SI22385B - Metoda za določanje deleža in kvalitete hibridomov ter uporaba hibridomov primerne kvalitete - Google Patents

Abstract

Predloženi izum se nanaša na metodo uporabe konfokalne mikroskopije za določanje deleža in kvalitete hibridomov s pomočjo števila različno, običajno zeleno in rdeče označenih lizosomov, ki izhajajo iz evkariontskih starševskih celic. Zaradi lastnosti lizosomov, da se zlivajo med seboj, lahko med populacijo zelenih in rdečih lizosomov zasledimo tudi rumene lizosome, ki nastanejo s fuzijo zelenega in rdečega lizosoma. Fiziološki proces zlitja lizosomov je eden izmed dogodkov, ki so vpleteni v kompleksni sistem izražanja tumorskih in drugih antigenov na površini hibridoma. Zato nam ta novo opisana metoda poleg podatkov o količini hibridomov v suspenziji fuziranih celic hkrati posredno podaja tudi informacijo o imunogenosti hibridomov, ki je ključnega pomena pri učinkovitosti celičnega cepiva proti raku v telesu bolnika.

Claims (13)

1

Patentni zahtevki 1. Metoda za detekcijo količine in kvalitete hibridomskih celic, ki sestojijo iz evkariontskih celic, s konfokalno mikroskopijo, pri čemer metoda obsega stopnje: (a) barvanje poznih endocitičnih predelkov izvora za celične linije, izvedene iz človeških ali živalskih virov, zlasti kjer so pozni endocitični predelki lizosomi; (b) ločeno barvanje obeh tipov starševskih celic z različnimi fluorescenčnimi barvami; (c) po barvanju fuzijo celic za inkubacijski čas vsaj 2 h pri temperaturi od 25 °C do 35 °C; (d) določanje obsega fuzije poznih endocitičnih predelkov s konfokalno mikroskopijo.

2. Metoda po zahtevku 1, kjer je inkubacijski čas 2-30 h.

3. Metoda po katerem koli od zahtevkov 1 ali 2, ki obsega: (a) označevanje poznih endocitičnih predelkov in določanje minimalnega števila poznih endocitičnih predelkov na posamezno starševsko celico s konfokalno mikroskopijo; (b) fuzijo obeh tipov starševskih celic in inkubacijo pri 25-35 °C za 2-30 h; (c) analizo fuzijskih vzorcev za prisotnost hibridomskih celic s konfokalno mikroskopijo; (d) določanje števila hibridomskih celic, ki vsebujejo vsaj minimalno število poznih endocitičnih predelkov, ki izvirajo iz ločenih tipov starševskih celic in ki so ločeno pobarvani z različnimi fluorescenčnimi barvami; (e) določanje količine hibridomskih celic, izražene kot razmerje med številom hibridomskih celic in številom vseh fluorescenčnih celic, detektiranih s konfokalno mikroskopijo.

4. Metoda po katerem koli od zahtevkov 1-3, kjer zaporedno izvedemo naslednje stopnje: - označevanje subcelulamih organelov, zlasti poznih endocitičnih predelkov, ki so vključeni v antigen predstavitveno pot; - kvantifikacija števila poznih endocitičnih predelkov v posamezni celici s konfokalno miksroskopijo; - določanje dobitka hibridomskih celic z detekcijo fluorescenčno označenih, npr. rdečih in zelenih, poznih endocitičnih predelkov, ki izvirajo iz obeh tipov starševskih celic; - določanje obsega zlitih poznih endocitičnih predelkov v hibridomski celici s kvantitativno konfokalno mikroskopijo in analizo slike.

5. Metoda po katerem koli od zahtevkov 1-4, kjer zaporedno izvedemo naslednje stopnje: a) določanje minimalnega števila označenih poznih endocitičnih predelkov na posamezno starševsko celico; 3 b) zajemanje konfokalnih slik zlitih in kontrolnih vzorcev, kjer je bil postopek fuzije izpuščen; c) zajemanje zaporedja konfokalnih slik, da se optično odreže celica in dobi tridimenzionalne slike, npr. z-sklade, za vsako detektirano hibridomsko celico; d) določanje števila nezlitih poznih endocitičnih predelkov, ki izvirajo iz vsakega tipa starševskih celic in določanje števila zlitih poznih endocitičnih predelkov; e) določanje števila hibridomskih celic v vsakem fuzijskem vzorcu na osnovi minimalnega števila poznih endocitičnih predelkov, označenih z dvema različnima barvama, npr. rdeče in zeleno, ki izvirajo iz vsakega tipa starševskih celic, in mimimalnega števila zlitih poznih endocitičnih predelkov, npr. rumenih.

6. Metoda po zahtevku 5, kjer v stopnji a) zajamemo laserske konfokalne z-sklade slik za vsako naključno izbrano s fluorescenčnimi molekulami naloženo neelektrofuzionirano celico.

7. Metoda po zahtevku 6, kjer preštejemo število označenih poznih endocitičnih predelkov na celico pod pogojem, da se vsak pozni endocitični predelek lahko pojavi v predhodno določenem številu sosednjih optičnih ravnin, ugotovimo število poznih endocitičnih predelkov za vsako celično populacijo ter ugotovimo minimalno število poznih endocitičnih predelkov na celico.

8. Metoda po zahtevku 5, kjer v stopnji b) po fuzijskem postopku vzorce inkubiramo pri 25-35 °C za 2-30 h in nato analiziramo s konfokalnimi slikami za prisotnost hibridomskih celic, konfokalne slike zajamemo z lasersko konfokalno mikroskopijo, zlasti, kjer vzbudimo zeleno fluorescenco z argonskim laserjem in rdečo fluorescenco s helij/neonskim laserjem.

9. Metoda po zahtevku 5, kjer v stopnji c) fuzijske vzorce analiziramo za prisotnost hibridomskih celic in zajamemo optične ravnine z-skladov s konfokalno mikroskopijo za vsako detektirano hibridomsko celico.

10. Metoda po zahtevku 5, kjer v stopnji d) ocenimo število zelenih, rdečih in rumenih poznih endocitičnih predelkov z uporabo računalnika.

11. Metoda po zahtevku 10, kjer so hibridomi definirani kot celice, ki vsebujejo vsaj minimalno število rdečih, zelenih ali rumenih fluorescenčnih poznih endocitičnih predelkov ali pare drugih fluorescenčnih markerjev in je število zlitih poznih endocitičnih predelkov indikativno za nivo imunogenosti hibridoma.

12. Metoda po zahtevku 5, kjer stopnja e) vključuje štetje hibridomov v fuzijskem vzorcu in izrazitev nivoja hibridomskih celic v fuzijskem vzorcu kot razmerje med številom hibridomskih celic in številom fluorescenčno označenih celic v fuzijskem vzorcu.

13. Metoda po katerem koli od zahtevkov 1-12, kjer se hibridomske celice tvorijo z zlivanjem med tumorskimi celicami in evkariontskimi celicami, npr. dendritičnimi celicami.