SI20951A - Metoda za zamrzovanje in odmrzovanje humanih blastocist - Google Patents
Metoda za zamrzovanje in odmrzovanje humanih blastocist Download PDFInfo
- Publication number
- SI20951A SI20951A SI200100177A SI200100177A SI20951A SI 20951 A SI20951 A SI 20951A SI 200100177 A SI200100177 A SI 200100177A SI 200100177 A SI200100177 A SI 200100177A SI 20951 A SI20951 A SI 20951A
- Authority
- SI
- Slovenia
- Prior art keywords
- freezing
- embryos
- blastocysts
- solution
- thawing
- Prior art date
Links
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 title claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000010257 thawing Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims abstract description 55
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 28
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 28
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 14
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 7
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 5
- 239000010902 straw Substances 0.000 claims description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 19
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000029803 blastocyst development Effects 0.000 description 3
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 3
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 3
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 3
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 3
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 2
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012594 Earle’s Balanced Salt Solution Substances 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 201000009273 Endometriosis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010061274 Malocclusion Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010033266 Ovarian Hyperstimulation Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000006650 Overbite Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010047196 Urofollitropin Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- WJEIYVAPNMUNIU-UHFFFAOYSA-N [Na].OC(O)=O Chemical compound [Na].OC(O)=O WJEIYVAPNMUNIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001109 blastomere Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 210000005168 endometrial cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000002854 epidermolysis bullosa simplex superficialis Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000006371 metabolic abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Natural products CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Predmet izuma je metoda za zamrzovanje in odmrzovanje humanih blastocist, ki omogoča kasnejšo uporabo blastocist pri postopkih zunajtelesne oploditve. Metoda po izumu predstavlja izboljšano dvostopenjsko metodo, pri čemer se razlikuje od znanih po temperaturi, na kateri poteka zamrzovanje zarodkov, sestavi zamrzovalnih in odmrzovalnih raztopin izbiri gojišč, programu ohlajanja blastocist in spiranju blastocist v odmrzovalnih raztopinah.ŕ
Description
Predmet izuma je metoda za zamrzovanje in odmrzovanje humanih blastocist, ki omogoča kasnejšo uporabo blastocist pri postopkih zunajtelesne oploditve. Izum sodi v razred A 01N 1/00 mednarodne patentne klasifikacije.
Blastocista pri človeku je razvojna stopnja zarodka pred ugnezditvijo, na kateri že pride do diferenciacije celic. V blastocisti opazimo votlinico blastocel, ki jo na eni strani obdaja masa celic - embrioblast (po ugnezditvi v maternici se razvija kot zarodek) in na drugi strani tanek sloj celic trofoblast (po ugnezditvi v maternici se razvija kot posteljica). Blastocista ima skupno preko 30 celic. V naravnih pogojih zarodek dospe v maternico kot blastocista in se ugnezdi.
V pogojih in vitro oziroma v postopku zunaj telesne oploditve s prenosom zarodka (IVF-ET) humane zarodke v laboratoriju razvijemo do razvojnega stadija blastociste v posebnih gojiščih. V preteklosti je bilo možno vzgojiti blastociste samo v prisotnosti celičnih kokultur (Vero celice, ampularne celice, endometrijske celice...), danes pa so dostopna posebna gojišča s kompleksno sestavo, v kateri se zarodki razvijejo do blastociste.
Zarodki dosežejo razvojno stopnjo blastociste po 5 do 6 dneh gojenja v pogojih in vitro. Zarodke gojimo v inkubatorju na 37°C, v temi, pri 5 % CO2.
Blastociste gojimo tako po klasičnem postopku zunajtelesne oploditve z mikro-inseminacijo jajčnih celic v epruvetki s pripravljenim semenom io partnerja (ženski vzroki neplodnosti kot so obolenja jajcevodov, endometrioza, endokrinološke nepravilnosti, nepravilnosti maternice) ali po neposrednem vnosu semenčice v citoplazmo jajčne celice (moški vzroki neplodnosti - slaba kakovost semena ali semenčice iz mod ali nadmodka, če semenčic ni v semenu), ko pod posebnim, inverznim mikroskopom s pomočjo hidravličnega mikromanipulatorja v vsako jajčno celico mikro-injiciramo po eno semenčico.
Zarodke, ki se razvijejo po oploditvi jajčnih celic, je možno razviti do razvojne stopnje blastociste v gojiščih različnih proizvajalcev. Na Ginekološki kliniki v Ljubljani se že več let ukvarjamo z gojenjem zarodkov do razvojne stopnje blastociste. Sedaj zarodke gojimo v gojiščih, imenovanih Blast Assist System (gojišče M1 in gojišče M2) proizvajalca Medi-Cult, Danska. Zarodke vsake ženske prenesemo najprej v gojišče M1 (na 1 in 2 dan gojenja), nato pa vsak dan v sveže gojišče M2 (na 3.,
4., 5. dan gojenja). Na dan 5 se približno 60% vseh zarodkov razvije do razvojne stopnje blastociste. Največ dva zarodka vnesemo v maternico, preostale zarodke pa zamrznemo.
V preteklosti smo gojili zarodke samo 2 dni do razvojne stopnje 2-55 celičnikov. Gojenje zarodkov do razvojne stopnje blastociste pa ima več prednosti:
- na ta način vemo več o biološki kakovosti zarodkov, saj se zarodki z večjimi genetskimi ali metabolnimi nepravilnostmi ne razvijejo do razvojne stopnje blastociste. Na ta način lažje izberemo zarodke, io primerne za prenos v maternico;
- razvojna stopnja blastociste je bližja naravnim pogojem, saj zarodki dospejo v maternico na razvojni stopnji blastociste;
- ugnezditvena sposobnost blastociste je večja kot pri manjceličnem zarodku, kar omogoča boljše klinične rezultate (več nosečnosti).
is Omogoča, da v maternico vnesemo manj zarodkov, ne da bi se poslabšal klinični rezultat. Razmišljamo že o prenosu enega samega zarodka v maternico.
Po vnosu blastocist v maternico na prvi poskus zunajtelesne oploditve 20 zanosi več kot 40% žensk, ki prejmejo zarodke (primerjava: 25% žensk, pri katerih vnesemo manjcelične zarodke).
Ker v postopku zunajtelesne oploditve hormonsko spodbujamo jajčnike, da pridobimo čim več jajčnih celic (povprečno 6), pogosto pri paru pridobimo več kot 2 zarodka in je nadštevilne zarodke potrebno zamrzniti. Prav tako je potrebno zarodke zamrzniti, kadar so dani klinični vzroki (nevarnost sindroma hiperstimulacije jajčnikov, bolezen - npr. viroza), da zarodke z zamrzovanjem shranimo in prenos v maternico odložimo na kasnejši čas. Zarodke zamrznemo po predhodnem pisnem soglasju para (ženske in moškega). Če ženska ne zanosi s svežimi zarodki, pride po zamrznjene zarodke. Zarodke na dan prenosa v maternico odmrznemo in prenesemo v maternico.
Zamrzovanje manjceličnih humanih zarodkov je že ustaljena klinična io praksa, saj so bili manjcelični zarodki uspešno zamrznjeni, odmrznjeni in prenešeni v maternico (nosečnost) že leta 1983. Referenca:Trounson AO, Mohr, L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer ofan eight-cell embryo. Nature 1983; 53, 1087-1090.
Bistvo zamrzovanja zarodkov je v tem, da zarodke pripravimo v 15 posebnih zamrzovalnih raztopinah s krioprotektantom in saharozo. Te raztopine počrpajo vodo iz zarodkov in jo nadomestijo s krioprotektantom, kar preprečuje kristalizacijo vode med ohlajanjem zarodkov. Nato zarodke prenesemo v plastične paličice in postopno programsko ohladimo v posebnem aparatu v parah tekočega dušika do -150°C. Nato jih prenesemo v kontejner s tekočim dušikom (-196°C) in shranimo.
Veliko manj uspešno pa je zamrzovanje in odmrzovanje blastocist, saj je to zamrzovanje v večini centrov za zdravljenje neplodnosti še neuspešno. Do sedaj je bila najuspešnejša dvostopenjska metoda za zamrzovanje in odmrzovanje blastocist, ki jo je razvil Menezo. Referenca: Menezo Y, Guerin, JF, Czyba, JC. Improvement of human early development in vitro by coculture on monolayers of Vero Celiš. Biol
Reprod 1990; 42: 301.
Pri omenjeni dvostopenjski metodi, ki poteka na sobni temperaturi, je za osnovo uporabljeno gojišče B2, ki mu je nujno potrebno dodati še 10% serum, nakar zarodke ohladimo do - 37°C. Pri odmrzovanju se zarodke 10 minut spira v svežem gojišču.
io Metoda za zamrzovanje in odmrzovanje humanih blastocist po izumu se od opisane znane dvostopenjske metode loči predvsem v naslednjih komponentah:
temperaturi, na kateri poteka zamrzovanje zarodkov, sestavi zamrzovalnih in odmrzovalnih raztopin (metoda po izumu: na 37°C is v inkubatorju - ker so poskusi na živalskih zarodkih pokazali, da je krioprotektant glicerol za zarodke na toplem manj toksičen);
- izbiri gojišča (metoda po izumu: gojišče B2 - Menezo - smo nadomestili z univerzalnim IVF gojiščem (Medi-Cult, Danska).
Raztopinam ne dodajamo seruma. Dokazali smo, da je lahko 20 zamrzovanje in odmrzovanje humanih zarodkov zelo uspešno tudi brez dodatka seruma. V svetu je splošno sprejeto mnenje, da serum predvsem pri odmrzovanju zarodkov veliko doprinese k revitalizaciji zarodkov, mi pa smo mnenja, da kot biološki dodatek predstavlja neznanko in lahko s svojimi nepravilnimi biološkimi sestavinami deluje tudi negativno;
programu ohlajanja zarodkov v aparatu - pare tekočega dušika (metoda po izumu: zarodke ohladimo do -150°C, tako je prenos zarodkov v tekoči dušik do -196°C manj travmatičen, zaradi manjše temperaturne razlike;
spiranju zarodkov po odmrzovalnih raztopinah (metoda po izumu: zarodke samo na hitro speremo v svežem gojišču s tem, da jih približno 5-krat aspiriramo v in iz steklene pipete, nakar jih inkubiramo v svežem gojišču v inkubatorju).
Univerzalno IVF gojišče za gojenje jajčnih celic in zarodkov, ki ga uporabljamo ima naslednjo sestavo:
Earl's Balanced Salt (EBSS) raztopina kot osnova
| kalcijev klorid | 264,90 mg/l |
| kalijev klorid | 400,00 mg/l |
| magnezijev sulfat | 200,00 mg/l |
| natrijev klorid | 6800,00 mg/l |
| natrijev hidrogen karbonat | 2200,00 mg/l |
| natrijev dihidrogen karbonat | 158,30 mg/l |
| D-glukoza | 1000 mg/l |
| fenol rdeče | 10,00 mg/l |
z dodatki natrijev piruvat nadomestek seruma (SSR) oz. sintetični serum natrijev bikarbonat človeški serumski albumin penicilin 50,00 IU /I (poseben produkt 1095)
- streptomicin 50 mg/l (poseben produkt 1095) fenol rdeče (poseben produkt 1030)
Opis postopka zamrzovanja po metodi po izumu:
Zamrzovanje blastocist poteka po predhodnem pisnem soglasju para io (ženske in moškega) tako, da zamrzovalne raztopine pripravimo in inkubiramo v inkubatorju vsaj eno uro pred uporabo. Nato sledi prenos zarodkov v zamrzovalno raztopino 1 (Univerzalno IVF gojišče (Medi-Cult, Danska) + 5 % glicerol (prefiltriran) za 10 minut na temperaturi 37°C (v inkubatorju). Nato prenesemo zarodke v zamrzovalno raztopino 2 is (Univerzalno IVF gojišče (Medi-Cult, Danska) + 10 % glicerol (prefiltriran) + 0,2 M saharoza) za 10 minut na temperaturi 37°C (v inkubatorju). Nadalje prenesemo zarodke v plastično paličico s pokrovčkom (ime, priimek, letnica rojstva ženske), ki jo vložimo v zamrzovalni aparat (MiniCool 40, Air Liquide, Francija) kjer pričnemo ohlajati zarodke.
2o Sledi program ohlajanja po naslednjem razporedu:
od temperature 22°C do -6°C po 2°C t minuto;
pri - 6°C : “seeding” (potopitev kovinske paličice v tekoči dušik pri -196°C in nekajsekundni dotik predela slamice v katerem so zarodki v napravi za ohlajevanje zarodkov);
od temperature -6°C do -40°C po 0,3°C / minuto;
- od temperature-40°C do-150°C po 35°C / minuto.
Po končanem ohlajanju paličico z zamrznjenimi zarodki prenesemo v posodo s tekočim dušikom, od tam pa v kontejner s tekočim dušikom, kjer so shranjeni na temperaturi -196°C.
Opis postopka odmrzovanja po metodi po izumu:
Zamrzovalne raztopine pripravimo in inkubiramo v inkubatorju vsaj 1 uro pred uporabo.
Paličico z zarodki vzamemo iz kontejnerja in jo ogrevamo nekaj sekund na sobni temperaturi. Nato zarodke sprostimo iz slamice v petrijevko, is Sledi prenos zarodkov v odmrzovalno raztopino 1 (Univerzalno IVF gojišče (Medi-Cult, Danska) + 0,5 M saharoza za 10 minut pri sobni temperaturi (gaziranje s CO2), nakar prenesemo zarodke v odmrzovalno raztopino 2 (Univerzalno IVF gojišče (Medi-Cult, Danska) + 0,2 M saharoza) za 10 minut pri sobni temperaturi (gaziranje s CO2).
Zarodke nato speremo v svežem gojišču in jih približno 1 uro inkubiramo v svežem gojišču (Univerzalno IVF gojišče (Medi-Cult, Danska) na 37°C in 5 % CO2).
Pri pregledu zarodkov ugotavljamo preživelost zarodka. Zarodek je preživel zamrzovanje in odmrzovanje, če je več kot 50% blastomer nepoškodovanih. Največ tri preživele odmrznjene zarodke prenesemo v maternico.
Odmrznjene blastociste vnesemo v maternico v naravnem ciklusu, če je to mogoče (normalna ovulacija). Zelo pomembna je koordinacija med maternico in razvojnim stadijem zarodka. Zarodke prenesemo v maternico na 4. dan, to je 6 dni po injekciji HCG. V primerih nenormalne ovulacije je potrebna blažja priprava maternice z Metrodin-HP.
o
Za:
Ginekološka klinika v Ljubljani, Klinični center
Claims (9)
- PATENTNI ZAHTEVKI1. Metoda za zamrzovanje humanih blastocist, označena s tem,5 da pustimo blastociste v zamrzovalni raztopini 1 za 10 minut na temperaturi 37°C, nato v zamrzovalni raztopini 2 za 10 minut na temperaturi 37°C in jih nato prenesemo v plastično paličico s pokrovčkom ter ohladimo po programu ohlajevanja od temperature 22°C do -150°C in jih shranimo na temperaturi -196°C.o
- 2. Metoda za zamrzovanje humanih blastocist, po zahtevku 1, označena s tem, da je zamrzovalna raztopina 1 univerzalno IVF gojišče + 5 % glicerol (prefiltriran).
- 3. Metoda za zamrzovanje humanih blastocist, po zahtevku 1, označena s tem, da je zamrzovalna raztopina 2 univerzalno IVF gojišče + 10 % glicerol (prefiltriran) + 0,2 M saharoza „ o
- 4. Metoda za zamrzovanje humanih blastocist, po zahtevku 1, označena s tem,-1111 da poteka ohlajevanje od temperature 22°C do -6°C po 2°C / minuto, od temperature -6°C do -40°C po 0,3°C / minuto in od temperature 40°C do -150°C po 35°C / minuto.
- 5 5. Metoda za zamrzovanje humanih blastocist, po zahtevku 1, označena s tem, da pri -6°C izvedemo potopitev kovinske paličice v tekoči dušik pri 196°C in se za nekaj sekund dotaknemo predela slamice v katerem so zarodki v napravi za ohlajevanje zarodkov.
- 6. Metoda za odmrzovanje humanih blastocist, označena s tem, da paličico z zamrznjenimi blastocistami ogrevamo nekaj sekund na sobni temperaturi, nakar jih prenesemo v odmrzovalno raztopino 1 za15 10 minut pri sobni temperaturi (gaziranje s CO2) in nato v odmrzovalno raztopino 2 za 10 minut pri sobni temperaturi (gaziranje s CO2); blastociste nato hitro speremo v svežem gojišču in jih približno 1 uro inkubiramo v svežem gojišču.2o
- 7. Metoda za odmrzovanje humanih blastocist, po zahtevku 6, označena s tem, da je odmrzovalna raztopina 1 univerzalno IVF gojišče + 0,5 M saharoze.-1212
- 8. Metoda za odmrzovanje humanih blastocist, po zahtevku 6, označena s tem, da je odmrzovalna raztopina 2 univerzalno IVF gojišče + 0,2 M saharoze.
- 9. Metoda za odmrzovanje humanih blastocist, po zahtevku 6, označena s tem, da je sveže gojišče univerzalno IVF gojišče pri 37°C in 5 % CO2.Za:Ginekološka klinika v Ljubljani, Klinični center
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SI200100177A SI20951A (sl) | 2001-07-03 | 2001-07-03 | Metoda za zamrzovanje in odmrzovanje humanih blastocist |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SI200100177A SI20951A (sl) | 2001-07-03 | 2001-07-03 | Metoda za zamrzovanje in odmrzovanje humanih blastocist |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SI20951A true SI20951A (sl) | 2003-02-28 |
Family
ID=20432932
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SI200100177A SI20951A (sl) | 2001-07-03 | 2001-07-03 | Metoda za zamrzovanje in odmrzovanje humanih blastocist |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| SI (1) | SI20951A (sl) |
-
2001
- 2001-07-03 SI SI200100177A patent/SI20951A/sl unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gómez et al. | Efficient one-step direct transfer to recipients of thawed bovine embryos cultured in vitro and frozen in chemically defined medium | |
| Mohr et al. | Deep-freezing and transfer of human embryos | |
| Takahashi et al. | Perinatal outcome of blastocyst transfer with vitrification using cryoloop: a 4-year follow-up study | |
| Van den Abbeel et al. | Viability of partially damaged human embryos after cryopreservation. | |
| Ludwig et al. | New aspects of cryopreservation of oocytes and embryos in assisted reproduction and future perspectives | |
| Lim et al. | The post-thaw developmental capacity of frozen bovine oocytes following in vitro maturation and fertilization | |
| JP2004505624A (ja) | 精子の低温保存 | |
| Van Steirteghem et al. | Cryopreservation of human embryos obtained after gamete intra-Fallopian transfer and/or in-vitro fertilization | |
| Quinn et al. | Experience with the cryopreservation of human embryos using the mouse as a model to establish successful techniques | |
| Cobo et al. | Vitrification of human mature oocytes in clinical practice | |
| Huang et al. | Novel micro-straw for freezing small quantities of human spermatozoa | |
| Sirisathien et al. | Effect of leukemia inhibitory factor on bovine embryos produced in vitro under chemically defined conditions | |
| García | Embryo manipulation techniques in the rabbit | |
| Walker et al. | Vitrification versus programmable rate freezing of late stage murine embryos: a randomized comparison prior to application in clinical IVF | |
| CN113875747B (zh) | 胚胎玻璃化冷冻方法和使用的冷冻液 | |
| CN113736728B (zh) | 一种小鼠体细胞核移植胚胎培养液及胚胎培养方法 | |
| Bielanski et al. | Factors affecting survival of deep frozen bovine embryos in vitro: the effect of freezing container and method of removing cryoprotectant | |
| Abeydeera et al. | Effect of incubation temperature on in vitro maturation of porcine oocytes: nuclear maturation, fertilisation and developmental competence | |
| Kuzan et al. | Cryopreservation of mammalian embryos | |
| SI20951A (sl) | Metoda za zamrzovanje in odmrzovanje humanih blastocist | |
| Banker et al. | The impact of vitrification in artificial reproductive technology programmes | |
| Shapiro et al. | The freeze-all cycle: a new paradigm shift in ART | |
| WO2007119892A1 (en) | Methods for vitrification of human oocytes | |
| Chan et al. | Live Birth Resulting from the Direct Warming and Direct Rehydration of Vitrified Human Blastocyst in Embryo Culture Medium: A Pilot Study | |
| Azambuja et al. | Experience of freezing human oocytes using sodium-depleted media |