SI20479A - Postopek za imobilizacijo encimov v trdne nosilce, - Google Patents
Postopek za imobilizacijo encimov v trdne nosilce, Download PDFInfo
- Publication number
- SI20479A SI20479A SI200000035A SI200000035A SI20479A SI 20479 A SI20479 A SI 20479A SI 200000035 A SI200000035 A SI 200000035A SI 200000035 A SI200000035 A SI 200000035A SI 20479 A SI20479 A SI 20479A
- Authority
- SI
- Slovenia
- Prior art keywords
- enzyme
- immobilization
- immobilized
- reaction
- enzymes
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 51
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 32
- 239000000969 carrier Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 title claims description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000000352 supercritical drying Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 40
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 claims description 27
- 239000004964 aerogel Substances 0.000 claims description 27
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 claims description 23
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 claims description 23
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 23
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 claims description 22
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 claims description 22
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 12
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 9
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 claims description 4
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 3
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 claims description 2
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 claims description 2
- LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N Dimethyl ether Chemical compound COC LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 claims description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 2
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 claims description 2
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 claims description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 55
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 37
- 230000032050 esterification Effects 0.000 abstract description 9
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 7
- 239000004965 Silica aerogel Substances 0.000 abstract description 4
- 230000032683 aging Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003483 aging Methods 0.000 abstract 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 35
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N N-Pentanol Chemical compound CCCCCO AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 description 12
- LFQCEHFDDXELDD-UHFFFAOYSA-N tetramethyl orthosilicate Chemical compound CO[Si](OC)(OC)OC LFQCEHFDDXELDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N Propane Chemical compound CCC ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 8
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 8
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 7
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 7
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide Natural products O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- ALSTYHKOOCGGFT-KTKRTIGZSA-N (9Z)-octadecen-1-ol Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCO ALSTYHKOOCGGFT-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GLZPCOQZEFWAFX-UHFFFAOYSA-N Geraniol Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCO GLZPCOQZEFWAFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 4
- 229940055577 oleyl alcohol Drugs 0.000 description 4
- XMLQWXUVTXCDDL-UHFFFAOYSA-N oleyl alcohol Natural products CCCCCCC=CCCCCCCCCCCO XMLQWXUVTXCDDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- GLZPCOQZEFWAFX-YFHOEESVSA-N Geraniol Natural products CC(C)=CCC\C(C)=C/CO GLZPCOQZEFWAFX-YFHOEESVSA-N 0.000 description 2
- 239000005792 Geraniol Substances 0.000 description 2
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 2
- 229940113087 geraniol Drugs 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000002210 supercritical carbon dioxide drying Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000007210 heterogeneous catalysis Methods 0.000 description 1
- 238000007172 homogeneous catalysis Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000003980 solgel method Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012808 vapor phase Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Postopek za imobilizacijo encimov v trdne nosilce iz aerogelov silicijevega dioksida z visoko skupno specifično površino, večjo od 430 m2/g. Novi postopek imobilizacije obsega: sol-gel sintezo, staranje, superkritično sušenje s plinom. Encimi, imobilizirani z novo tehniko, imajo pri uporabi kot katalizatorji pri reakcijah esterifikacije v superkritičnih fluidih visoke relativne aktivnosti (do 25), v primerjavi s komercialnimi prostimi encimi.ŕ
Description
komercialnimi prostimi encimi.
Sl 20479 A
Postopek za imobilizacijo encimov v trdne nosilce, imobilizirani encimi in njihova uporaba
Področje izuma
Predmetni izum se nanaša na nov postopek za imobilizacijo encimov v nove trdne nosilce, sestavljene iz aerogelov silicijevega dioksida, na encime imobilizirane po tem postopku in na njihovo uporabo kot katalizatorji pri reakcijah esterifikacije v superkritičnih fluidih. Tako imobilizirani encimi se lahko uporabijo v kontinuirnih reaktorjih z nasutjem ali fluidizirano plastjo in mešalnih reaktorjih. Prednosti se pokažejo še posebej v primeru obratovanja na večjih industrijskih napravah, saj se imobiliziran encim z lahkoto odstranjuje (ločuje) od produktov.
Stanje tehnike
V praksi se pri encimsko kataliziranih reakcijah pojavljajo številne, zelo pomembne pomanjkljivosti:
• mnogi encimi niso dovolj stabilni pri določenih obratovalnih pogojih in lahko izgubijo svojo katalitsko aktivnost zaradi avtooksidacije, razpada in/ali denaturizacije, katere povzročitelj je lahko topilo, topljenec ali mehanske strižne sile;
• ker so encimi vodotopne molekule, je njihova ponovna večkratna uporaba, kar je zelo pomembno z ekonomskega vidika, problematična zaradi dejstva, da jih je izredno težko ločiti (separirati) od substratov in produktov.
Te zgoraj navedene pomanjkljivosti rešujejo z imobilizacijo encimov. Imobilizacijska tehnika vključuje enega od dveh možnih načinov:
- vključitev encima v/na trdni nosilec (coupling), ali z vezavo molekul encimov med seboj (cross-linking).
Imobilizacija encimov je prenos encimov iz vodotopne oblike v vodonetopno. Biokatalizator (encim) se zapre (omeji) v zaprto področje, katerega ne more zapustiti, vendar hkrati ohrani katalizatorsko aktivnost (ujetje v trdno strukturo). Na ta način se z uporabo imobiliziranega encima homogena kataliza spremeni v heterogeno katalizo. Odvisno od imobilizacijske tehnike se lahko lastnosti biokatalizatorjev, kot so aktivnost, stabilnost, selektivnost, Km vrednost, pH in temperaturne karakteristike, bistveno spremenijo, včasih na bolje, včasih na slabše. Največja pomanjkljivost večine imobilizacijskih tehnik je, da encimi v večini primerov pri postopku imobilizacije izgubijo del svoje aktivnosti zaradi večjih omejitev v prenosu snovi v reaktorju in zaradi zmanjšanega števila dostopnih aktivnih centrov. Napovedovanje učinkovitosti imobilizacijskega postopka je danes zelo težko.
Poznanih je več imobilizacijskih tehnik.
Npr. Skica 1: Različne tehnike imobilizacije encimov (K. Faber, Bio-transformations in Organic Chemistry, Springer-Verlag Berlin, 1992)
Glavni cilj vedno novih imobilizacijskih postopkov in novih potencialnih nosilcev za imobilizacijo je nezmanjšana aktivnost imobiliziranih encimov. Doseganje relativne aktivnosti (aktivnost prostega encima/aktivnost imobiliziranega encima) 1.0 in več, so lastnosti dobrih imobilizacijskih tehnik. Z razvojem sol-gel sinteze (C.J. Brinker, G.W. Sherer, Sol-Gel Science, The Physics and Chemistry of Sol-Gel Processing, Academic Press, San Diego, 1990) se je v zadnjem času pojavila možnost imobilizacije encimov z zamrežitvijo encimov v mreže silica gelov s pomočjo sol-gel sinteze. V tem primeru se med potekom sol-gel sinteze v homogeno raztopino sola vnese biokatalizator, ki se kasneje v procesu geliranja zamreži v pore gela. V zadnji fazi tega procesa se topilo, ki se uporablja v sol-gel sintezi, odstrani z odparevanjem na zraku, da dobimo silica kserogele, ki imajo v svojih porah imobilizirane molekule encima (M.T. Reetz, J. Simpelkamp, A. Zonta, Lipases immobilized in sol-gel processed hydrophobic materials, US Patent 5817493).
Opis izuma z izvedbenimi primeri
Prvi predmet izuma je nov postopek za imobilizacijo encimov v nove trdne nosilce, sestavljene iz aerogelov silicijevega dioksida. V tem postopku imobilizacije klasično sušenje produktov sol-gel sinteze na zraku nadomestimo s superkritičnim sušenjem s plinom. Na ta način dobimo posušene gele, ki jih imenujemo aerogeli. Aerogeli imajo v primerjavi s kserogeli, ki so bili posušeni klasično na zraku, mnogo boljše lastnosti v smislu večje specifične površine, manjšega premera por in večjega volumna por ter s tem posledično večjo poroznost in nižjo gostoto. Med sušenjem na zraku topilo iz por gelov upareva in na fazni meji tekoče-para v porah gela nastajajo močne kapilarne sile, ki porušijo strukturo gela. Pri superkritičnem sušenju, kjer topilo iz por gela ekstrahiramo s plinom, se izognemo nastanku dvofaznega področja in s tem nastanku kakršnih koli porušitvenih sil, ki bi uničile strukturo gela. Na ta način ohranimo izredne lastnosti gelov, pridobljene v postopku sol-gel sinteze.
Nadaljnji predmet izuma so encimi, imobilizirani po predlaganem novem postopku.
Še nadaljnji predmet izuma je uporaba imobiliziranih encimov kot katalizatorjev pri reakcijah esterifikacije v superkritičnih fluidih, kjer kažejo visoke relativne aktivnosti (do 25) v primerjavi s komercialnimi prostimi encimi.
Tabela 1: Morfološke lastnosti S1O2 aerogelov uporabljene v postopku imobilizacije encima, dobljene z fizikalno adsorpcijo dušika pri 77 K.
| Aerogel | SbET (Smic)3 (m2/g) | v (cm7g) mezo/mikro | d (nm)b mezo/mikro |
| S1O2 | 1065(180) | 6.3/0.072 | 15-20/1.5 |
a (Smic) v oklepaju specifična površina mikropor, dobljena z analizo t-krivulje b model geometrije cilindričnih por
Postopek za imobilizacijo encimov v trdne nosilce iz aerogelov silicijevega dioksida z visoko skupno specifično površino, večjo od 430 m2/g, obsega :
• sol-gel sintezo, • staranje, • superkritično sušenje s plinom.
Sol-gel sinteza. V postopku priprave SiO2 gelov s sol-gel sintezo smo kot organosilikonsko snov uporabili tetrametoksisilan (TMOS).
V steklenem reaktorju z magnetnim mešalom smo raztopili zahtevano količino TMOS (Aldrich, čistota 98%) v ustrezni količini metanola. Za potek kemične sinteze v inertni atmosferi smo v sistem dovajali dušik iz jeklenke. Za morebitni potrebni refluks topila med sintezo je bil na reaktor nameščen vodno hlajeni kondenzator. Preko steklenega graduiranega kapalnika, nameščenega na pokrovu reakcijske posode, smo po kapljicah dodajali predhodno pripravljeni vodni raztopini encima in katalizatorja NH4OH (Kemika, p.a.).
Vodno raztopino encima smo pripravili na dva načina:
• vodno raztopino encima smo centrifugirali in v sol-gel sintezi uporabili samo zgornjo fazo (supernatant), • uporabili smo celotno vodno raztopino brez centrifugiranja.
Po končanem dodajanju smo mešanico močno mešali (1000 obr/min), da smo dobili homogeno raztopino. Tako nastali sol smo pustili gelirati pri sobni temperaturi.
Za imobilizacijo smo uporabili naslednje encime: lipaze, fosfolipaze, proteaze, esteraze, amilaze, izomeraze, celulaze. Prednostne so lipaze. Encim vnesemo v strukturo omenjenega aerogela v fazi sol-gel transformacije omenjene organosilikonske snovi v prisotnosti omenjenega encima. Proces poteka v prisotnosti vsaj enega katalizatorja, izbranega izmed bazičnih snovi, predvsem šibkih baz. Prednosten je amonijev hidroksid.
Staranje. Po končanem geliranju smo S1O2 alkogele z imobiliziranimi encimi starali v hladilniku pri temperaturi med 0 do 8°C še 40 do 200 ur.
Superkritično sušenje s plinom. Produkte sol-gel sinteze skupaj z vgrajenim encimom posušimo s postopkom superkritičnega sušenja s plinom. Pri superkritičnem sušenju se topilo (alkohol) popolnoma izmenja z ekstrakcijo z ustreznim plinom. Sušenje poteka z ekstrakcijo alkohola s plinom pri pogojih, ki so nad oziroma blizu njegove kritične točke.
Na Skici 2 je prikazana aparatura za superkritično sušenje gelov s plinom. Aparatura obsega jeklenko (1) s plinom, visokotlačno črpalko (2), ekstraktor avtoklav (3), regulacijski ventil (4), separator (5), merilnik in regulator temperature (TIR), merilnik tlaka (PIR) in merilnik pretoka (Fl).
Na Skici 3 je prikazan potek superkritičnega sušenja s plinom - CO2.
Pri kritični temperaturi in kritičnem tlaku površinske napetosti izginejo, zaradi česar je struktura alkogela med zamenjavo alkohola podvržena le zelo malim stresom. Pomembna stopnja sušenja je končno praznjenje, oziroma izpust plina iz ekstraktorja. Med zniževanjem tlaka v ekstraktorju (izpust plina) mora plin v ekstraktorju preiti iz superkritičnega področja direktno v plinsko področje. Na vsak način se moramo izogniti tvorbi tekoče faze, ker bi nastale površinske napetosti na fazni meji uničile strukturo gela. To dosežemo s počasnim zniževanjem tlaka v ekstraktorju pri konstantni temperaturi nad kritično. Za superkritično sušenje uporabimo naslednje pline: CO2) freone (R 23), N2O, di-metileter, alkane, alkene, njihove zmesi, prednostno CO2. Superkritično sušenje izvedemo pri temperaturah od 30 do 150°C in tlakih od 80 do 400 bar, prednostno pri temperaturi 40°C in tlaku 100 bar.
Za superkritično sušenje smo ekstraktor z gelom do vrha napolnili z alkoholom. Tako smo preprečili možnost izhlapevanja topila iz gela in s tem porušitev njegove strukture med dvigovanjem tlaka. Ekstraktor smo najprej segreli na določeno temperaturo med 30 in 150°C, nato pa s pomočjo visokotlačne črpalke počasi dovajali plin do tlaka med 80 - 400 bar. Med uvajanjem plina v ekstraktor smo ga v cevi ogreli na temperaturo 30 - 150°C.
Pretok plina med sušenjem je bil konstanten in je znašal med 20 in 350 L/h. Regulacija pretoka je bila neodvisna od regulacije tlaka v ekstraktorju, ki smo ga regulirali s pomočjo pnevmatskega ventila. Mešanico plina in alkohola iz ekstraktorja smo vodili v separator, kjer se je zaradi znižanja tlaka alkohol ločil od plina. Po končani zamenjavi alkohola smo tlak v ekstraktorju z izpuščanjem plina počasi zniževali (ΔΡ/Δί = 3bar/min) do atmosferskega pri temperaturi nad kritično. Po končanem praznjenju smo ekstraktor ohladili na sobno temperaturo.
1. Izvedbeni primeri za imobilizacijo
Primer 1. Imobilizacija lipaze iz Candida cylindracea v SiO2 aerogel Lipazo smo suspendirali v destilirani vodi (0.5g/ 3.5ml) pri sobni temperaturi in suspenzijo mešali 5 minut. Suspenzijo smo nato centrifugirali in za imobilizacijo uporabili supernatant. V 100 ml stekleni reaktorski bučki smo raztopili 3.80g TMOS (tetrametoksisilan) v 15.2g absolutnega metanola (molsko razmerje TMOS:MeOH = 1:32.7). Po 15 minutnem mešanju, ko smo dobili povsem homogeno raztopino, smo dodali predhodno pripravljeno vodno raztopino encima in raztopino amonijevega hidroksida (NH4OH) v preostanku vode v končnem molskem razmerju TMOS:H2O = 1:10. Mešanico smo močno mešali (1000 obr/min) še nadaljnji 2 minuti. Po približno 5 minutah, ob razvoju toplote v reakcijski mešanici, je motna raztopina sola zgelirala v trden neprozoren gel. Gel smo pustili stati v zaprti posodi 24 ur pri sobni temperaturi in ga nato še 3 dni starali v hladilniku pri temperaturi 5°C.
Po treh dneh smo gel posušili s postopkom superkritičnega sušenja z ogljikovim dioksidom pri temperaturi 40°C in tlaku 100 bar. Tako imobilizirano lipazo v SiO2 aerogelu smo shranili v hladilniku za nadaljnjo uporabo.
Vsebnost lipaze v aerogelu: 0.25%.
Skupna specifična površina imobiliziranega encima v SiO2 aerogelu:
480 m2/g.
Relativna aktivnost v vodnem mediju (aktivnostni faktor = aktivnost imobilizirane lipaze/aktivnost proste lipaze) znaša 1.0 (Reakcija 1).
Stabilnost imobiliziranega encima je konstantna 4 reakcijske cikle. Razpolovna doba je 6 reakcijskih ciklov.
Primer 2.
Identičen Primeru 1, z edino razliko, da vodne suspenzije lipaze nismo centrifugirali in smo za imobilizacijo uporabili vso suspenzijo.
Vsebnost lipaze v aerogelu: 0.25%
Relativna aktivnost v vodnem mediju (aktivnostni faktor = aktivnost imobilizirane lipaze/aktivnost proste lipaze) znaša 1.0 (Reakcija 1). Razpolovna doba je 1 reakcijski cikel.
Primer 3.
Identičen Primeru 1, z edino razliko, da smo gel posušili s postopkom superkritičnega sušenja s propanom pri temperaturi 100°C in tlaku 50 bar. Vsebnost lipaze v aerogelu: 0.25%
Skupna specifična površina imobiliziranega encima v SiO2 aerogelu:
503 m2/g.
Relativna aktivnost v vodnem mediju (aktivnostni faktor = aktivnost imobilizirane lipaze/aktivnost proste lipaze) znaša 1.0 (Reakcija 1).
Stabilnost imobiliziranega encima je konstantna 4 reakcijske cikle. Razpolovna doba je 6 reakcijskih ciklov.
Primer 4. Imobilizacija lipaze iz Porchine pankreas v SiO2 aerogel.
Lipazo smo suspendirali v destilirani vodi (3 g/ 21 ml) pri sobni temperaturi in suspenzijo mešali 5 minut. Suspenzijo smo nato centrifugirali in za imobilizacijo uporabili supernatant. V 100 ml stekleni reaktorski bučki smo raztopili 22.80 g TMOS (tetrametoksisilan) v 91.2 g absolutnega metanola (molsko razmerje TMOS:MeOH = 1:32.7). Po 15 minutnem mešanju, ko smo dobili povsem homogeno raztopino, smo dodali predhodno pripravljeno vodno raztopino encima in raztopino amonijevega hidroksida (NH4OH) v preostanku vode v končnem molskem razmerju TMOS:H2O = 1:10. Mešanico smo močno mešali (1000 obr/min) še nadaljnji 2 minuti. Po približno 5 minutah, ob razvoju toplote v reakcijski mešanici, je motna raztopina sola zgelirala v trden neprozoren gel. Gel smo pustili stati v zaprti posodi 24 ur pri sobni temperaturi in ga nato še 3 dni starali v hladilniku pri temperaturi 5°C.
Po treh dneh smo gel posušili s postopkom superkritičnega sušenja z ogljikovim dioksidom pri temperaturi 40°C in tlaku 100 bar. Tako imobilizirano lipazo na SiO2 aerogelu smo shranili v hladilniku za nadaljnjo uporabo. Vsebnost lipaze v aerogelu: 0.25%
Skupna specifična površina imobiliziranega encima v SiO2 aerogelu:
455 m2/g.
Relativna aktivnost v vodnem mediju (aktivnostni faktor = aktivnost imobilizirane lipaze/aktivnost proste lipaze) je 1.0 (Reakcija 2).
Primer 5 . Imobilizacija esteraze iz Rhizopus orrhizus m SiO2 aerogel. Identičen Primeru 1, z edino razliko, da smo za imobilizacijo namesto lipaze uporabili esterazo iz Rhizopus orrhizus.
Vsebnost esteraze v aerogelu: 0.25%
Skupna specifična površina imobiliziranega encima v SiO2 aerogelu:
432 m2/g.
Relativna aktivnost v vodnem mediju (aktivnostni faktor = aktivnost imobilizirane esteraze/aktivnost proste esteraze) znaša 1.0 (Reakcija 3). Stabilnost imobiliziranega encima je konstantna 5 reakcijskih ciklov. Razpolovna doba je 6 reakcijskih ciklov.
Primer 6 . Imobilizacija proteaze Subtilisin v SiO2 aerogel.
Identičen Primeru 1, z edino razliko, da smo za imobilizacijo namesto lipaze uporabili proteazo Subtilisin. Vsebnost proteaze v aerogelu: 0.25%
Skupna specifična površina imobiliziranega encima v SiO2 aerogelu:
448 m2/g.
Relativna aktivnost (aktivnostni faktor = aktivnost imobilizirane proteaze/aktivnost proste proteaze) znaša 1.0 (Reakcija 4).
Stabilnost imobiliziranega encima je konstantna 4 reakcijske cikle. Razpolovna doba je 5 reakcijskih ciklov.
I. Test aktivnosti in reakcije, katalizirane z imobiliziranimi encimi
Reakcija 1
Esterifikacija butanojske kisline in oleil alkohola v vodnem mediju
V reakcijski bučki (50 ml) s povratnim hladilnikom smo reakcijski mešanici 9.5 g butanojske kisline in oleil alkohola (molsko razmerje 1:2.5) in 2.5 g vode dodali 0.25 g imobiliziranega encima. Reakcijsko mešanico smo mešali z magnetnim mešalom (600 obr/min) in termostatirali v vodni kopeli pri temperaturi 40°C. Za določitev začetnih reakcijskih hitrosti smo iz reakcijske mešanice odvzemali vzorce (0.I g) v enakih časovnih intervalih in volumetrično določali koncentracijo butanojske kisline. Za določitev aktivnostnega faktorja smo tako dobljeno začetno reakcijsko hitrost delili z začetno reakcijsko hitrostjo reakcije katalizirane z enakim prostim komercialnim encimom pri enakih pogojih.
Reakcija 2
Esterifikacija butanojske kisline in pentanola v vodnem mediju
Identično prejšnji reakciji, s to razliko da smo namesto oleil alkohola uporabili pentanol.
Reakcija 3
Esterifikacija butanojske kisline in geraniola v vodnem mediju
Identično prejšnji reakciji, s to razliko, da smo namesto oleil alkohola uporabili geraniol.
Reakcija 4
Razgradnja kazeina s proteazo Subtilisin
Reakcijski mešanici 1ml kazeina in 990 μΙ fosfatnega pufra s pH 7.6 smo dodali 10 μΙ predhodno pripravljene suspenzije proteaze Subtilisin (10 μΙ imobilizirane proteaze v 990 μΙ fosfatnega pufra). Mešanico smo mešali in inkubirali 20 minut pri temperaturi 35°C. Nato smo dodali 3 ml 5% triklorocetne kisline, v kateri so se raztopili produkti razgradnje kazeina. Koncentracijo produktov smo določili spektrofotometrično. Za določitev aktivnostnega faktorja smo tako dobljeno koncentracijo delili s koncentracijo razgradnjih produktov v reakciji katalizirani z enakim prostim komercialnim encimom pri enakih pogojih.
Reakcija 5
Esterifikacija butanojske kisline in pentanola v superkritičnih fluidih
Reakcijski mešanici 9.5 g butanojske kisline in pentanola (molsko razmerje 1:2.5) v visokotlačnem avtoklavu (45 ml) smo dodali 0.25 g imobiliziranega encima. S pomočjo visokotlačne črpalke smo v avtoklav dovajali ustrezni fluid (CO2, propan) do tlaka 100 bar. Avtoklav smo termostatirali z grelnim plaščem pri temperaturi 40°C. Za določitev začetnih reakcijskih hitrosti smo iz reakcijske mešanice odvzemali vzorce (0.1 g) v enakih časovnih intervalih in volumetrično določali koncentracijo butanojske kisline. Za določitev aktivnostnega faktorja smo tako dobljeno začetno reakcijsko hitrost delili z začetno reakcijsko hitrostjo reakcije katalizirane z enakim prostim komercialnim encimom pri enakih pogojih.
Reakcija 6
Imobilizacija proteaze Subtilisin v SiO2 aerogel.
Identičen primeru 1, z edino razliko, da smo za imobilizacijo namesto lipaze uporabili proteazo Subtilisin.
Vsebnost proteaze v aerogelu: 0.25%
Skupna specifična površina imobiliziranega encima v SiO2 aerogelu: 448 m2/g.
Relativna aktivnost (aktivnostni faktor = aktivnost imobilizirane proteaze/aktivnost proste proteaze) znaša 1.0 (Reakcija 4).
Stabilnost imobiliziranega encima je konstantna 4 reakcijskih ciklov. Razpolovna doba je 5 reakcijskih ciklov.
Reakcija 7
Imobilizirano lipazo iz Primera 4 smo uporabili kot biokatalizator v reakciji esterifikacije butanojske kisline in pentanola v superkritičnem ogljikovem dioksidu pri temperaturi 40° C in tlaku 100 bar (Reakcija 5).
Relativna aktivnost (aktivnostni faktor = aktivnost imobilizirane lipaze/aktivnost proste lipaze) znaša 25 (Reakcija 5).
Razpolovna doba imobiliziranega encima je 10 reakcijskih ciklov.
Reakcija 8
Imobilizirano lipazo iz Primera 4 smo uporabili kot biokatalizator v reakciji esterifikacije butanojske kisline in pentanola v propanu pri temperaturi 40° C in tlaku 100 bar (Reakcija 5).
Relativna aktivnost (aktivnostni faktor = aktivnost imobilizirane lipaze/aktivnost proste lipaze) je 2.5 (Reakcija 5).
Razpolovna doba imobiliziranega encima je 4 reakcijske cikle.
Reakcija 9
Imobilizirano lipazo iz Primera 4 smo uporabili kot biokatalizator v reakciji esterifikacije butanojske kisline in pentanola v vodnem mediju pri atmosferskem tlaku in treh različnih temperaturah: 30, 40 in 50°C (Reakcija 2).
| T(°C) | -v, (mmol/kgmin) |
| 30 | 1.9 |
| 40 | 2.4 |
| 50 | 1.3 |
| Aktivacijska energija E(J/molK) | Deaktivacijska konstanta KP |
| 18415.5 | 0.42 |
Reakcija 10
Imobilizirano lipazo iz Primera 4 smo uporabili kot biokatalizator v reakciji esterifikacije butanojske kisline in pentanola v propanu pri tlaku 100 bar in štirih različnih temperaturah: 30, 40, 50 in 60°C (Reakcija 5).
| T(°C) | -Vi (mmol/kgmin) |
| 30 | 19.3 |
| 40 | 22.7 |
| 50 | 28.4 |
| 60 | 25.0 |
| Aktivacijska energija E(J/molK) | Deaktivacijska konstanta Kp |
| 15683.5 | 2.01 |
Patentni zahtevki
Claims (15)
1. Postopek za imobilizacijo encimov v trdne nosilce, značilen po tem, da vsebuje vgraditev (ujetje, omejitev) encima v strukturo SiO2 aerogela iz organosilikonske snovi.
2. Postopek po zahtevku 1, značilen po tem, da se za imobilizacijo uporabijo encimi: lipaze, fosfolipaze, proteaze, esteraze, amilaze, izomeraze, celulaze.
3. Postopek po zahtevku 1, značilen po tem, da se za imobilizacijo uporabi encim lipazo.
4. Postopek po zahtevku 1, značilen po tem, da se encim vnese v strukturo SiO2 aerogela v fazi sol-gel transformacije omenjene organosilikonske snovi v prisotnosti encima.
5. Postopek po zahtevku 1, značilen po tem, da se produkti sol-gel sinteze skupaj z vgrajenim encimom posušijo s postopkom superkritičnega sušenja s plinom.
6. Postopek zmesi po zahtevku 4, značilen po tem, da se za omenjen postopek superkritičnega sušenja uporabijo plini: CO2, freoni (R 23), N2O, di-metileter, alkani, alkeni, njihove zmesi.
7. Postopek po zahtevku 4, značilen po tem, da se za superkritično sušenje uporabi plin CO2.
8. Postopek po zahtevku 4, značilen po tem, da se superkritično sušenje izvede pri temperaturah od 30 do 150°C.
9. Postopek po zahtevku 4, značilen po tem, da se superkritično sušenje izvede pri tlakih od 80 do 400 bar.
10. Postopek po zahtevku 3, značilen po tem, da poteka v prisotnosti vsaj enega katalizatorja.
11. Postopek po zahtevku 7, značilen po tem, da se kot katalizator uporabi bazična snov.
12. Postopek po zahtevku 7, značilen po tem, da se kot katalizator uporabi šibka baza.
13. Postopek po zahtevku 7, značilen po tem, da se kot katalizator uporabi amonijev hidroksid.
14. Imobiliziran encim, dobljen s postopkom po enem ali več izmed zahtevkov 1 do 11.
15. Uporaba imobiliziranega encima, dobljenega po enem ali več izmed zahtevkov 1 do 11, pri reakcijah esterifikacije v superkritičnih fluidih.
Vezava (coupling)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SI200000035A SI20479A (sl) | 2000-02-23 | 2000-02-23 | Postopek za imobilizacijo encimov v trdne nosilce, |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SI200000035A SI20479A (sl) | 2000-02-23 | 2000-02-23 | Postopek za imobilizacijo encimov v trdne nosilce, |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SI20479A true SI20479A (sl) | 2001-08-31 |
Family
ID=20432600
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SI200000035A SI20479A (sl) | 2000-02-23 | 2000-02-23 | Postopek za imobilizacijo encimov v trdne nosilce, |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| SI (1) | SI20479A (sl) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022126959A1 (zh) * | 2020-12-14 | 2022-06-23 | 湖北中烟工业有限责任公司 | 一种基于二氧化硅气凝胶的纳孔固体酸及其制备方法 |
-
2000
- 2000-02-23 SI SI200000035A patent/SI20479A/sl unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022126959A1 (zh) * | 2020-12-14 | 2022-06-23 | 湖北中烟工业有限责任公司 | 一种基于二氧化硅气凝胶的纳孔固体酸及其制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Novak et al. | Silica aerogels as supports for lipase catalyzed esterifications at sub-and supercritical conditions | |
| Dumont et al. | Enzymatic reaction kinetic: comparison in an organic solvent and in supercritical carbon dioxide | |
| de Souza et al. | Protic ionic liquid as additive on lipase immobilization using silica sol–gel | |
| Du et al. | Enzyme nanocapsules armored by metal-organic frameworks: A novel approach for preparing nanobiocatalyst | |
| Carta et al. | Enzymatic synthesis of esters using an immobilized lipase | |
| Blanco et al. | Functionalization of mesoporous silica for lipase immobilization: characterization of the support and the catalysts | |
| Goderis et al. | Lipase‐catalyzed ester exchange reactions in organic media with controlled humidity | |
| Parvaresh et al. | Gas phase transesterification reactions catalyzed by lipolytic enzymes | |
| Lieberman et al. | Hydrolysis of particulate tributyrin in a fluidized lipase reactor | |
| Shakeri et al. | Highly Enantioselective Resolution of β‐Amino Esters by Candida antarctica Lipase A Immobilized in Mesocellular Foam: Application to Dynamic Kinetic Resolution. | |
| Salis et al. | Physical and chemical lipase adsorption on SBA‐15: effect of different interactions on enzyme loading and catalytic performance | |
| Soni et al. | Ester synthesis by lipase immobilized on silica and microemulsion based organogels (MBGs) | |
| Shang et al. | Immobilization of Candida rugosa lipase on ZnO nanowires/macroporous silica composites for biocatalytic synthesis of phytosterol esters | |
| Yuan et al. | PEG-modified lipase immobilized onto NH2-MIL-53 MOF for efficient resolution of 4-fluoromandelic acid enantiomers | |
| Jarzębski et al. | Covalent immobilization of trypsin on to siliceous mesostructured cellular foams to obtain effective biocatalysts | |
| Liu et al. | Enzyme entrapped in polymer‐modified nanopores: the effects of macromolecular crowding and surface hydrophobicity | |
| Adlercreutz | Biocatalysis in non-conventional media | |
| Jiang et al. | Improved performance of lipase immobilized on tannic acid-templated mesoporous silica nanoparticles | |
| Pierre et al. | Influence of the drying technique of silica gels on the enzymatic activity of encapsulated lipase | |
| Veum et al. | The first encapsulation of hydroxynitrile lyase from Hevea brasiliensis in a sol–gel matrix | |
| Maury et al. | Compared esterification kinetics of the lipase from Burkholderia cepacia either free or encapsulated in a silica aerogel | |
| Maury et al. | Influence of the sol–gel chemistry on the activity of a lipase encapsulated in a silica aerogel | |
| AU2019203362B2 (en) | Monolithic cellulose acetate column, its enzyme reactor, preparation method and application | |
| SI20479A (sl) | Postopek za imobilizacijo encimov v trdne nosilce, | |
| WO2006096132A1 (en) | Immobilised enzymes |