlo zodpovedajúce takýmto nábojovým pomerom spojené s nestabilným fyzikálnym stavom. Veľmi rýchlo takto dochádza k agregácii nukleolipidových častíc. Okrem toho je rovnako známe, že prítomnosť soli typu NaCl, ktorá sa konvenčné používa vo formuláciách obsahujúcich katiónové transfekčné činidlo a nukleovú kyselinu, môže indukovať pri určitých koncentráciách zrážanie nukleolipidových častíc. Čím vyššia je táto koncentrácia soli, tým väčší bude koncentračný rozsah transfekčného činidla, pri ktorom dochádza k uvedenému zrážaniu.It would therefore be highly advantageous to have, from a therapeutic point of view, formulations based on a cationic transfection reagent and a nucleic acid which have a reduced charge ratio and which are nevertheless stable over time in the form of non-aggregated particles. However, as mentioned above, the nucleic acid / lipofection agent concentration zones corresponding to such charge ratios are associated with an unstable physical state. The nucleolipid particles aggregate very rapidly. In addition, it is also known that the presence of a NaCl-type salt, which is conventionally used in formulations containing a cationic transfection agent and a nucleic acid, can induce the precipitation of nucleolipid particles at certain concentrations. The higher the salt concentration, the greater the concentration range of the transfection agent at which the precipitation will occur.

Cieľom vynálezu je zlepšenie hodnoty uvedených koncentračných zón komplexov katiónové transfekčné činidlo/nukleová kyselina, ktoré sú výhodné z bezpečnostného hľadiska vzhľadom na redukované množstvá vektora a tiež z hľadiska interferencie s ostatnými proteínmi berúc do úvahy ich redukovaný náboj. Je totiž známe, že prípade ak komplexy majú relatívne nízky náboj, je významne znížená aj ich in vivo interferencia so sérovými proteínmi. To je samozrejme mimoriadne výhodné v prípade prenosu nukleových kyselín in vivo (Remy, J. S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995; 92, 1744 - 1748). O interakcii tohto typu interakcie medzi sérovými proteínmi a lipozómami sa zmieňujú mnohé články (Senior, J. H. a kol., Biochim. Biophys. Acta 1991, 1070, 173 - 179; Hemandez-Caselles, T. a kol., Molecular and Cellular Biochemistry 1993, 120, 119 - 126; Oku, N. a kol., Biochim. Biophys. Acta 1996, 1280, 149 - 154). Rovnako boli publikované údaje o aktivácii systému komplementu s komplexmi na báze DNA používanej v génovej terapii. Stupeň aktivácie komplementu závisí od nábojového pomeru katión/DNA. Naposledy uvedený jav sa konkrétne uplatňuje pri polykatiónoch, akými sú polylyzíny a lipospermíny (napríklad DOGS). Uvedená aktivácia komplementu je menej citlivá na nábojový' pomer v prípade kvartémych amóniových zlúčenín, akými sú DOTAP,It is an object of the invention to improve the value of said concentration zones of the cationic transfection agent / nucleic acid complexes, which are advantageous in terms of safety with respect to reduced amounts of the vector and also with respect to interference with other proteins taking into account their reduced charge. Indeed, it is known that if the complexes have a relatively low charge, their in vivo interference with serum proteins is also significantly reduced. This is of course particularly advantageous in the case of nucleic acid transfer in vivo (Remy, J. S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995; 92, 1744-1748). The interaction of this type of interaction between serum proteins and liposomes has been reported in many articles (Senior, JH et al., Biochim. Biophys. Acta 1991, 1070, 173-179; Hemandez-Caselles, T. et al., Molecular and Cellular Biochemistry 1993 , 120, 119-126; Oku, N. et al., Biochim. Biophys. Acta 1996, 1280, 149-154). Activation of the complement system with DNA-based complexes used in gene therapy has also been reported. The degree of complement activation depends on the cation / DNA charge ratio. The latter phenomenon is particularly applicable to polycathins such as polylysines and lipospermins (e.g. DOGS). Said complement activation is less sensitive to charge ratio for quaternary ammonium compounds such as DOTAP,

CD-Chol alebo DOTMA (Plamck, C. a kol., Human Gene Therapy 1996,7,1437 - 1446).CD-Chol or DOTMA (Plamck, C. et al., Human Gene Therapy 1996,7,1437-1446).

Vzhľadom na uvedené by teda bolo z terapeutického hľadiska výhodné mať k dispozícii formulácie obsahujúce komplexy katiónového transfekčného činidla a nukleovej kyseliny s vysokou koncentráciou nukleových kyselín a/alebo s redukovaným alebo dokonca takmer neutrálnym nábojovým pomerom, ktoré sú navyše stabilizované v tekutej forme koloidného typu, t. j. ktoré sú v neagregovanej forme, pričom tieto dva znaky sú zjavne prirodzene nezlučiteľné.Accordingly, it would be advantageous from a therapeutic point of view to have formulations comprising complexes of a cationic transfection agent and a nucleic acid with a high concentration of nucleic acids and / or with a reduced or even almost neutral charge ratio, which are additionally stabilized in a liquid form of the colloidal type. . j. which are in non-aggregated form, these two features being obviously naturally incompatible.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Prihlasovateľ teraz prekvapivo dokázal, že prídavok neionogénneho povrchovo aktívneho činidla k časticiam komplexov katiónového transfekčného činidla alebo činidiel a nukleovej kyseliny, ktoré sú prirodzene nestabilné, t. j. ktoré majú sklon rýchlo tvoriť agregáty, umožňuje účinne blokovať uvedený agregačný jav a teda stabilizovať častice komplexu tak, že ich veľkosť je menšia alebo sa rovná asi 160 nm.The Applicant has now surprisingly shown that the addition of a non-ionic surfactant to particles of cationic transfection agent or nucleic acid complexes that are naturally unstable, i. j. which tend to form aggregates rapidly allows to effectively block said aggregation phenomenon and thus stabilize the complex particles such that their size is less than or equal to about 160 nm.

Prvým predmetom vynálezu je kompozícia použiteľná na génovú terapiu a obsahujúca častice komplexu katiónového transfekčného činidla alebo činidiel a nukleovej kyseliny, ktorých podstata spočíva v tom, že navyše obsahuje aspoň jedno neionogénne povrchovo aktívne činidlo v množstve, ktoré je dostatočné na stabilizáciu veľkosti častíc menšej alebo rovnajúcej sa 160 nm.A first object of the invention is a composition useful for gene therapy and comprising particles of a complex of a cationic transfection agent or agents and a nucleic acid, further comprising at least one non-ionic surfactant in an amount sufficient to stabilize the particle size less than or equal to 160 nm.

V rámci vynálezu sa stabilizovanými časticami alebo časticami so stabilizovanou veľkosťou rozumejú častice, ktorých veľkosť nie je náchylná na zmenu v priebehu času, konkrétne, keď sú tieto častice udržiavané v disperzii alebo v roztoku. Oproti konvenčným formuláciám, t. j. formuláciám neobsahujúcim neionogénne povrchovo aktívne činidlo, sa môžu nárokované kompozície skladovať dlhodobo, pričom pri nich nedochádza v uvedenej disperzii k akejkoľvek modifikácii, konkrétne k modifikácii agregačného typu. Veľkosť takto stabilizovaných častíc sa všeobecne pohybuje medzi 50 až 160 nm, výhodne medzi 75 až 150 nm.Within the scope of the invention, stabilized or stabilized size particles are understood to mean particles whose size is not susceptible to change over time, in particular when the particles are maintained in dispersion or in solution. In contrast to conventional formulations, i. j. For example, in formulations not containing a nonionic surfactant, the claimed compositions may be stored for a long period of time without any modification in the dispersion, particularly the aggregation type. The particle size of the stabilized particles is generally between 50 and 160 nm, preferably between 75 and 150 nm.

V neprítomnosti nárokovaného neionogénneho povrchovo aktívneho činidla dochádza pri časticiach komplexu prítomných v nárokovanej kompozícii k spontánnej tvorbe agregátov, ktorých veľkosť je väčšia ako 160 nm.In the absence of the claimed nonionic surfactant, the aggregate particles present in the claimed composition spontaneously form aggregates having a size greater than 160 nm.

Okrem toho prihlasovateľ dokázal, že kompozícia podľa vynálezu má lamelámu štruktúru, ktorá má alternatívne dvojvrstvy lipidov s medziľahlými vrstvami DNA.In addition, the Applicant has shown that the composition of the invention has a lamellar structure having alternatively bilayers of lipids with intermediate DNA layers.

Neionogénne povrchovo aktívne činidlo podľa vynálezu má výhodne aspoň jeden hydrofóbny segment a aspoň jeden hydrofilný segment. Hydrofóbnou časťou môže byť alifatická reťaz, polyoxyalkylén, alkylidénpolyester, polyetylénglykol s dentritovou benzylpolyéterovou hlavou alebo cholesterol. Pokiaľ ide o hydrofilnú časť, môže byť touto časťou polyoxyalkylén, polyvinylalkohol, polyvinylpyrolidón alebo sacharid.The nonionic surfactant of the invention preferably has at least one hydrophobic segment and at least one hydrophilic segment. The hydrophobic moiety may be an aliphatic chain, a polyoxyalkylene, an alkylidene polyester, a polyethylene glycol with a dentrite benzyl polyether head, or cholesterol. The hydrophilic moiety may be a polyoxyalkylene, a polyvinyl alcohol, a polyvinylpyrrolidone or a carbohydrate.

Výhodne je povrchovo aktívne činidlo použité v rámci vynálezu tvorené alebo odvodené od neionogénneho polyolu a najmä od polyoxyalkylénu s alkylénovými skupinami rôznej alebo rovnakej dĺžky a/alebo štruktúry v polyméri.Preferably, the surfactant used in the present invention is formed from or derived from a nonionic polyol and in particular from a polyoxyalkylene having alkylene groups of different or equal length and / or structure within the polymer.

Výhodnejšie toto neionogénne povrchovo aktívne činidlo zodpovedá nasledujúcemu všeobecnému vzorcu:More preferably, the nonionic surfactant corresponds to the following general formula:

HO(CH₂CH₂O)_a(CH(CH₃)(CH₂O)_b(CH₂CH₂O)_cH, v ktorom a, b a c znamenajú nezávisle jeden od druhého celé číslo 20 až 100.HO (CH ₂ CH ₂ O) _and (CH (CH ₃ ) (CH ₂ O) _b (CH ₂ CH ₂ O) _c H, wherein a, b and c are, independently of each other, an integer of 20 to 100.

Uvedené neionogénne povrchovo aktívne činidlo je výhodne prítomné v kompozíciách podľa vynálezu v koncentrácii medzi 0,01 a 10 %hmotn./obj., výhodne medzi 0,02 a 5 % hmotn./obj., vztiahnuté na hmotnosť uvedenej kompozície.Said non-ionic surfactant is preferably present in the compositions of the invention at a concentration of between 0.01 and 10% w / v, preferably between 0.02 and 5% w / v, based on the weight of said composition.

Prítomnosť takéhoto neionogénneho povrchovo aktívneho činidla v kombinácii s uvedenými komplexmi je výhodná z niekoľkých dôvodov:The presence of such a nonionic surfactant in combination with said complexes is advantageous for several reasons:

V rámci vynálezu sú katiónové transfekčné činidlo alebo činidlá a nukleové kyseliny prítomné v kompozícii v nábojovom pomere, ktorý' je samozrejme priaznivý- na rozvoj uvedeného agregačného javu. To vedie k tomu, že pozitívne náboje nesené katiónovým transfekčným činidlom alebo činidlami sú len v miernom prebytku vzhľadom na negatívne náboje nesené nukleovou kyselinou v komplexe alebo najlepšie sú s uvedenými negatívnymi nábojmi v rovnováhe. Takýto nábojový pomer je obzvlášť výhodný z hľadiska in vivo, pretože je menej škodlivý pokiaľ ide o interakciu so sérovými alebo inými proteínmi, akým je napríklad albumín, a výhodnejší z hľadiska bezpečnosti. Na ilustráciu sa môže uviesť, že tento nábojový pomer sa výhodne pohybuje medzi 1 a 6 a je výhodne nižší ako 4.Within the scope of the invention, the cationic transfection agent or agents and the nucleic acids are present in the composition in a charge ratio that is, of course, favorable to the development of said aggregation phenomenon. As a result, the positive charges carried by the cationic transfection reagent or reagents are only in a slight excess relative to the negative charges carried by the nucleic acid complex or are preferably in balance with said negative charges. Such a charge ratio is particularly advantageous in vivo, since it is less harmful in terms of interaction with serum or other proteins, such as albumin, and more preferred in terms of safety. By way of illustration, this charge ratio is preferably between 1 and 6 and is preferably less than 4.

Navyše je uvedené neionogénne povrchovo aktívne činidlo celkom kompatibilné s podaním in vivo. V prípade formulácie podľa vynálezu nie je v skutočnosti nevyhnutné odstrániť toto neionogénne povrchovo aktívne činidlo z kompozície ešte pred injikáciou kompozície do buniek určených na ošetrenie.In addition, said nonionic surfactant is fully compatible with in vivo administration. In the case of the formulation according to the invention, it is in fact not necessary to remove the nonionic surfactant from the composition before injecting the composition into the cells to be treated.

Konečne sa môže uviesť, že kompozície podľa vynálezu sa môžu výhodne skladovať. Prítomnosť neionogénneho povrchovo aktívneho činidla účinne blokuje akýkoľvek precipitačný jav v uvedenej kompozícii.Finally, it can be noted that the compositions of the invention may be conveniently stored. The presence of a non-ionic surfactant effectively blocks any precipitation phenomenon in said composition.

Ako výhodné neionogénne povrchovo aktívne činidlo podľa vynálezu sa môže obzvlášť uviesť zlúčenina všeobecného vzorca:A preferred nonionic surfactant according to the invention is, in particular, a compound of the formula:

HO(CH₂CH₂O)_a(CH(CH₃)(CH₂O)_b(CH₂CH₂O)_cH, v ktorom a znamená 75, b znamená 30 a c znamená 75.HO (CH ₂ CH ₂ O) _and (CH (CH ₃ ) (CH ₂ O) _b (CH ₂ CH ₂ O) _c H, where a is 75, b is 30 and c is 75.

Ďalšími výhodnými neionogénnymi povrchovo aktívnymi činidlami sú polyetylénglykol s dentritovou benzylpolyéterovou hlavou, polyoxyetylénalkoholy alebo polyoxyetylénnonylfenyléter.Further preferred nonionic surfactants are polyethylene glycol with a dentrite benzyl polyether head, polyoxyethylene alcohols or polyoxyethylene nonylphenyl ether.

Katiónové transfekčné činidlo výhodne v rámci vynálezu zahŕňa katiónové polyméry a lipofekčné činidlá.Preferably, the cationic transfection agent within the scope of the invention comprises cationic polymers and lipofection agents.

Pokiaľ ide najmä o lipofekčné činidlá, rozumie sa pod týmto označením v rámci vynálezu ľubovoľná zlúčenina alebo zmes, majúca lipidový charakter a je pozitívne nabitá, ktorá už bola navrhnutá ako aktívne činidlo v súvislosti s bunkovou transfekciou nukleových kyselín.In particular, with respect to lipofectants, within the scope of the invention is meant any compound or mixture having a lipid nature and is positively charged, which has already been proposed as an active agent in connection with cell transfection of nucleic acids.

Všeobecne ide o amfifilné molekuly obsahujúce aspoň jednu lipofilnú oblasť kombinovanú alebo nekombinovanú s hydrofilnou oblasťou.Generally, they are amphiphilic molecules comprising at least one lipophilic region, combined or not combined with a hydrophilic region.

Ako zástupcu prvej skupiny zlúčenín je možné navrhnúť najmä lipidové zmesi schopné tvoriť katiónové lipozómy. Tieto formulácie môžu takto obsahovať POPC, fosfatidylserín, fosfatidylcholín, cholesterol, lipofektamid alebo maleínimidofenylbutyrylfosfatidyletanolamín kombinovaný s katiónovým lipidom, ktorý už bol definovaný.In particular, lipid mixtures capable of forming cationic liposomes can be proposed as representative of the first group of compounds. The formulations may thus comprise POPC, phosphatidylserine, phosphatidylcholine, cholesterol, lipofectamide or maleimido-phenylbutyrylphosphatidylethanolamine combined with a cationic lipid as defined above.

V rámci špecifického uskutočnenia vynálezu má použité lipofekčné činidlo katiónovú oblasť.In a specific embodiment of the invention, the lipofection agent used has a cationic region.

Ako príklad tohto typu katiónových lipidov konštruovaných na základe štruktúrneho modelu: lipofilná skupina kombinovaná s amino-skupinou cez takzvané dištančné rameno („spacer“) sa môže uviesť najmä produkt DOTMA a tiež katiónové lipidy, ktoré ako lipofilnú skupinu obsahujú dve mastné kyseliny alebo cholesterolové deriváty, a ktoré navyše obsahujú v prípade, že je to žiaduce, ako aminoskupinu kvartérnu amóniovú skupinu. Ako zástupcovia tejto kategórie katiónových lipidov sa môžu uviesť najmä lipidy DOTAP, DOBT alebo ChOTB. Iné zlúčeniny, akými sú napríklad DOSC a ChOSC, sú charakterizované prítomnosťou cholínovcj skupiny namiesto kvartérnej amóniovej skupiny.An example of this type of cationic lipids constructed on the basis of a structural model: a lipophilic group combined with an amino group via a so-called spacer arm can be mentioned, in particular, DOTMA, as well as cationic lipids containing two fatty acids or cholesterol derivatives , and which additionally contain, if desired, as an amino group a quaternary ammonium group. Representatives of this category of cationic lipids are, in particular, DOTAP, DOBT or ChOTB lipids. Other compounds, such as DOSC and ChOSC, are characterized by the presence of a choline group instead of a quaternary ammonium group.

Výhodne môžu byť tiež lipofekčné činidlá vhodné na použitie v rámci vynálezu zvolené z lipopolyamidov, ktorých polyamínová oblasť zodpovedá všeobecnému vzorcu:Preferably, the lipofectants suitable for use in the invention may also be selected from lipopolyamides whose polyamine region corresponds to the general formula:

H₂N-(-(CH)_m-NH-)_n-H , v ktorom m znamená celé číslo väčšie alebo rovnajúce sa 2 a n znamená celé číslo väčšie alebo rovnajúce sa 1, pričom je možné, že m sa mení v prípade rôznych uhlíkových skupín medzi dvoma amínovými skupinami, pričom táto polyamínová oblasť je kovalentne viazaná s lipofilnou oblasťou nasýteného alebo nenasýteného uhľovodíkového reťazca cholesterolového typu alebo s prírodným alebo syntetickým lipidom schopným tvoriť lamelárne alebo hexagonálne fázy. Táto polyamidová oblasť je výhodnejšie reprezentovaná spermínom alebo niektorým z jeho analógov, ktorý si zachoval schopnosť viazať nukleovou kyselinou.H ₂ N - (- (CH) _m -NH-) _n -H, in which m is an integer greater than or equal to 2 and n is an integer greater than or equal to 1, where m may vary The polyamine region is covalently bonded to a lipophilic region of a saturated or unsaturated hydrocarbon chain of the cholesterol type, or to a natural or synthetic lipid capable of forming lamellar or hexagonal phases. This polyamide region is more preferably represented by spermine or one of its analogues, which has retained its ability to bind with a nucleic acid.

Patentová prihláška EP 394 111 opisuje lipopolyamíny tejto skupiny, ktoré sú schopné použitia v rámci vynálezu. Ako zástupcovia týchto lipopolyamínov sa môžu uviesť najmä dioktadecylamidoglycylspermín (DOGS) a palmitoylfosfatidyletanolamín-5-karboxyspermylamid (DPPES).Patent application EP 394 111 discloses lipopolyamines of this group that are capable of use in the present invention. Representatives of these lipopolyamines include, in particular, dioctadecylamidoglycylspermine (DOGS) and palmitoylphosphatidylethanolamine-5-carboxyspermylamide (DPPES).

V rámci vynálezu sa môžu tiež použiť lipopolyamíny opísané v patentovej prihláške WO96/17823. Tieto lipopolyamíny majú všeobecný vzorec:Lipopolyamines described in patent application WO96 / 17823 may also be used in the present invention. These lipopolyamines have the general formula:

H₂N-(—(CH) _m-NH—) _n-H _> v ktorom R znamená skupinuH ₂ N - (- (CH) _m -NH-) _n -H _> wherein R is a group

pričom X a X' znamenajú nezávisle jeden od druhého atóm kyslíka, metylénovú skupinu -(CH₂)_q, kde q znamená 0, 1, 2 alebo 3, alebo aminoskupinu -NH- alebo -NR'-, kde R' znamená alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 uhlíkové atómy, Y a Y' znamenajú nezávisle jeden od druhého metylénovú skupinu, karbonylovú skupinu alebo skupinu C=S, R³, R⁴ a R⁵ znamenajú nezávisle jeden od druhého atóm vodíka alebo substituovanú alebo nesubstituovanú alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 uhlíkové atómy, p sa môže meniť medzi 0 a 5, R⁶ znamená cholesterolový derivát alebo dialkylaminoskupinu vzorca -NR'R², kde R¹ a R² znamenajú nezávisle jeden od druhého nasýtenú alebo nenasýtenú, priamu alebo rozvetvenú alifatickú skupinu obsahujúcu 12 až 22 uhlíkových atómov.wherein X and X 'are each independently O, methylene - (CH ₂ ) _q wherein q is 0, 1, 2 or 3, or amino -NH- or -NR'-, wherein R' is alkyl containing from 1 to 4 carbon atoms, Y and Y 'are, independently of one another, a methylene group, a carbonyl group or a C = S group, R ³ , R ⁴ and R ⁵ are independently of one another a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted alkyl group containing 1 R ⁴ is a cholesterol derivative or a dialkylamino group of the formula -NR'R ² , wherein R ¹ and R ² are each independently a saturated or unsaturated, straight or branched aliphatic group containing 12 to 12 carbon atoms; up to 22 carbon atoms.

Ako zástupcovia týchto lipopolyamínov sa tu môžu uviesť konkrétne 2,5-bis(3-aminopropylamino)pentyl(di oktadecyl-karbamoylmetoxyjacetát a l,3-bis(3-aminopropylamino)-2-propyl(dioktadecylkarbamoylmetoxy)acetát.In particular, 2,5-bis (3-aminopropylamino) pentyl (di octadecylcarbamoylmethoxy) acetate and 1,3-bis (3-aminopropylamino) -2-propyl (dioctadecylcarbamoylmethoxy) acetate may be mentioned as representatives of these lipopolyamines.

Nakoniec, nové polyamíny, ktorých hodnota sa môže zlepšiť v rámci vynálezu, boli nedávno opísané v patentovej prihláške WO97/18185. Tieto zlúčeniny majú všeobecný vzorec:Finally, novel polyamines whose value can be improved within the scope of the invention have recently been described in patent application WO97 / 18185. These compounds have the general formula:

v ktorom R¹, R² a R³ znamenajú nezávisle jeden od druhého atóm vodíka alebo skupinu -(CH2)q-NRR’, kde q sa môže meniť medzi 1, 2, 3, 4, 5 a 6, a to nezávisle medzi rôznymi skupinami R¹, R² a R³, a R a R’ znamenajú nezávisle jeden od druhého atóm vodíka alebo skupinu -(CH2) _q-NH₂, kde q' sa môže meniť medzi 1, 2,3, 4, 5 a 6, a to nezávisle medzi rôznymi skupinami R a R’, m, n a p znamenajú nezávisle jeden od druhého celé číslo, ktoré sa môže meniť medzi 0 a 6, pričom keď n je väčšie ako 1, m môže mať rôzne hodnoty a R³ môže mať rôzne významy v rámci uvedeného všeobecného vzorca, a R⁴ znamená skupinu so všeobecným vzorcomwherein R ¹ , R ² and R ³ are each independently hydrogen or - (CH 2) q -NR R ', wherein q may vary between 1, 2, 3, 4, 5, and 6, independently between different R ¹ , R ² and R ³ groups, and R and R 'are each independently hydrogen or - (CH 2) _q -NH ₂ , where q' may vary between 1, 2,3, 4, 5 and 6, independently between different groups R and R ', m, n and p independently of one another represent an integer which may vary between 0 and 6, wherein when n is greater than 1, m may have different values and R ³ may have different meanings within the aforementioned general formula, and R ⁴ represents a group of the general formula

R⁵ _r I —r—X—(-CH)_r---R ⁵ _r I —r — X - (- CH) _r ---

v ktorom R⁶ a R⁷ znamenajú nezávisle jeden od druhého atóm vodíka alebo nasýtený alebo nenasýtenú alifatickú skupinu obsahujúcu 10 až 22 uhlíkových atómov, pričom aspoň jeden z uvedených dvoch všeobecných symbolov má význam iný ako atóm vodíka, u znamená celé číslo medzi 0 a 10 pričom, keď je u väčšie ako 1, môžu mať R⁵, X, Y a r rôzne významy v rámci rôznych jednotiek [X-(CH₅)_r-Y], X znamená atóm kyslíka alebo atóm síry alebo amínovú skupinu, ktorá je alebo nie je monoalkylovaná, Y znamená karbonylovú alebo metylénovú skupinu, R⁵ znamená atóm vodíka alebo bočný reťazec prirodzenej aminokyseliny, ktorý je prípadne substituovaný, a r znamená celé číslo 1 až 10, pričom keď r sa rovná 1, R⁵ znamená substituovaný alebo nesubstituovaný bočný reťazec prirodzenej aminokyseliny a keď r je väčšie ako 1, R⁵ znamená atóm vodíka.wherein R ⁶ and R ⁷ are each independently hydrogen or a saturated or unsaturated aliphatic group containing 10 to 22 carbon atoms, wherein at least one of the two general symbols is other than hydrogen, u is an integer between 0 and 10 wherein when u is greater than 1, R ⁵ , X, Y and r may have different meanings within different units of [X- (CH ₅ ) _r -Y], X represents an oxygen atom or a sulfur atom or an amine group which is or not monoalkylated, Y represents a carbonyl or methylene group, R ⁵ represents a hydrogen atom or a natural amino acid side chain which is optionally substituted, and ar represents an integer from 1 to 10, wherein when r is 1, R ⁵ represents a substituted or unsubstituted side chain and when r is greater than 1, R ⁵ represents a hydrogen atom.

Ako príklady týchto lipopolyamínov sa môžu konkrétne uviesť nasledovné lipopolyamíny:Examples of these lipopolyamines include, but are not limited to, the following lipopolyamines:

{H₂N(CH₂)₃}₂N(CH₂)₄N{(CH₂)₃NH₂}(CH₂)₃NHCH₂COG1{H ₂ N (CH ₂ ) ₃ } ₂ N (CH ₂ ) ₄ N {(CH ₂ ) ₃ NH ₂ } (CH ₂ ) ₃ NHCH ₂ COG1

-yN[(CH₂)₁₇CH₃]₂,-yN [(CH ₂ ) ₁₇ CH ₃ ] ₂ ,

H₂N(CH₂)₃NH(CH,)₄NH(CH₂)₃NHCH₂COGlyN[(CH₂)₁₇CH₃]₂,H ₂ N (CH ₂ ) ₃ NH (CH 2) ₄ NH (CH ₂ ) ₃ NHCH ₂ COGlyN [(CH ₂ ) ₁₇ CH ₃ ] ₂ ,

H₂N(CH₂)₃NH(CH,)₄NH(CH₂)₃NHCH₂COArgN[(CH₂)₁₇CH₃],.H ₂ N (CH ₂ ) ₃ NH (CH 2) ₄ NH (CH ₂ ) ₃ NHCH ₂ COAr ₉ N [(CH ₂ ) ₁₇ CH ₃ ] ,.

Mimoriadne výhodne sa v rámci vynálezu môže použiť lipofektamín, dioktadecylamidoglycylspermín (DOGS), palmitoylfosfatidyletanolamín-5-karboxyspermylamid (DPPES), 2,5-bis(3-aminopropylamino)pentyl(dioktadecylkarbamoylmetoxyjacetát, 1,3 -bis(3-aminopropylamino)-2-propyl(dioktadccylkarbamoylmetoxy)acetát a {H₂N(CH₂)₃} ₂N(CHj)₄N {(CH₂)₃NH₂j (CH₂)₃NHCH₂COGlyN[(CH₂)₁₇CH₃]₂,Particularly preferably, lipofectamine, dioctadecylamidoglycylspermine (DOGS), palmitoylphosphatidylethanolamine-5-carboxyspermylamide (DPPES), 2,5-bis (3-aminopropylamino) pentyl (dioctadecylcarbamoylmethoxybisoyl-3-methoxy-3-propyl) -acetate, -propyl (dioctadccylcarbamoylmethoxy) acetate and {H ₂ N (CH ₂ ) ₃ } ₂ N (CH 3) ₄ N {(CH ₂ ) ₃ NH ₂ j (CH ₂ ) ₃ NHCH ₂ COGlyN [(CH ₂ ) ₁₇ CH ₃ ] ₂ ,

H₂N(CH₂)₃NH(CH₂)₄NH(CH₂)₃NHCH₂COGlyN[(CH₂)₁₇CH₃]₂,H ₂ N (CH ₂ ) ₃ NH (CH ₂ ) ₄ NH (CH ₂ ) ₃ NHCH ₂ COGlyN [(CH ₂ ) ₁₇ CH ₃ ] ₂ ,

H₂N(CH₂)₃NH(CH₂)₄NH(CH₂)₃NHCH₂COArgN[(CH₂)₁₇CH₃]₂.H ₂ N (CH ₂ ) ₃ NH (CH ₂ ) ₄ NH (CH ₂ ) ₃ NHCH ₂ COAr ₉ N [(CH ₂ ) ₁₇ CH ₃ ] ₂ .

Tiež sa môžu takto použiť katiónové lipidy obsahujúce jednu alebo niekoľko guanidínových a/alebo amidínových skupín, akými sú konkrétne katiónové lipidy, ktoré opísal J. M. Lehn a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 9682 - 9686).Cationic lipids containing one or more guanidine and / or amidine groups, such as the particular cationic lipids described by J. M. Lehn et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 9682-9686).

Katiónovým polymérom, ktorý sa môže v rámci vynálezu použiť ako katiónové transfekčné činidlo, je výhodne zlúčenina s nasledovným všeobecným vzorcom (I)The cationic polymer which can be used as a cationic transfection agent in the present invention is preferably a compound of the following general formula (I)

n (I), v ktorom R znamená atóm vodíka alebo skupinu so všeobecným vzorcomn (I) wherein R represents a hydrogen atom or a group of the general formula

q v ktorom j n je celé číslo 2 až 10 a p a q sú celé čísla, pričom súčet p + q má takú hodnotu, že stredná molekulová hmotnosť polyméru sa pohybuje medzi 100 až 10⁷ Da.q in which jn is an integer of 2 to 10 and p and q are integers, the sum of p + q having a value such that the average molecular weight of the polymer is between 100 and 10 ⁷ Da.

Je potrebné uviesť, že hodnota n sa vo všeobecnom vzorci (I) môže meniť v rámci rôznych jednotiek p. Všeobecný vzorec takto zahrnuje tak homopolyméry, ako aj heteropolyméry.It should be noted that the value of n in formula (I) may vary within different units of p. Thus, the general formula includes both homopolymers and heteropolymers.

Vo všeobecnom vzorci výhodnejšie n znamená 2 až 5. Veľmi výhodné vlastnosti majú konkrétne polyméry polyetylénimínu (PEI), polypropylénimínu (PPI). Výhodné polyméry na uskutočnenie vynálezu sú polyméry, ktorých molekulová hmotnosť sa pohybuje medzi 10³ a 5 x 10⁶. Ako príklady takýchto polymérov sa môžu uviesť polyetylénimín so strednou molekulovú hmotnosťou 50 000 Da (PEI50K), polyetylénimín so strednou molekulovou hmotnosťou 22 000 Da (PEI22K) alebo polyetylénimín so strednou molekulovou hmotnosťou 800 000 Da (PEI800K).More preferably, n is 2 to 5 in the formula. Particularly preferred polymers are polyethyleneimine (PEI), polypropyleneimine (PPI). Preferred polymers for carrying out the invention are polymers having a molecular weight of between 10 ³ and 5 x 10 ⁶ . Examples of such polymers include polyethyleneimine with a mean molecular weight of 50,000 Da (PEI50K), polyethyleneimine with a mean molecular weight of 22,000 Da (PEI22K), or polyethyleneimine with a mean molecular weight of 800,000 Da (PEI800K).

Polyméry PEI50K, PEI22K a PEI800K sú komerčne dostupné. Pokiaľ ide o ostatné polyméry so všeobecným vzorcom (I), môžu sa tieto polyméry pripraviť spôsobom opísaným v patentovej prihláške FR94/08735.The polymers PEI50K, PEI22K and PEI800K are commercially available. With respect to the other polymers of formula (I), these polymers can be prepared as described in patent application FR94 / 08735.

V kompozíciách podľa vynálezu môže byť nukleová kyselina, ktorá je v komplexe s katiónovým transfekčným činidlom, tak deoxyribonukleová kyselina, ako aj ribonukleová kyselina. Tieto kyseliny môžu byť tvorené sekvenciami prirodzeného alebo umelého pôvodu, pričom konkrétne ide o genómovú DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA a o modifikované alebo nemodiflkované hybridné sekvencie alebo syntetické alebo semisyntetické sekvencie oligonukleotidov. Uvedené nukleové kyseliny môžu byť ľudského, zvieracieho, rastlinného, bakteriálneho alebo vírusového pôvodu. Môžu sa získať ľubovoľnou známou technikou a konkrétne vytriedením z DNA bánk, chemickou syntézou alebo alternatívne zmesnými postupmi zahrnujúcimi chemickú a enzýmovú modifikáciu sekvencií získaných z vytriedených bánk. Tieto sekvencie môžu byť chemicky modifikované.In the compositions of the invention, a nucleic acid that is complexed with a cationic transfection agent can be both a deoxyribonucleic acid and a ribonucleic acid. These acids may consist of sequences of natural or artificial origin, in particular genomic DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, and modified or unmodified hybrid sequences or synthetic or semisynthetic oligonucleotide sequences. Said nucleic acids may be of human, animal, plant, bacterial or viral origin. They can be obtained by any known technique and, in particular, by screening from DNA banks, by chemical synthesis or alternatively by mixed procedures involving chemical and enzymatic modification of sequences obtained from screened banks. These sequences may be chemically modified.

Pokiaľ ide konkrétne o deoxyribonukleové kyseliny, môžu byť tieto kyseliny jedno- a dvojvláknové alebo môže ísť o krátke oligonukleotidy alebo o dlhšie sekvencie. Tieto deoxyribonukleové kyseliny môžu niesť terapeutické gény, sekvencie na reguláciu prepisu alebo replikácie, modifikované alebo nemodiflkované antimediátorové sekvencie, oblasti pre väzbu k iným bunkovým zložkám a podobne.With particular reference to deoxyribonucleic acids, these may be single and double stranded, or may be short oligonucleotides or longer sequences. These deoxyribonucleic acids may carry therapeutic genes, transcriptional or replication regulatory sequences, modified or unmodified antisense sequences, regions for binding to other cellular components, and the like.

V rámci vynálezu sa pod menom terapeutický gén rozumie konkrétne ľubovoľný gén kódujúci proteínový produkt, ktorý má terapeutický účinok. Takto kódovaný proteínový produkt môže byť proteín, peptid a podobne. Tento proteínový produkt môže byť homologický s cieľovou bunkou (čo znamená, že ide o produkt, ktorý je normálne exprimovaný v cieľovej bunke v prípade, keď táto cieľová bunka nevykazuje žiadnu patológiu). V tomto prípade umožňuje expresia proteínu kompenzovať v cieľovej bunke nedostatočnú expresiu proteínu, ktorý je inaktívny alebo obmedzene aktívny v dôsledku modifikácie, alebo nadmernú expresiu uvedeného proteínu. Uvedený terapeutický gén môže tiež kódovať mutant bunkového proteínu so zvýšenou stabilitou, modifikovanou aktivitou a podobne. Uvedený proteínový produkt môže byť tiež heterologický s cieľovou bunkou. V tomto prípade môže exprimovaný proteín napríklad posilňovať alebo poskytovať aktivitu, ktorá je v cieľovej bunke nedostatočná, čím jej umožňuje bojovať s patológiou alebo stimulovať imunitnú odpoveď.In the context of the invention, the term therapeutic gene is understood to mean in particular any gene encoding a protein product having a therapeutic effect. The protein product thus encoded may be a protein, a peptide and the like. This protein product may be homologous to the target cell (meaning that it is a product that is normally expressed in the target cell when the target cell has no pathology). In this case, the expression of the protein makes it possible to compensate in the target cell for an under-expression of a protein that is inactive or limited in activity due to modification, or an overexpression of said protein. Said therapeutic gene may also encode a cell protein mutant with increased stability, modified activity, and the like. Said protein product may also be heterologous to the target cell. In this case, the expressed protein may, for example, enhance or provide activity that is deficient in the target cell, thereby allowing it to combat pathology or stimulate an immune response.

Ako príklady terapeutických produktov použiteľných v rámci vynálezu sa môžu uviesť najmä enzýmy, krvné deriváty, hormóny, lymfokíny: interleukíny, interferóny, TNF a podobne (FR 92/03120), rastové faktory, neurotransmitery alebo ich prekurzory alebo enzýmy syntézy, trofínové faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT33, NT5, HARP/pleiotrofm a podobne, dystrofm alebo minidystrofín (FR 91/11947), proteín CFTR združený s cystickou fibrózou, nádorové supresorové gény: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev a podobne (FR 93/04745), gény kódujúce faktory uplatňujúce sa pri náprave DNA, samovražedné gény (tymidínkináza, cytozíndeamináza), gény hemoglobínu alebo iných nosičových proteínov, gény zodpovedajúce proteínom uplatňujúcim sa pri metabolizme lipidov apolipoproteínového typu vybrané zo skupiny zahrnujúcej apolipoproteíny A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J a apo(a), metabolické enzýmy, ako sú napríklad lipoproteínlipáza, pečeňová lipáza, lecitíncholesterolacyltransferáza, 7-alfa-cholesterolhydroxyláza, kyselina fosfatidová-fosfatáza, alebo alternatívne proteíny na prenos lipidov, ako napríklad proteín na prenos cholesterolesterov a proteín na prenos fosfolipidov, proteín na viazanie HDL alebo alternatívne receptor vybraný napríklad zo skupiny zahrnujúcej receptory LDL, receptory pre reumatoidné chylomikróny, skavenžerové (scavenger) receptory a podobne.Examples of therapeutic products useful in the invention include, but are not limited to, enzymes, blood derivatives, hormones, lymphokines: interleukins, interferons, TNF and the like (FR 92/03120), growth factors, neurotransmitters or their precursors or synthesis enzymes, trophin factors: BDNF , CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT33, NT5, HARP / pleiotroph and the like, dystrophm or minidystrophin (FR 91/11947), cystic fibrosis associated CFTR protein, tumor suppressor genes: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev and the like (FR 93/04745), genes encoding DNA repair factors, suicide genes (thymidine kinase, cytosine deaminase), hemoglobin or other carrier protein genes, genes corresponding to proteins involved in apolipoprotein type lipid metabolism selected from groups including apolipoproteins A1, A-II, A-IV, B, CI, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J and apo (a) metabolic enzymes such as lipop rotein lipase, liver lipase, lecithincholesterolacyltransferase, 7-alpha-cholesterol hydroxylase, phosphatidic acid-phosphatase, or alternatively lipid transfer proteins such as cholesterol ester transfer protein and phospholipid transfer protein, HDL binding protein or alternative receptor selected for example from the group consisting of receptors LDL, receptors for rheumatoid chylomicrons, scavenger receptors and the like.

Terapeutická nukleová kyselina môže byť tiež gén alebo antimediátorová sekvencia, ktorej expresia v cieľovej bunke umožňuje regulovať expresiu génov alebo transkripciu bunkových mRNA. Takéto sekvencie môžu byť napríklad prepísané v cieľovej bunke do RNA komplementárnej k bunkovým mRNA a tým blokovať ich transláciu na proteín, a to v súlade s technikou opísanou v patente EP 140 308. Terapeutické gény tiež obsahujú sekvencie kódujúce ribozómy, ktoré sú schopné selektívne rozrušiť cieľové RNA (EP 321 201).The therapeutic nucleic acid may also be a gene or antisense sequence whose expression in a target cell allows the expression of genes or the transcription of cellular mRNAs to be regulated. Such sequences may, for example, be transcribed in a target cell into RNA complementary to cellular mRNAs, thereby blocking their translation into a protein, in accordance with the technique described in EP 140 308. Therapeutic genes also contain ribosome coding sequences capable of selectively disrupting the target RNA (EP 321 201).

Ako je už bolo uvedené, môže nukleová kyselina tiež obsahovať jeden alebo niekoľko génov kódujúcich antigénny peptid schopný generovať u človeka alebo u zvierat imunitnú odpoveď. V rámci tohto špecifického uskutočnenia vynález preto umožňuje buď výrobu vakcín alebo imunoterapeutické ošetrenie ľudí alebo zvierat, namierené pre dovšetkým proti mikroorganizmom, vírusom alebo rakovine. Môže konkrétne ísť o antigénne peptidy, ktoré sú špecifické pre vírus Epstein-Berrovej, HIV vírus, vírus hepatitídy B (EP 185 573), vírus psedobesnoty, syncytium-tvorný vírus alebo iné vírusy alebo alternatívne špecifické pre nádory (EP 259 212).As mentioned above, the nucleic acid may also comprise one or more genes encoding an antigenic peptide capable of generating an immune response in a human or animal. Accordingly, in this specific embodiment, the invention allows either the production of vaccines or immunotherapeutic treatment of humans or animals, directed in particular against microorganisms, viruses or cancer. In particular, they may be antigenic peptides that are specific for Epstein-Berr virus, HIV virus, hepatitis B virus (EP 185 573), pseudobacteria virus, syncytium-forming virus or other viruses or alternatively tumor-specific (EP 259 212).

Nukleová kyselina výhodne tiež obsahuje sekvencie umožňujúce expresiu terapeutického génu a/alebo génu kódujúceho antigénny peptid v bunke alebo v požadovanom orgáne. Môže isť o sekvencie, ktoré sú prirodzene zodpovedné za expresiu uvažovaného génu v prípade, keď sú takéto sekvencie schopné funkcie v infikovanej bunke. Môže tiež ísť o sekvencie rôzneho pôvodu (zodpovedné za expresiu iných proteínov alebo dokonca o syntetické sekvencie). Môže ísť najmä o promótorové sekvencie eukaryotických alebo vírusových génov. Môže ísť napríklad o promótorové sekvencie odvodené z genómu bunky, ktorá sa má infikovať. Podobne môže ísť o promótorové sekvencie odvodené z genómu vírusu. Z tohto hľadiska sa môžu uviesť napríklad promótory génov E1A, MLP, CMV a RSV a podobne. Okrem toho sa môžu tieto expresné sekvencie modifikovať pridaním aktivačných alebo regulačných sekvencií a podobne. Uvedený promótor môže byť indukovateľný alebo potlačiteľný.Preferably, the nucleic acid also comprises sequences allowing the expression of the therapeutic gene and / or the gene encoding the antigenic peptide in a cell or in a desired organ. These may be sequences which are naturally responsible for the expression of the gene of interest in the case where such sequences are capable of functioning in the infected cell. They may also be sequences of different origins (responsible for the expression of other proteins or even synthetic sequences). In particular, they may be promoter sequences of eukaryotic or viral genes. For example, they may be promoter sequences derived from the genome of the cell to be infected. Similarly, they may be promoter sequences derived from the genome of the virus. In this regard, for example, the promoters of the E1A, MLP, CMV and RSV genes and the like can be mentioned. In addition, these expression sequences can be modified by the addition of activation or regulatory sequences and the like. Said promoter may be inducible or suppressable.

Navyše môže nukleová kyselina tiež obsahovať, konkrétne pre terapeutickým génom, signálnu sekvenciu vedúcu syntetizovaný terapeutický produkt do sekrečných ciest cieľovej bunky. Táto signálna sekvencia môže byť prirodzená sekvencia terapeutického produktu, aj keď môže ísť o iné funkčné signálne sekvencie alebo o umelé signálne sekvencie. Uvedená nukleová kyselina môže tiež obsahovať signálnu sekvenciu vedúcu syntetizovaný terapeutický produkt do určitej špecifickej oblasti bunky.In addition, the nucleic acid may also contain, in particular for the therapeutic gene, a signal sequence leading the synthesized therapeutic product to the secretory pathways of the target cell. This signal sequence may be the natural sequence of the therapeutic product, although it may be other functional signal sequences or artificial signal sequences. Said nucleic acid may also comprise a signal sequence leading the synthesized therapeutic product to a specific cell region.

V rámci iného uskutočnenia môže nárokovaná kompozícia navyše obsahovať prísadu typu zahrnujúceho dioleylfosfatidyletanolamín (DOPE), oleoylpalmitoylfosfatidyletanolamín (POPE), di-stearoyl, -palmitoyl a -myristoylfosfatidyletanolamíny, ako aj ich deriváty, ktoré sú 1 až 3-krát N-metylované, fosfatidylglyceroly, diacylglyceroly, glykozyldiacylglyceroly, cerebrozidy (konkrétne galaktoccrebrozidy), sflngolipidy (konkrétne sflngomyelíny) alebo alternatívne asialogangliozidy (konkrétne asialoGMl a GM2).In another embodiment, the claimed composition may additionally comprise an additive of the type comprising dioleylphosphatidylethanolamine (DOPE), oleoylpalmitoylphosphatidylethanolamine (POPE), di-stearoyl, -palmitoyl and -myristoylphosphatidylethanolamines, as well as their phosphates, which are 1 to 3 times N diacylglycerols, glycosyldiacylglycerols, cerebrosides (particularly galactocrebroids), sphingolipids (particularly sphingomyelins) or alternatively asialogangliosides (particularly asialoGM1 and GM2).

V nedávnom čase prihlasovateľ dokázal, že je mimoriadne výhodné použiť ako prísadu v transfekčných kompozíciách zlúčeninu uplatňujúcu sa priamo alebo nepriamo pri kondenzácii nukleových kyselín. Táto zlúčenina je úplne alebo čiastočne tvorená peptidovými jednotkami (KTPKKAKKP) a/alebo (ATPAKKAA), pričom sa počet jednotiek môže meniť od 2 do 10. Takéto činidlo sa môže tiež odvodiť sčasti histónu, nukleolínu, protamínu a/alebo niektorého z ich derivátov (WO96/25508). Takáto zlúčenina sa môže výhodne zabudovať do nárokovanej kompozície.Recently, the Applicant has shown that it is particularly advantageous to use as a additive in transfection compositions a compound which acts directly or indirectly in the condensation of nucleic acids. This compound is wholly or partially composed of peptide units (KTPKKAKKP) and / or (ATPAKKAA), the number of units may vary from 2 to 10. Such an agent may also be derived in part from histone, nucleoline, protamine and / or any of its derivatives ( WO96 / 25508). Such a compound may advantageously be incorporated into the claimed composition.

Kompozície podľa vynálezu môžu tiež využívať jeden alebo niekoľko usmerňovacích prvkov, ktoré umožňujú zacieliť nukleovú komplexy do receptorov alebo ligandov nachádzajúcich sa na povrchu bunky. Ako príklad sa môže uviesť, že kompozícia podľa vynálezu môže obsahovať jednu alebo niekoľko protilátok riadených proti molekulám na bunkovom povrchu alebo alternatívne jeden alebo niekoľko ligandov membránových receptorov, ako napríklad inzulín, transferín, kyselina listová alebo ľubovoľný ďalší rastový faktor, cytokíny alebo vitamíny. Výhodne môže kompozícia využívať modifikované alebo nemodifikované lektíny na zacielenie špecifických polysacharidov na povrchu bunky alebo na susednej extracelulárnej matrici.The compositions of the invention may also utilize one or more targeting elements that allow targeting of the nucleic complexes to receptors or ligands found on the cell surface. By way of example, the composition of the invention may comprise one or more antibodies directed against cell-surface molecules or alternatively one or more membrane receptor ligands such as insulin, transferrin, folic acid or any other growth factor, cytokines or vitamins. Advantageously, the composition may utilize modified or unmodified lectins to target specific polysaccharides on the cell surface or on an adjacent extracellular matrix.

Rovnako sa môžu použiť proteíny s jednotkou RGD, cyklické alebo necyklické peptidy obsahujúce tandemové zoskupenie jednotiek RGD, ako aj polylyzínové peptidy. Nedávno boli tiež opísané prírodné alebo syntetické ligandové peptidy, ktoré sú výhodné konkrétne pre ich selektivitu k špecifickým bunkám a ktoré sú schopné účinne podporiť intemalizáciu v týchto bunkách (Bary a kol., Náture Medicíne, 2, 1996, 299 - 305). Tieto usmerňujúce činidlá sú všeobecne konjugované s uvažovaným katiónovým transfekčným činidlom.Proteins with an RGD unit, cyclic or non-cyclic peptides containing a tandem array of RGD units, as well as polylysine peptides can also be used. Recently, natural or synthetic ligand peptides have also been described which are particularly advantageous for their selectivity to specific cells and which are capable of effectively promoting intemalization in these cells (Bary et al., Nature Medicine, 2, 1996, 299-305). These targeting agents are generally conjugated to a contemplated cationic transfection agent.

Vynález sa tiež týka spôsobu prípravy nárokovaných kompozícií. Bližšie špecifikované, vynález sa tiež týka spôsobu prípravy kompozície obsahujúcej častice komplexu katiónového transfekčného činidla alebo činidiel a nukleovej kyseliny, ktorých veľkosť je stabilizovaná, ktorého podstata spočíva v tom, že sa katiónové transfekčné činidlo a nukleová kyselina skontaktujú v prítomnosti neionogénneho povrchovo aktívneho činidla použitého v množstve dostatočnom na stabilizáciu veľkosti takto vytvorených častíc nukleového komplexu rovnajúcej alebo menšej ako 160 nm.The invention also relates to a process for preparing the claimed compositions. More specifically, the invention also relates to a process for the preparation of a composition comprising particles of a cationic transfection agent or nucleic acid complex of stabilized size comprising contacting the cationic transfection agent and nucleic acid in the presence of a non-ionic surfactant used in the composition. in an amount sufficient to stabilize the size of the thus produced nucleotide complex particles equal to or less than 160 nm.

Kompozície podľa vynálezu sa môžu formulovať na topické, dermálne, perorálne, rektálne, vaginálne, parenterálne, intranazálne, intravenózne, intramuskuláme, subkutánne, intraokuláme alebo transdermálne alebo iné podanie. Výhodne farmaceutické kompozície podľa vynálezu obsahujú prijateľný nosič na injikovateľnú formuláciu, konkrétne na priamu injekciu na úrovni požadovaného orgánu alebo na podanie topickou cestou (na pokožku a/alebo sliznicovú membránu). Tieto kompozície môžu mať konkrétne formu izotonických sterilných roztokov alebo môžu mať formu suchých lyofilizovaných kompozícií, ktoré po pridaní sterilizovanej vody alebo fyziologického roztoku umožňujú opätovné vytvorenie injikovateľných roztokov. Dávky použitej nukleovej kyseliny na injekčné podanie, ako aj počet podaní sa môžu stanoviť v závislosti od rôznych faktorov, ku ktorým konkrétne patrí použitý spôsob podania, relevantná patológia, gén, ktorý sa má exprimovať alebo požadovaný čas liečby. Pokiaľ ide o spôsob podania, môže ísť buď o priamu injekciu do tkaniva alebo obehových ciest alebo opracovanie buniek v bunkovej kultúre a následná reimplantácia opracovaných buniek in vivo buď injekciou alebo transplantáciou.The compositions of the invention may be formulated for topical, dermal, oral, rectal, vaginal, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular or transdermal or other administration. Preferably, the pharmaceutical compositions of the invention comprise an acceptable carrier for an injectable formulation, in particular for direct injection at the desired organ level or for topical administration (to the skin and / or mucous membrane). In particular, the compositions may take the form of isotonic sterile solutions or may be in the form of dry lyophilized compositions which, upon addition of sterilized water or saline, allow the reconstituting of injectable solutions. The dosages of the nucleic acid used for injection as well as the number of administrations can be determined depending on various factors, in particular the route of administration used, the relevant pathology, the gene to be expressed or the desired time of treatment. Regarding the mode of administration, this may be either a direct injection into the tissue or circulatory system or the processing of cells in cell culture and subsequent reimplantation of the treated cells in vivo either by injection or transplantation.

Kompozície podľa vynálezu sú mimoriadne výhodné z terapeutického hľadiska. Pomocou týchto kompozícií bude v budúcnosti možné účinne podávať komplexy nukleových kyselín, ktoré majú vhodnú veľkosť a redukovaný nábojový pomer, čo je mimoriadne prospešné z hľadiska aplikácie in vivo. Pri použití kompozícií podľa vynálezu dochádza k výraznému obmedzeniu interakcie medzi sérom a nukleovým komplexom.The compositions of the invention are particularly advantageous from a therapeutic point of view. With these compositions, it will be possible in the future to effectively administer nucleic acid complexes having a suitable size and reduced charge ratio, which is particularly beneficial for in vivo application. The use of the compositions of the invention significantly reduces the interaction between the serum and the nucleus complex.

V nasledujúcej časti opisu bude vynález bližšie objasnený pomocou konkrétnych príkladov jeho uskutočnenie, pričom tieto príklady majú iba ilustračný charakter a vôbec neobmedzujú vlastný rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne vymedzený definíciou patentových nárokov.In the following, the invention will be explained in more detail by means of specific examples thereof, which examples are for illustrative purposes only and are not to be construed as limiting the scope of the invention, which is clearly defined by the definition of the claims.

Prehľad obrázkov na výkresochBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Na pripojených výkresoch: obrázok 1 znázorňuje vplyv poloxalkolu na zmenu veľkosti komplexov RPR 120535/DNA pri nábojovom pomere (+/-) 2,5 v závislosti od času, obrázok 2 znázorňuje vplyv poloxalkolu na zmenu veľkosti komplexov RPR 120531ZDNA pri nábojovom pomere (+/-) 2,5 v závislosti od času, obrázok 3 znázorňuje vplyv poloxalkolu na RPR 120535, obrázok 4 znázorňuje vplyv poloxalkolu na aktivitu luciferázy (RLU/5 μΐ lyzátu) komplexov RPR 120535/DNA pri nábojovom pomere (+/-) 2,5 a obrázok 5 v časti A schematicky znázorňuje štruktúru komplexov RPR 120535/DNA v neprítomnosti alebo v prítomnosti poloxalkolu a v časti B schematicky znázorňuje štruktúru komplexov BGTC/DNA v neprítomnosti a prítomnosti poloxalkolu.In the accompanying drawings: Figure 1 shows the effect of poloxalkol on scaling of RPR 120535 / DNA complexes at a charge ratio (+/-) of 2.5 versus time; Figure 2 shows the effect of poloxalkol on scaling of RPR 120531ZDNA complexes at a charge ratio (+/-) -) 2.5 versus time, Figure 3 shows the effect of poloxalkol on RPR 120535, Figure 4 shows the effect of poloxalkol on luciferase activity (RLU / 5 μΐ lysate) of RPR 120535 / DNA complexes at a charge ratio (+/-) of 2.5 and Figure 5 in Part A schematically depicts the structure of RPR 120535 / DNA complexes in the absence or presence of poloxalkol, and in Part B schematically depicts the structure of BGTC / DNA complexes in the absence and presence of poloxalkol.

Príklady uskutočnenia vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Materiálmaterial

Povrchovo aktívnym činidlom použitým v nasledujúcich príkladoch je poloxalkol so vzorcomThe surfactant used in the following examples is a poloxalcol of the formula

OH(CH₂CH₂O)₇₅(CH(CH₃)CH₂O)₃₀(CH₂CH₂O)₇₅H.OH (CH ₂ CH ₂ O) ₇₅ (CH (CH ₃ ) CH ₂ O) ₃₀ (CH ₂ CH ₂ O) ₇₅ H.

Táto zlúčenina sa uvádza pod obchodným označením Pluronic F68. Zásobný roztok poloxalkolu, ktorý sa použil v nasledujúcich príkladoch, je 10 % (hmotn./obj.) vodným roztokom poloxalkolu.This compound is referred to as Pluronic F68. The poloxalcol stock solution used in the following examples is a 10% (w / v) poloxalcol aqueous solution.

Nukleová kyselina použitá v príprave vzoriek je plazmid pXL2774 opísaný v medzinárodnej patentovej prihláške PCT/FR 96/01414. Tento plazmid je použitý v koncentrácii 0,7 mg/ml v pufri Tris/EDTA (10 mM/0,1 mM) s pH 7,5.The nucleic acid used in the preparation of the samples is the plasmid pXL2774 described in PCT / FR 96/01414. This plasmid is used at a concentration of 0.7 mg / ml in Tris / EDTA buffer (10 mM / 0.1 mM) at pH 7.5.

V príkladoch sa použili nasledovné katiónové lipidy: H₂N(CH₂)₃NH(CH₂)₄NH(CH₂)₃NHCH₂CoGlyN[(CH₂)₁₇CH₃]₂ (RPR 120535) (acetátová soľ) a H₂N(CH₂)₃NH(CH₂)₄NH(CH₂)₃NHCH₂CoArgN[(CH₂)₁₇CH₃]₂ (RPR 120531) (soľ kyseliny trifluóroctovej), pričom obidva tieto katiónové lipidy sú opísané v medzinárodnej patentovej prihláške PCT/FR 96/01774 a sú použité vo forme vodného roztoku v koncentrácii 5 mM po ich solubilizácii zahrievaním 25 minút na teplotu 50 °C a následnom ochladení na okolitú teplotu.The following cationic lipids were used in the examples: H ₂ N (CH ₂ ) ₃ NH (CH ₂ ) ₄ NH (CH ₂ ) ₃ NHCH ₂ CoGlyN [(CH ₂ ) ₁₇ CH ₃ ] ₂ (RPR 120535) (acetate salt) and H ₂ N (CH ₂ ) ₃ NH (CH ₂ ) ₄ NH (CH ₂ ) ₃ NHCH ₂ CoArgN [(CH ₂ ) ₁₇ CH ₃ ] ₂ (RPR 120531) (trifluoroacetic acid salt), both of these cationic lipids are described in PCT / FR 96/01774 and are used in the form of an aqueous solution at a concentration of 5 mM after solubilization by heating at 50 ° C for 25 minutes followed by cooling to ambient temperature.

Metódytechniques

Meranie hydrodynamického priemeru sa uskutočňuje s použitím zariadenia Coulter N4Plus s komôrkou z plastickej hmoty (štyri transparentné steny) naplnenou s 800 μΐ rôznych roztokov, pričom meranie sa uskutočňuje pri teplote 90 °C v monomodálnom móde.Hydrodynamic diameter measurements are performed using a Coulter N4Plus device with a plastic chamber (four transparent walls) filled with 800 μΐ of various solutions, measured at 90 ° C in monomodal mode.

Meranie fluorescencie sa uskutočňuje v zariadení Perkin Elmer LS50B s použitím excitačnej a emisnej vlnovej dĺžky 260 nm, resp. 590 nm. Šírky štrbiny pri excitácii a emisii sú nastavené na 5 nm. Hodnota fluorescencie sa zaznamená po pridaní etídiumbromidu na dosiahnutie finálnej koncentrácie 5 pg etídiumbromid/ml.Fluorescence measurements are performed in a Perkin Elmer LS50B using 260 nm excitation and emission wavelengths respectively. 590 nm. The slit widths for excitation and emission are set to 5 nm. The fluorescence value is recorded after addition of ethidium bromide to give a final concentration of 5 µg ethidium bromide / ml.

Experimenty metódou kryotransmisnej elektrónovej mikroskopie (cryo-TEM) sa uskutočnili s použitím 7 μΐ vzoriek obsahujúcich 0,5 mg DNA/ml, ktoré sa umiestnili na uhlíkom obalenej medenej mriežke pokrytej membránou s otvormi. Tieto mriežky sú potom ponorené do kvapalného etánu, aby sa kvapalná voda premenila na sklovitú vodu. Mriežka sa potom uloží do držiaka vzoriek chladeného kvapalným dusíkom a vloží do mikroskopu (Philips CM12) na vizuálne pozorovanie.Cryotransmission Electron Microscopy (cryo-TEM) experiments were performed using 7 μΐ samples containing 0.5 mg DNA / ml, which were placed on a carbon-coated copper lattice covered with a membrane with openings. The grids are then immersed in liquid ethane to convert the liquid water into glassy water. The grid is then placed in a liquid nitrogen cooled sample holder and placed in a microscope (Philips CM12) for visual observation.

Rôntgenografické experimenty pri malých uhloch sa uskutočňujú v synchrotrone (LURE) v Orsay (Francúzsko) na čiare D43. Pripravia sa vzorky majúce koncentráciu 0,5 mg DNA/ml a potom s tieto vzorky odstredia. Získané pelety sa uložia do komôrky, v ktorej sú vytvorené dve okienka z kaptonu. Germanium-obsahujúci monochromátor (reflexia 111) umožňuje selekciu vlnovej dĺžky 0,138 nm.Small angle X-ray experiments are performed in synchrotron (LURE) in Orsay (France) on line D43. Samples having a concentration of 0.5 mg DNA / ml were prepared and centrifuged. The pellets obtained are placed in a chamber in which two windows are formed from the capton. A germanium-containing monochromator (reflection 111) allows selection of a wavelength of 0.138 nm.

Transfckcia in vivo sa uskutočňuje injekciou 200 μΐ roztoku obsahujúceho 0,2 mg DNA/ml kombinovanej s katiónovým lipidovým vektorom do chvostovej žily 30 dní starých myší. 24 hodín po tejto injekcii sa šetrným spôsobom usmrtia, potom sa im vyberú jednotlivé orgány (pľúca, pečeň, srdce, obličky, slezina). Tieto orgány sa potom dezintegrujú v pufri používanom na lýzu s použitím zariadenia Ultraturax. Takto získané dezintegrované produkty sa potom odstredia a zo supematantov so odoberie 10 μΐ vzoriek na stanovenie aktivity luciferázy.In vivo transfection is performed by injecting 200 μΐ of a solution containing 0.2 mg DNA / ml combined with a cationic lipid vector into the tail vein of 30 day old mice. They are sacrificed 24 hours after this injection, then the individual organs (lungs, liver, heart, kidneys, spleen) are removed. These organs are then disintegrated in the lysis buffer using an Ultraturax. The disintegrated products thus obtained are then centrifuged and 10 μΐ of luciferase activity is taken from the supernatants.

Príklad 1Example 1

Vplyv poloxalkolu na veľkosť komplexov RRP 120535/DNAEffect of poloxalkol on the size of RRP 120535 / DNA complexes

Plazmid (10 pg/ml) sa pridá do roztoku obsahujúceho 150 mM chlorid sodný a rôzne koncentrácie poloxalkolu. Potom sa pridá lipofekčné činidlo RPR 120535 na dosiahnutie nábojového pomeru (+/-) 2,5. Následne sa meria veľkosť komplexov fotónovou korelačnou spektroskopiou opísanou v odseku venovanom použitým metódam. Výsledky sú znázornené na obr. 1.Plasmid (10 µg / ml) is added to a solution containing 150 mM sodium chloride and various concentrations of poloxalcol. Then, lipophilic reagent RPR 120535 is added to achieve a charge ratio (+/-) of 2.5. Subsequently, the size of the complexes is measured by photon correlation spectroscopy described in the section on the methods used. The results are shown in FIG. First

Z výsledkov je zrejmé, že pri neprítomnosti poloxalkolu (O) sa veľkosť častíc mení v priebehu niekoľkých hodín z 274 nm na najviac 1000 nm. Po niekoľkých hodinách inkubácie sa môže pozorovať vznik zrazeniny.The results show that in the absence of poloxalcol (0) the particle size changes from 274 nm to a maximum of 1000 nm within a few hours. After several hours of incubation, a precipitate may be observed.

Naopak v prítomnosti 0,1 % poloxalkolu (+) sa môže pozorovať zmenšenie veľkosti častíc komplexu, pričom táto veľkosť zostáva stabilná pri koncentrácii 0,8 % (o) a 1 % (Δ) poloxalkolu a nemení sa za hranicu 150 nm.Conversely, in the presence of 0.1% poloxalcol (+), a reduction in the particle size of the complex may be observed, which size remains stable at a concentration of 0.8% ()) and 1% (Δ) of poloxalcol and does not change beyond 150 nm.

Pri inkubácii samotného lipofekčného činidla s 1 % (hmotn./obj.) poloxalkolu nedochádza k vytvoreniu častíc, ktoré by boli detegovateľné metódou kvázi-elastickej difúzie svetla (Quasi-Elastic Diffusion). Rovnako aj pri inkubácii DNA s 1 % poloxalkolom sa nedetegovala tvorba častíc.Incubation of the lipofectant alone with 1% (w / v) poloxalcol does not produce particles that are detectable by the Quasi-Elastic Diffusion method. Likewise, particle incubation was not detected when DNA was incubated with 1% poloxalcol.

Príklad 2Example 2

Vplyv poloxalkolu na veľkosť komplexov RPR 1205 31/DNAEffect of poloxalkol on the size of RPR 1205 31 / DNA complexes

V rámci tohto príkladu sa opakuje postup opísaný v príklade 1 s výnimkou spočívajúcou v tom, že sa použije katiónový lipid RPR 120531.In this example, the procedure described in Example 1 was repeated except that the cationic lipid RPR 120531 was used.

Plazmid (10 μΐ) sa pridá do roztoku obsahujúceho 150 mM chlorid sodný s rôznymi koncentráciami poloxalkolu. Potom sa pridá lipofekčné činidlo RPR 120531 na dosiahnutie nábojového pomeru (+/-) 2,5. Následne sa meria veľkosť komplexov s použitím fotónovej korelačnej spektroskopie (Coulter N4Plus). Získané výsledky sú znázornené na obr. 2.Plasmid (10 μΐ) is added to a solution containing 150 mM sodium chloride at various concentrations of poloxalcol. Then lipophilic reagent RPR 120531 is added to achieve a charge ratio (+/-) of 2.5. The size of the complexes is then measured using photon correlation spectroscopy (Coulter N4Plus). The results obtained are shown in FIG. Second

Zo získaných výsledkov je zrejmé, že v neprítomnosti poloxalkolu sa veľkosť komplexov RPR 120531/DNA mení v priebehu niekoľkých hodín z 234 nm na 590 nm, zatiaľ čo táto veľkosť zostáva stabilná v prítomnosti 0,5 % (Δ) a 0,9 % (o) poloxalkolu.From the results obtained, it is evident that in the absence of poloxalcol, the size of the RPR 120531 / DNA complexes varies from 234 nm to 590 nm within a few hours, while remaining stable in the presence of 0.5% (Δ) and 0.9% ( o) poloxalcol.

Príklad 3Example 3

Kontrola stupňa kondenzácie DNA s lipofekčným činidlom prítomnosti a neprítomnosti poloxalkoluChecking the degree of DNA condensation with the lipofection agent in the presence and absence of poloxalcol

V rámci tohto príkladu sa určuje, či častice získané v prítomnosti poloxalkolu sú skutočne častice odvodené z kombinácie (kondenzácie) DNA s katiónovým lipidom. Preto sa uskutočnili experimenty, pri ktorých sa vniesla sonda, ktorá fluoreskuje v prípade, že sa nachádza v prítomnosti voľnej DNA. Miera uvedenej fluorescencie je vysoká v prípade, keď jc DNA k dispozícii vo voľnom stave,In this example, it is determined whether the particles obtained in the presence of poloxalcol are indeed particles derived from the combination (condensation) of DNA with a cationic lipid. Therefore, experiments were carried out in which a probe was introduced that fluoresces when it is in the presence of free DNA. The degree of fluorescence is high when the DNA is available in the free state,

SK 282685 Β6 ale naopak nízka, keď je DNA nedostupná vzhľadom na to, že je kondenzovaná s katiónovým lipidom. Získané výsledky sú znázornené na obr. 3.However, low when DNA is unavailable because it is condensed with a cationic lipid. The results obtained are shown in FIG. Third

Pozorujú sa miery fluorescencie získané po kombinácii DNA s katiónovým lipidom v prítomnosti a v neprítomnosti poloxalkolu. Predovšetkým je zrejmé, že fluorescencia etídiumbromidu zavedeného do DNA nie je modifikovaná prítomnosťou alebo neprítomnosťou 1 % poloxalkolu. Miery fluorescencie komplexov katiónový lipid/DNA (nábojový pomer (+/-) 2,5) v prítomnosti alebo neprítomnosti 1 % poloxalkolu sú v skutočnosti rovnakého poriadku. Zvyšková hodnota fluorescencie ukazuje, že DNA nie je pre uvedenú fluorescenčnú sondu dostupná.Fluorescence rates obtained after combining DNA with a cationic lipid are observed in the presence and absence of poloxalcol. In particular, it is apparent that the fluorescence of ethidium bromide introduced into the DNA is not modified by the presence or absence of 1% poloxalcol. The fluorescence rates of the cationic lipid / DNA complexes (charge ratio (+/-) 2.5) in the presence or absence of 1% poloxalcol are in fact of the same order. The residual fluorescence value indicates that DNA is not available for the fluorescent probe.

Záverom teda možno konštatovať, že poloxalkol takto nebráni tomu, aby kombinácia DNA s katiónovým lipidom prebehla normálnym spôsobom.In conclusion, poloxalcol thus does not prevent the combination of DNA with a cationic lipid from proceeding normally.

Príklad 4Example 4

Transfekcia in vitro s použitím DNA alebo RPR 120535 obsahujúcich 1 % poloxalkolIn vitro transfection using DNA or RPR 120535 containing 1% poloxalcol

V rámci tohto príkladu je snaha určiť vplyv poloxalkolu v prípade, že je zmiešaný so samotnou DNA alebo so samotným katiónovým lipidom. Preto sa pripravili nasledovné vzorky:In this example, an attempt is made to determine the effect of poloxalcol when mixed with DNA alone or with a cationic lipid alone. Therefore, the following samples were prepared:

Vzorka 1: 10 pg DNA/ml v prostredí obsahujúcom 300 mM NaCl a 1 % (hmotn./obj.) poloxalkolu.Sample 1: 10 µg DNA / ml in media containing 300 mM NaCl and 1% (w / v) poloxalcol.

Vzorka 2: 60 μΜ RPR 120535 v prostredí obsahujúcom 300 mM NaCl a 1 % poloxalkolu.Sample 2: 60 μΜ RPR 120535 in an environment containing 300 mM NaCl and 1% poloxalcol.

Tieto vzorky sa pripravia tak, že sa zmiešajú v uvedenom poradí v prípade vzorky 1: voda, NaCl, DNA a poloxalkol a v prípade vzorky 2: voda, NaCl, poloxalkol a RPR 120535, a to v množstvách uvedených v nasledovnej tabuľke I.These samples are prepared by mixing, respectively, for Sample 1: water, NaCl, DNA, and poloxalcol, and for Sample 2: water, NaCl, poloxalcol, and RPR 120535, in the amounts shown in the following Table I.

Tabuľka ITable I

rest rest H_ZOH _Z O NaCl (5M) NaCl (5M) DNA (0,7 mg/ml) DNA (0.7 mg / ml) Poloxalkol (10%) Poloxalkol (10%) RPB120535 (5 rranol) RPB120535 (5 rranol) 1 (μΐ) 1 (μΐ) 413 413 30 30 30 30 0 0 2 (jil) 2 (jil) 414 414 30 30 0 0 50 50 6 6

Biologická aktivita týchto dvoch vzoriek sa testuje na bunkách NIH 4T3. Do jamiek 24-jamkovej platničky sa pridá vždy objem 50 pl vzorky.The biological activity of the two samples was tested on NIH 4T3 cells. A volume of 50 µl is added to the wells of a 24-well plate.

Transfekcia sa uskutočňuje v neprítomnosti fetálneho teľacieho séra. Fetálne teľacie sérum sa pridá 2 hodiny po pridaní komplexov.Transfection is performed in the absence of fetal calf serum. Fetal calf serum is added 2 hours after the addition of the complexes.

Získané výsledky ukazujú, že k prenosu génov nedochádza pri nekomplexovanej DNA v prítomnosti 1 % poloxalkolu a v neprítomnosti 10 % fetálneho teľacieho séra.The results obtained show that gene transfer does not occur with uncomplexed DNA in the presence of 1% poloxalcol and in the absence of 10% fetal calf serum.

Okrem toho stanovenie celkových proteíov ukazuje, že tu neexistuje zjavná toxicita.Furthermore, the determination of total proteins indicates that there is no apparent toxicity.

Príklad 5Example 5

Transfekcia in vitro s použitím roztokov komplexov RPR 120535-lipofekčného činidla s DNA stabilizovaných rôznymi koncentráciami poloxalkoluIn vitro transfection using solutions of RPR 120535-lipofectant-DNA complexes stabilized with various concentrations of poloxalcol

V rámci tohto príkladu je snaha vyhodnotiť vplyv stabilizácie častíc poloxalkolom na účinnosť transfekcie s použitím uvedených častíc v prítomnosti poloxalkolu. Preto sa pripravili vzorky obsahujúce rôzne koncentrácie poloxalkolu.In this example, an attempt is made to evaluate the effect of poloxalcol stabilization of particles on transfection efficiency using said particles in the presence of poloxalcol. Therefore, samples containing different concentrations of poloxalcol were prepared.

Pripravili sa štyri vzorky s nábojovým pomerom (-/-) 2,5 v prostredí obsahujúcom 300 mM NaCl a rôzne koncentrácie poloxalkolu (0, 0,5 %, 0,8 % a 1 % hmotn./obj.):Four samples were prepared with a charge ratio (- / -) of 2.5 in an environment containing 300 mM NaCl and various concentrations of poloxalcol (0, 0.5%, 0.8% and 1% w / v):

vzorka 1: nábojový· pomer (+/-) 2,5, 300 mM NaCl vzorka 2: nábojový pomer (+/-) 2,5, 300 mM NaCl a 0,5 % poloxalkol vzorka 3: nábojový pomer (+/-) 2,5, 300 mM NaCl a 0,8 % poloxalkol vzorka 4: nábojový pomer (+/-) 2,5, 300 mM NaCl a 1 % poloxalkolsample 1: charge ratio (+/-) 2.5, 300 mM NaCl sample 2: charge ratio (+/-) 2.5, 300 mM NaCl and 0.5% poloxalkol sample 3: charge ratio (+/-) ) 2.5, 300 mM NaCl and 0.8% poloxalkol sample 4: charge ratio (+/-) of 2.5, 300 mM NaCl and 1% poloxalkol

Tieto vzorky sa pripravili zmiešaním v nasledovnom poradí: voda, NaCl, DNA, poloxalkol a RPR 120535 a s použitím množstva uvedenom v nasledovnej tabuľke II:These samples were prepared by mixing in the following order: water, NaCl, DNA, poloxalcol and RPR 120535, and using the amount shown in Table II below:

Tabuľka IITable II

Test Test Ι·Ι_ΖΟΙ · Ι _Ζ Ο NaCl (5Η) NaCl (5Η) DNA (0,7 ítg/ml) DNA (0.7 µg / ml) Poloxalkol (10%) Poloxalkol (10%) RPR12O535 (5 mmol) RPR12O535 (5 mmol) 1 1 (μΐ) (Μΐ) 737 737 48 48 11,4 11.4 0 0 4 4 2 2 (μΐ) (Μΐ) 697 697 48 48 11,4 11.4 40 40 4 4 '3 '3 (μΐ) (Μΐ) 672 672 48 48 11,4 11.4 64 64 4 4 4 4 (μΐ) (Μΐ) 657 657 48 48 11,4 11.4 80 80 4 4

* Vzorka 1 patrí do koncentračného rozsahu katiónového lipidu, kde nedochádza k stabilizácii častíc v roztoku, to znamená, že častice vzájomne vytvárajú agregáty a veľké zhluky agregátov, ktoré majú veľký hydrodynamický priemer (väčší ako 1000 nm).* Sample 1 belongs to the concentration range of the cationic lipid where particles in solution do not stabilize, i.e. the particles form aggregates and large aggregates of aggregates that have a large hydrodynamic diameter (greater than 1000 nm).

* Vzorka 2 má rovnaký nábojový pomer katiónový lipid/DNA ako vzorka 1, pričom sa však táto zmes pripraví v prítomnosti 0,5 % (hmotn./obj.) poloxalkolu; napriek tomu táto koncentrácia poloxalkolu je nedostatočná na zaistenie úplnej stabilizácie častíc (pozri príklad 1: vplyv neionogénneho polyméru na veľkosť komplexov RPR 120535/DNA).* Sample 2 has the same cationic lipid / DNA charge ratio as Sample 1, but this mixture is prepared in the presence of 0.5% (w / v) poloxalcol; however, this concentration of poloxalcol is insufficient to ensure complete stabilization of the particles (see Example 1: effect of a non-ionic polymer on the size of the RPR 120535 / DNA complexes).

* Vzorky 3 a 4 sú stabilné, pričom hydrodynamický priemer častíc v tomto prípade zostáva rovnajúci sa asi 150 nm.* Samples 3 and 4 are stable, the hydrodynamic diameter of the particles in this case remaining equal to about 150 nm.

Biologická aktivita jednotlivých formulácií sa testuje na bunkách NIH 3T3. Do jamiek platničky sa pridá objem 50 μΐ jednotlivých vzoriek (obsahujúcich 10 pg DNA/ml). Transfekcia sa uskutočňuje v neprítomnosti fetálneho teľacieho séra. Teľacie fetálne sérum sa pridá 2 hodiny po pridaní komplexov. Získané výsledky sú uvedené na obr. 4.The biological activity of the individual formulations is tested on NIH 3T3 cells. Add 50 μ 50 of each sample (containing 10 µg DNA / ml) to the wells of the plate. Transfection is performed in the absence of fetal calf serum. Calf fetal serum is added 2 hours after the addition of the complexes. The results obtained are shown in FIG. 4th

Z výsledkov uvedených na obr. 4 je zrejmé, že poloxalkol, a to bez ohľadu na jeho koncentráciu, nezhoršuje in vitro transfekciu v bunkách NIH 3T3. Poloxalkol nemodifikuje transfekčné vlastnosti komplexov RPR 120535/DNA pri nábojovom pomere (+/-) 2,5 v neprítomnosti fetálneho teľacieho séra.From the results shown in FIG. 4, it is evident that poloxalcol, irrespective of its concentration, does not impair in vitro transfection in NIH 3T3 cells. Poloxalcol does not modify the transfection properties of RPR 120535 / DNA complexes at a charge ratio (+/-) of 2.5 in the absence of fetal calf serum.

Príklad 6Example 6

Stanovenie štruktúry komplexov RPR 120535/DNA, BGTC/DNA a BGTC/DOPE/DNA stabilizovaným poloxalkolomStructure determination of RPR 120535 / DNA, BGTC / DNA and BGTC / DOPE / DNA complexes with stabilized poloxalcol

V rámci tohto príkladu sa stanovila štruktúra komplexov katiónového lipidového transfekčného činidla s použitím rontgenoskopie s malými uhlami a transmisnej elektrónovej mikroskopie.In this example, the structure of the cationic lipid transfection reagent complexes was determined using low angle X-ray scanning and transmission electron microscopy.

Obr. 5Λ sa vzťahuje ku komplexom RPR 120535/DNA. Štruktúrou získanou v neprítomnosti a prítomnosti poloxalkolu je lameláma štruktúra, v ktorej je DNA uložená medzi lipidovými dvojvrstvami, ktorých periodicita je 8 nm. Prítomnosť poloxalkolu umožňuje získať komplexy s malou veľkosťou, zatiaľ čo v neprítomnosti poloxalkolu sa vytvoria zrazeninové častice, ktorých veľkosť je väčšia ako 1000 nm.Fig. 5Λ refers to RPR 120535 / DNA complexes. The structure obtained in the absence and presence of poloxalcol is a lamellar structure in which the DNA is deposited between lipid bilayers whose periodicity is 8 nm. The presence of poloxalcol makes it possible to obtain complexes of small size, whereas in the absence of poloxalcol, precipitate particles of greater than 1000 nm are formed.

Obr. 5B znázorňuje štruktúry získané pre katiónový lipid BGTC (opísaný v medzinárodnej patentovej prihláške WO97/31935). V tomto prípade sa rovnako získa v prítomnosti alebo neprítomnosti poloxalkolu lamelárna štruktúra, ktorej periodicita je 6,5 nm. Prítomnosť poloxalkolu rovnako umožňuje v tomto prípade získať komplexy s malou veľkosťou. Rovnaké výsledky sa získajú pre komplexy obsahujúce alebo neobsahujúce produkt DOPE ako prísadu.Fig. 5B shows structures obtained for the cationic lipid BGTC (described in International Patent Application WO97 / 31935). In this case, a lamellar structure having a periodicity of 6.5 nm is also obtained in the presence or absence of poloxalcol. The presence of poloxalcol also makes it possible in this case to obtain complexes of small size. The same results are obtained for complexes containing or not containing the DOPE product as an additive.

Záverom sa môže teda uviesť, že prídavok poloxalkolu nebráni normálnemu vytvoreniu kombinácie DNA s katiónovým lipidom, ale iba modifikuje koloidný stav tohto komplexu.In conclusion, the addition of poloxalcol does not prevent the normal formation of a combination of DNA with a cationic lipid, but merely modifies the colloidal state of the complex.

Príklad 7Example 7

Transfekcia in vivo s použitím systémovej injekcie komplexov katiónového lipidu s DNA stabilizovaných poloxalkolomIn vivo transfection using systemic injection of poloxalcol-stabilized cationic lipid DNA complexes

1) RPR 120535/DNA/F681) RPR 120535 / DNA / F68

V rámci tohto príkladu sa porovnali účinnosti prenosu génov po systémových injekciách precipitovaných komplexov RPR 120535/DNA a rovnakých takýchto komplexov stabilizovaných pridaním produktu Pluronic F68. Uvedená tabuľka ukazuje, že keď sú komplexy vytvorené v neprítomnosti produktu F68, môže sa pozorovať expresia iba v pľúcach. Naopak, v prípade, keď sú častice komplexov koloidné stabilizované pridaním produktu F68, zvýši sa aktivita luciferázy o jeden poriadok v pľúcach, pričom expresia sa môže pozorovať aj v ostatných tkanivách (pečeň, srdce).In this example, gene transfer efficiency after systemic injection of precipitated RPR 120535 / DNA complexes and the same such complexes stabilized by the addition of Pluronic F68 was compared. The table below shows that when complexes are formed in the absence of F68, expression can only be observed in the lung. Conversely, when the complex particles are stabilized by the addition of F68, luciferase activity is increased by one order in the lung, and expression can also be seen in other tissues (liver, heart).

Tabuľka IIITable III

Lipid lipid RPR 120535 RPR 120535 Formulácie formulations 0% F68 0% F68 13% F68 14% F68 myši mice balbc BalbC balbc BalbC plúca lungs 2 ± 0,9 2 ± 0.9 14 ± 0,9 14 ± 0.9 pečeň liver 0 0 2 t 3 2 t 3 obličky kidney 0 0 0 0 srdce heart 0 0 1 ± 0,4 1 ± 0.4

2) BGTC/DOPE/DNA/F682) BGTC / DOPE / DNA / F68

Experimenty zhodné s experimentmi, ktoré boli opísané, sa uskutočnili s použitím iného lipidu, ktorým je v tomto prípade lipid BGTC. Aj v tomto prípade sa získali rovnaké výsledky, a to zlepšenie prenosu génov v pľúcach a merateľná expresia v pečeni, srdci a obličkách. Tieto výsledky sa získali s použitím rôznych kmeňov myší (balbc, C57B16 a C57B16, ktoré sú nedostatočné na Apoliproteín E). Je pozoruhodné, že rovnaké transfekčné úrovne sa získali tak pre myši C57B16, ktoré sú normálne, ako aj pre myši C57B16, ktoré sú nedostatočné na Apolipoproteín E, a ktoré majú veľmi vysokú hladinu lipidov, t. j. desaťkrát vyššiu ako normálne myši. Vzhľadom na to, že sa tu používajú nevírusové lipidové vektory, dalo by sa teda očakávať, že tieto komplexy sa mohli destabilizovať prítomnosťou veľkého množstva iných endogénnych lipidov. Výsledky transfekcie komplexov BGTC/DOPE/DNA in vivo uskutočnené v neprítomnosti alebo v prítomnosti poloxalkolu sú uvedené v nasledujúcej tabuľke IV:Experiments identical to those described were performed using another lipid, in this case BGTC lipid. Again, the same results were obtained, namely, improved gene transfer in the lung and measurable expression in the liver, heart and kidney. These results were obtained using various strains of mice (balbc, C57B16 and C57B16, which are deficient in Apoliprotein E). Remarkably, the same transfection levels were obtained for both C57B16 mice that are normal and C57B16 mice that are deficient in Apolipoprotein E and that have very high lipid levels, i. j. ten times higher than normal mice. Since non-viral lipid vectors are used herein, it would be expected that these complexes could be destabilized by the presence of a large number of other endogenous lipids. The results of in vivo transfection of BGTC / DOPE / DNA complexes performed in the absence or presence of poloxalcol are shown in Table IV below:

Tabuľka IVTable IV

Lipid lipid BGTC/DOPE BGTC / DOPE Formulácie formulations 0% F68 0% F68 4% F68 4% F68 Myši mice balbc BalbC balbc BalbC C57B16 C57B16 C57B16KoApoE C57B16KoApoE plúca lungs 6,7 ± 2,8 6.7 ± 2.8 86,5 ± 65,4 86.5 ± 65.4 220 ± 99 220 ± 99 201 + 12 201 + 12 pečeň liver 0 0 11,4 ± 11,5 11.4 ± 11.5 47 i 26 47 i 26 47 i 23 47 i 23 obličky kidney 0 0 0,34 ± 0,16 0.34 ± 0.16 1,8 ± 0,9 1.8 ± 0.9 2,2 ± 0,1 2.2 ± 0.1 srdce heart 0 0 0,74 ± 1,05 0.74 ± 1.05 0,73 i 0,7 0.73 i 0.7 0,6 ± 0,0 0.6 ± 0.0

Príklad 8Example 8

Použitie iných neionogénnych povrchovo aktívnych činidielUse of other nonionic surfactants

V rámci tohto príkladu sa testovali aj ďalšie neionogénne povrchovo aktívne činidlá, ktorými sú polyetylénglykoldendrimér, polyoxyetylénalkohol a polyoxyetylénnonylfenyléter. Tieto neionogénne povrchovo aktívne činidlá majú rovnakú schopnosť ako produkt F68 stanilizovať komplexy katiónový lipid/DNA. Použitým katiónovým lipidom tu bol lipid RPR 120535.Other nonionic surfactants, such as polyethylene glycol dendrimer, polyoxyethylene alcohol and polyoxyethylene nonylphenyl ether, were also tested in this example. These nonionic surfactants have the same ability as the product F68 to stabilize cationic lipid / DNA complexes. The cationic lipid used here was lipid RPR 120535.

1) Polyetylglykoldendriméry1) Polyethyl glycol dendrimers

Použil sa dendrimér obsahujúci 1 benzylpolyéterovú hlavu generácie 2, na ktorú je naštepený polyetylénglykol (PEG) s molekulovou hmotnosťou 5000 Da (označovaný ako SAS11), a iný dendrimér rovnakého typu, ktorý však obsahuje 2 benzylpolyéterové hlavy naštepené na PEG s molekulovou hmotnosťou 11 000 Da (označovaný ako SAS9). Z ďalej zaradenej tabuľky IV je zrejmé, že s použitím týchto dendrimérov od koncentrácie 0,02 % (hmotn./obj.) a pri koncentráciách vyšších už nedochádza k vytváraniu zrazenín transfekčných komplexov s mikrónovou veľkosťou, ale dochádza k vzniku častíc, ktoré majú priemer rovnajúci sa alebo menší ako 100 nm.A dendrimer containing 1 generation 2 benzylpolyether head was grafted onto a 5000 Da polyethylene glycol (PEG) grafted (referred to as SAS11) and another dendrimer of the same type, but containing 2 benzylpolyether heads grafted on 11,000 Da PEG (referred to as SAS9). From Table IV below, it is apparent that using these dendrimers at a concentration of 0.02% (w / v) and at higher concentrations no longer clots the transfection complexes of micron size, but produces particles having a diameter of equal to or less than 100 nm.

2) Polyoxyetylénalkohol2) Polyoxyethylene alcohol

Tento produkt, ktorý' sa tiež označuje ako „Brij” a obsahuje 100 oxyetylénov v hydrofilnej časti, umožňuje získať po jednej hodine komplexy RPR 120535/DNA, ktoré majú priemer menší ako 100 nm.This product, also referred to as "Brij" and containing 100 oxyethylenes in the hydrophilic portion, makes it possible to obtain, after one hour, RPR 120535 / DNA complexes having a diameter of less than 100 nm.

3) Polyoxyetylénnonylfenyléter3) Polyoxyethylene nonylphenyl ether

Tento produkt tiež umožňuje koloidné stabilizovať transfekčné komplexy RPR 120535/DNA. Priemer častíc uvedeného komplexu sa tiež rovná asi 100 nm.This product also allows colloidal stabilization of RPR 120535 / DNA transfection complexes. The particle diameter of the complex is also about 100 nm.

Nasledujúca tabuľka uvádza priemer v nm komplexov RPR 120535/DNA majúcich nábojový pomer, 75 (+/-) a obsahujúcich 0,25 mg DNA/ml v 150 mM NaCl, ktoré sú stabilizované rôznymi neionogénnymi povrchovo aktívnymi činidlami.The following table shows the mean in nm of RPR 120535 / DNA complexes having a charge ratio of 75 (+/-) and containing 0.25 mg DNA / ml in 150 mM NaCl that are stabilized by various nonionic surfactants.

Tabuľka VTable V

Polymér (hmotn./obj.) Polymer (w / v) 0,05% 0,05% 0,1% 0,1% 0,2% 0.2% Brij 700 Brij 700 114 nm 114 nm 69 nm 69 nm 14 nm 14 nm SAS11 SAS11 152 nm 152 nm 99 nm 99 nm 71 nm 71 nm SAS9 SAS9 104 nm 104 nm 85 nm 85 nm 75 nm 75 nm Polyoxyetylénnonylfenyléter polyoxyethylenenonylphenylether 142 nm 142 nm 132 nm 132 nm 111 nm 111 nm

Pri všetkých formuláciách stabilizovaných uvedenými rôznymi neionogénnymi povrchovo aktívnymi činidlami sa stanovila miera kondenzácie DNA s katiónovým lipidom s použitím fluorescenčných meraní. Výsledky týchto meraní ukazujú, že prítomnosť týchto neionogénnych povrchovo aktívnych činidiel na povrchu komplexov katiónový lipid/DNA nemodifikujú mieru kondenzácie DNA s katiónovými lipidmi (výsledky nie sú uvedené).For all formulations stabilized by the various different nonionic surfactants, the rate of DNA condensation with the cationic lipid was determined using fluorescence measurements. The results of these measurements show that the presence of these nonionic surfactants on the surface of the cationic lipid / DNA complexes does not modify the rate of DNA condensation with the cationic lipids (results not shown).

Claims

PATENT CLAIMS

A composition comprising particles of lamellar complexes of a cationic transfection agent or agents and a nucleic acid and comprising at least one nonionic surfactant in an amount of 0.01 to 10% w / v. to obtain stabilized lamellar complexes having a diameter less than or equal to 160 nm.

The composition of claim 1, wherein the nonionic surfactant comprises at least one hydrophobic segment and at least one hydrophilic segment.

3. The composition of claim 2, wherein the hydrophobic segment is selected from the group consisting of aliphatic chains, polyoxyalkylenes, alkylidene polyesters, polyethylene glycols having a benzyl polyether origin, and cholesterol.

4. The composition of claim 2 wherein the hydrophilic segment is selected from the group consisting of polyoxyalkylenes, polyvinyl alcohols, polyvinylpyrrolidones, and saccharides.

Composition according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the surfactant is a polyoxyalkylene of the formula:

HO (CH ₂ CH ₂ O) _and (CH (CH ₃ ) CH ₂ O) _b (CH ₂ CH ₂ O) _c H, wherein a, b and c are, independently of each other, an integer of 20 to 100.

6. A composition according to claim 5, wherein the surfactant is a compound of the formula:

OH (CH ₂ CH ₂ O) _and (CH (CH ₃ ) CH ₂ O) _b (CH ₂ CH ₂ O) _c H, in which a is an integer of 75, b is an integer of 30 and c is an integer of 75.

Composition according to any one of claims 1 to 4, characterized in that it contains as a surfactant a compound selected from the group of polyethylene glycols with a dentritic benzyl polyether chain origin.

Composition according to one of Claims 1 to 4, characterized in that it contains a compound from the group of polyoxyethylene alcohols as surfactant.

Composition according to any one of claims 1 to 4, characterized in that it contains polyoxyethylene nonylphenyl ether as the surfactant.

10. The composition of claim 1 wherein the surfactant is present in an amount of 0.02 to 5% w / v.

11. The composition of claim 1 wherein the cationic transfection agent is a lipofection agent.

12. The composition of claim 11, wherein the lipofectant is an amphiphilic molecule comprising at least one lipophile region associated or not associated with a hydrophilic region.

Composition according to claim 11 or 12, characterized in that it is a lipofection agent comprising at least one polyamine region of the general formula:

H ₂ N - (- (CH) _m -NH-) nH, in which m is an integer greater than or equal to 2 and n is an integer greater than or equal to 1, wherein m may vary between different carbon groups between two amines and said polyamine region being covalently associated with a lipophilic region of the saturated or unsaturated hydrocarbon chain type of cholesterol or a natural or synthetic lipid capable of forming a lamellar or hexagonal phase.

The composition of claim 13, wherein the polyamine region is represented by spermine or one of its analogues that has retained its ability to bind nucleic acid.

Composition according to claim 11 or 12, characterized in that it comprises a lipofectant of the general formula:

H ₂ N - (- (CH) _m -NH-) _n -H, wherein R denoting the lipophilic region represents a group of the formula:

wherein X and X 'are each independently O, methylene - (CH ₂ ) _q -, wherein q is 0, 1, 2 or 3, or an amino group -NH- or -NR'-, wherein R' represents an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, Y and Y 'are independently from each other a methylene group, a carbonyl group or a C = S group, R ³ , R ⁴ and R ⁵ independently represent a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted alkyl group 1-4 carbon atoms, wherein p is from 0 to 5, R ⁶ is a cholesterol derivative or an alkylamino group of the formula -NR ¹ R ² , wherein R ¹ and R ² are independently of each other a straight or branched aliphatic group containing 12 to 12 carbon atoms; up to 22 carbon atoms.

A composition according to claim 11 or 15, characterized in that it comprises a lipofectant of the formula: wherein R ¹ , R ² and R ³ are each independently hydrogen or - (CH ₂ ) _q -NRR ', wherein q may vary from 1 to 6, independently of each other in the groups R ¹ , R ² and R ^3, and R and R 'are each independently hydrogen or - (CH ₂ ) _q -NH ₂ , wherein q 'may vary from 1 to 6, independently of each other in the groups R and R', m, n and p independently of one another represent an integer which may vary from 0 to 6, provided that when n is greater than 1, then m may have different values and R ³ may have different meanings within the foregoing general formula, and R ⁴ represents a group of the general formula:

wherein R ⁶ and R ⁷ are each independently hydrogen or a saturated or unsaturated aliphatic group containing 10 to 22 carbon atoms, wherein at least one of R ⁶ or R ^{7 is} not a hydrogen atom, u is an integer of 0 to 10, wherein: when u represents an integer greater than 1, then R ⁵ , X, Y and r may have different meanings in different units [X- (CHR ⁵ ) _r -Y], X represents an oxygen atom or a sulfur atom or an amine group, which is or is not monoalkylated, Y represents a carbonyl group or a methylene group, R ⁵ represents a hydrogen atom or a natural amino acid side chain which is optionally substituted, and ar represents an integer from 1 to 10, where r is 1, R ⁵ represents a substituted or unsubstituted natural amino acid side chain, and when r is greater than 1, R ³ represents a hydrogen atom.

Composition according to either of claims 11 or 12, characterized in that the lipofectant is a cationic lipid carrying one or more guanidinium and / or amidinium groups.

The composition of any one of claims 1 to 10, wherein the cationic transfection agent is a cationic polymer.

The composition of claim 18, wherein the cationic polymer is a compound of formula (I):

(I), wherein R may be hydrogen or a group of the formula:

- (CH ₂ ) _n -N-1 ^q , where n is an integer of 1 to 10, and they write integers, with the sum p + q having a value such that the average molecular weight of the polymer is between 100 and 10 ⁷ Da.

A composition according to claim 18 or 19, characterized in that it comprises polyethyleneimine having an average molecular weight of 50,000 Da (PEI50K), polyethyleneimine having an average molecular weight of 22,000 Da (PEI22K), or polyethyleneimine having an average molecular weight of 800,000 Da (PEI800K). .

The composition according to any one of claims 1 to 11, wherein the cationic transfection agent is preferably selected from the group consisting of lipofectamine, dioctadecylaminospermine (DOGS). palmitoylphosphatidylethanolamine-5-carboxyspermylamide (DPPES),

2,5-bis (3-aminopropylamino) pentyl (dioctadecylcarbamoylmethoxy) acetate, or 1,3-bis (3-aminopropylamino) -2-propyl (dioctadecylcarbamoylmethoxy) acetate, {H ₂ N (CH ₂ ) ₃ } ₂ N (CH ₂ ) ₄ N {(CH ₂ ) ₃ NH ₂ } (CH ₂ ) ₃ NHCH ₂ COG 1 -yN [(CH ₂ ) ₁₇ CH ₃ ] ₂ , H ₂ N (CH ₂ ) ₃ NH (CH ₂ ) ₄ NH (CH ₂ ) ₃ NHCH ₂ COGlyN [(CH ₂ ) ₁₇ CH ₃ ] ₂

H ₂ N (CH ₂ ) ₃ NH (CH ₂ ) ₄ NH (CH ₂ ) ₃ NHCH ₂ COAr ₉ N [(CH ₂ ) ₁₇ ch ₃ ] ₂ .

22. The composition of claim 1, wherein the nucleic acid is a deoxyribonucleic acid.

23. The composition of claim 1, wherein the nucleic acid is a ribonucleic acid.

The composition of claim 22 or 23, wherein the nucleic acid is chemically modified.

25. The composition of claim 1, wherein the nucleic acid is an antisense nucleic acid.

The composition of any one of the preceding claims, wherein the nucleic acid comprises a therapeutic gene.

Composition according to any one of the preceding claims, characterized in that it additionally comprises an additive of the type comprising dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), oleoylpalmitoylphosphatidylethanolamine (POPE), di-stearoyl-, -palmitoyl- and -myristoylphosphatidylethanolamine which are also their derivatives, such as their derivatives. 3-fold N-methylated, phosphatidylglycerols, diacylglycerols, glycosyldiacylglycerols, cerebrosides (such as galactocerebrosides in particular), sphingolipids (such as sphingomyelins in particular) or alternatively asialogangliosides.

Composition according to any one of the preceding claims, characterized in that in addition there is a guiding element associated with the cationic transfection agent.

The composition of claim 28, wherein the targeting element is selected from the group consisting of antibodies directed against cell surface molecules, membrane ligand ligands such as insulin, transferrin, folic acid or any other growth factor, cytokines or vitamins, modified or unmodified lectins, RGD unit proteins, cyclic or non-cyclic peptides containing tandem RGD units, polylysine peptides, as well as natural or synthetic ligand peptides.

30. A method of preparing a defined composition comprising particles of cationic transfection agent or nucleic acid reagent complexes, wherein the transfection agent and the nucleic acid are contacted in the presence of an amount of a nonionic surfactant sufficient to stabilize the size of the so formed. % of the complexes at a value less than about 160 nm.

31. The method of claim 30, wherein one of the components selected from the group consisting of a nucleic acid and a lipofectant is premixed with a nonionic surfactant, followed by the addition of the other of the components.