SE533937C2

SE533937C2 - Extraction of mussels

Info

Publication number: SE533937C2
Application number: SE0950550A
Authority: SE
Inventors: Bjoern Sivik
Original assignee: Bjarga Ab
Priority date: 2009-07-10
Filing date: 2009-07-10
Publication date: 2011-03-08
Also published as: SE0950550A1

Description

25 30 533 937 2 ningsmedelsextrakt. Lösningsmedlet avlägsnas sedan från extraktet genom nanofiltrering för att framställa ett koncentrerat Iipidextrakt. Lösningsmedlet återvinns och ytterligare lösningsmedel avlägsnas från det koncentrerade extraktet genom rotationsevaporation för att kvarlämna extraherade lipider som är särskilt rika på ETAs (eikosatetraensyror). lWO2005/073354 anges att PUFA-innehållet, där PUFA inkluderar omega-3-syran oktadekatetraen- syra, är anmärkningsvärt högre vid användning av nanofiltrering än vid an- vändning av extraktion med superkritisk koldioxid. 25 30 533 937 2 ningsmedels extract. The solvent is then removed from the extract by nanofiltration to produce a concentrated lipid extract. The solvent is recovered and additional solvents are removed from the concentrated extract by rotary evaporation to leave extracted lipids that are particularly rich in ETAs (eicosatetraenoic acids). WO2005 / 073354 states that the PUFA content, where PUFA includes the omega-3 acid octadecatraenoic acid, is remarkably higher when using nanofiltration than when using extraction with supercritical carbon dioxide.

Extraktion med superkritisk koldioxid framhävs dock i US 6083536 som avser framställning av ett lipidextrakt som är rikt på icke-polära lipider från ett råmusselpulver av Perna canaliculus eller Mytilis edulis. Patentdokumentet är inriktat på en antiinﬂammatorisk behandlingsmetod för människa eller djur genom administrering av lipidextraktet enligt US 6083536.However, extraction with supercritical carbon dioxide is highlighted in US 6083536 which relates to the preparation of a lipid extract rich in non-polar lipids from a raw mussel powder of Perna canaliculus or Mytilis edulis. The patent document is directed to an anti-inflammatory treatment method for humans or animals by administering the lipid extract according to US 6083536.

Ett förfarande för framställning av ett lipidextrakt från musslor beskrivs vidare i WO 2006/128244. Förfarandet innefattar proteasenzymbehandling och kan dessutom genomföras genom användning av extraktion i superkritisk ﬂuid, såsom i t ex superkritisk koldioxid.A process for the preparation of a lipid extract from mussels is further described in WO 2006/128244. The process comprises protease enzyme treatment and can also be carried out by using extraction in supercritical fluid, such as in eg supercritical carbon dioxide.

I WO 2006/052150 beskrivs en komposition innehållande ett mussel- extrakt och kolin eller ett kolinderivat. Kompositionen sägs ha förhöjd anti- inﬂammatorisk aktivitet i jämförelse med musselextrakt som inte innehåller kolin eller kolinderivat. Kompositionen sägs vidare kunna användas för be- handling av inﬂammation, särskilt inﬂammation orsakad av artrit. Vidare be- skrivs ett förfarande för framställning av en komposition innehållande mussel- extraktet och kolin eller ett kolinderivat. Lösningsmedlet som anges kan vara en superkritisk ﬂuid, t ex superkritisk koldioxid.WO 2006/052150 describes a composition containing a mussel extract and choline or a choline derivative. The composition is said to have increased anti-inflammatory activity compared to mussel extracts which do not contain choline or choline derivatives. The composition is further said to be able to be used for the treatment of breastfeeding, especially breastfeeding caused by arthritis. Furthermore, a process for the preparation of a composition containing the mussel extract and choline or a choline derivative is described. The solvent indicated may be a supercritical solvent, eg supercritical carbon dioxide.

I NZ 329G18A beskrivs vidare ett förfarande för erhållande av glykogen med hög renhet från mussler. Förfarandet innefattar behandling av musslorna med ett proteolytlskt enzym, såsom tex pepsln, lvatten Linder ca 3 timmar vid ca 70°C för att ge en uppslarnning av fast återstod och en vattenhaltlg lösning av glykogen, separation av den fasta återstoden från den vattenhaltiga lös- ningen genom tillsats av etanol och sedan utvinning av glykegenet från den vattenhaltlga lösningen. Glykogenet sägs uppvisa alltlllltlammatorisk aktivitet och kunne användas för behandling av artrit. 10 15 20 25 30 533 937 3 Det finns även andra marina råmaterial där extraktion är av intresse.NZ 329G18A further describes a process for obtaining high purity glycogen from mussels. The process comprises treating the mussels with a proteolytic enzyme, such as pepper, water Linder for about 3 hours at about 70 ° C to give a solid residue slurry and an aqueous solution of glycogen, separating the solid residue from the aqueous solution. by adding ethanol and then recovering the glycogen from the aqueous solution. The glycogen is said to exhibit inflammatory activity and could be used to treat arthritis. 10 15 20 25 30 533 937 3 There are also other marine raw materials where extraction is of interest.

Exempelvis lWO 2008l117062 så beskrivs en krilloljekomposition som inne- fattar fosfolipider, astaxantinestrar och/eller omega-3-innehåll. Krilloljekompo- sitionen erhålls från krillkött genom användning av extraktion med superkritisk ﬂuid ien tvåstegsprocess. lsteg 1 avlägsnas den neutrala lipiden genom extraktion med ren superkritisk koldioxid eller koldioxid tillsammans med ca 5% samlösningsmedel för att erhålla en denaturerad krillprodukt. l steg 2 extraheras olja ut från den denaturerade krillprodukten genom användning av superkritisk koldioxid i kombination med ca 20% etanol.For example, WWE 2008117062 describes a krill oil composition comprising phospholipids, astaxanthin esters and / or omega-3 content. The krill oil composition is obtained from krill meat by using extraction with supercritical ﬂ uid in a two-step process. In step 1, the neutral lipid is removed by extraction with pure supercritical carbon dioxide or carbon dioxide together with about 5% co-solvent to obtain a denatured krill product. In step 2, oil is extracted from the denatured krill product using supercritical carbon dioxide in combination with about 20% ethanol.

Utöver substanserna som beskrivs ovan, såsom omega-3-fettsyror och fosfolipider, är det även känt att musslor innehåller andra substanser. Bland annat innehåller toxiska musslor alggiftet okadasyra. Blötdjur, såsom musslor, vilka innehåller mer än 160 pg okadasyra per kilo rå ätbar del, får inte salufö- ras som livsmedel, då dessa kan ge upphov till en magsjukeliknande förgift- ning hos människor. Musslor som innehåller en halt som denna eller högre halt av okadasyra kan därför betraktas som och kallas för toxiska musslor.In addition to the substances described above, such as omega-3 fatty acids and phospholipids, it is also known that mussels contain other substances. Among other things, toxic mussels contain the algal toxin okadaic acid. Molluscs, such as mussels, which contain more than 160 pg of okadaic acid per kilogram of raw edible part, must not be marketed as food, as these can give rise to a stomach-like poisoning in humans. Mussels that contain a content such as this or a higher content of okadaic acid can therefore be considered as and are called toxic mussels.

Förekomsten av okadasyra i t ex blåmusslor är ett stort problem för odlare av blåmusslor i t ex Bohuslän.The presence of okadaic acid in eg mussels is a major problem for mussel growers in eg Bohuslän.

Att det finns okadasyra i toxiska musslor beskrivs även i ES 2161616.The presence of okadaic acid in toxic mussels is also described in ES 2161616.

För att avlägsna okadasyra från toxiska musslor beskrivs två alternativa sätt i ES 2161616. En avvattnad och frystorkad toxisk musselblandning kan bringasi kontakt med en blandning av superkritisk koldioxid och metanol eller etanol. Genom denna extraktion är det möjligt att separera ut opolära lipider, fosfolipider och okadasyra och på så vis kan okadasyran avlägsnas från toxiska musslor. En ren koldioxid, det vill säga endast koldioxid, anses däremot inte vara möjligt att använda. Okadasyran sägs även kunna neutraliseras genom att en blandning av koldioxid och ättiksyra bringasi kontakt med musselblandningen.To remove okadaic acid from toxic mussels, two alternative methods are described in ES 2161616. A dewatered and lyophilized toxic mussel mixture can be contacted with a mixture of supercritical carbon dioxide and methanol or ethanol. Through this extraction it is possible to separate out non-polar lipids, phospholipids and okadaic acid and in this way the okadaic acid can be removed from toxic mussels. On the other hand, pure carbon dioxide, ie only carbon dioxide, is not considered possible to use. The okada acid is also said to be neutralized by a mixture of carbon dioxide and acetic acid brought into contact with the mussel mixture.

Syftet med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett förbättrat förfarande för bearbetning och koldioxidextraktion av musslor. Ett annat syfte med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett förfarande för framställ- ning av okadasyra från toxiska musslor. Ytterligare ett syfte med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett förfarande för framställning av ett extrakt 10 15 20 25 30 533 937 4 som är rikt på DHA-fosfolipid, det vill säga dokosahexaensyrafosfolipid, och som dessutom är helt fritt på musseltoxiner och miljögifter.The object of the present invention is to provide an improved process for processing and carbon dioxide extraction of mussels. Another object of the present invention is to provide a process for the production of okadaic acid from toxic mussels. A further object of the present invention is to provide a process for the preparation of an extract which is rich in DHA phospholipid, i.e. docosahexaenoic acid phospholipid, and which is also completely free of mussel toxins and environmental toxins.

Sammanfattning av uggﬁnningen Syftet enligt föreliggande uppfinning uppnås enligt en specifik utför- ingsform av föreliggande uppfinning medelst ett förfarande för framställning av åtminstone en koncentrerad målkomponent från musslor eller ett redan förbehandlat musselmjöl, varvid förfarandet innefattar följande steg: - eventuell förbearbetning av musslorna till en musselkrossblandning; - extraktion av musselkrossblandningen eller musselmjölet, varvid åtminstone ett extraktionssteg genomförs i ren koldioxid; - bortseparering av koldioxiden och substanser som löser sig däri för bildande av ett musseloljaextrakt innefattande nämnda åtminstone en koncentrerad målkomponent; och - preparativ kromatografi av musseloljaextraktet för möjliggörande av separa- tion och tillvaratagande av nämnda åtminstone en koncentrerad målkompo- nent och varvid nämnda åtminstone en koncentrerad målkomponent är okadasyra (OA), DTX- 1, DTX-2, en eller ﬂera former av DHA-fosfolipider, derivat därav eller en blandning därav.SUMMARY OF THE OWN The object of the present invention is achieved according to a specific embodiment of the present invention by means of a method for producing at least one concentrated target component from mussels or an already pre-treated mussel flour, the method comprising the following steps: - optionally processing the mussels into a mussel crush mixture; extraction of the mussel crusher mixture or the mussel meal, at least one extraction step being carried out in pure carbon dioxide; separating the carbon dioxide and substances which dissolve therein to form a mussel oil extract comprising said at least one concentrated target component; and - preparative chromatography of the mussel oil extract to enable the separation and recovery of said at least one concentrated target component and said at least one concentrated target component being okadacic acid (OA), DTX-1, DTX-2, one or more forms of DHA phospholipids, derivatives thereof or a mixture thereof.

Föreliggande uppfinning syftar bland annat till att visa på möjligheterna att tillvarata olika typer av värdefulla komponenter från musslor. En råvaru- mussla innehåller olika typer av sådana komponenter, såsom tex fett. Andra komponenter som kan vara av intresse är aminoglukaner, vilka idag ges till såväl djur som människor, samt vissa funktionella proteiner. Ett annat exem- pel ärjust okadasyra som finns i högre halter i så kallade toxiska musslor.The present invention aims, among other things, to demonstrate the possibilities of utilizing various types of valuable components from mussels. A raw material mussel contains different types of such components, such as fat. Other components that may be of interest are aminoglucans, which today are given to both animals and humans, as well as certain functional proteins. Another example is okadaic acid, which is found in higher levels in so-called toxic mussels.

Föreliggande uppfinning ger en vägledning hur det skulle kunna vara möjligt att tillvarata olika sådana komponenter för att på så vis erhålla en gynnsam totalekonomi vid bearbetning av musslor.The present invention provides guidance on how it might be possible to utilize various such components in order to obtain a favorable overall economy in the processing of mussels.

Vidare har föreliggande uppﬁnning sin grund i extraktion av musslor med ren koldioxid. Föreliggande uppﬁnning beskriver hur detta är möjligt och bör genomföras. Andra hjälplösningsmedel, såsom etanol, kan användas som hjälpmedel enligt föreliggande uppfinning, men extraktionssteget har sin 10 15 20 25 30 533 937 5 grund i att detta steg genomförs i ren koldioxid, såsom ren superkritisk kol- dioxid. Detta är annorlunda i förhållande till känd teknik, såsom t ex den extraktion som beskrivs enligt ES 2161616. Ett exempel är extraktionen av toxiska musslor enligt föreliggande uppfinning. Enligt föreliggande uppfinning löser sig okadasyran (OA) i ren superkritisk koldloxiden, med hjälp av de komponenter som redan finns i musslan, och ett samlösningsmedel, såsom etanol, behövs således inte nödvändigtvis användas i detta steg om det utförs på rätt sätt. Däremot kan etanol med fördel användas för att effektivisera pro- cessen enligt föreliggande uppfinning på andra sätt, såsom i termer av sepa- ration och utbyte. Såsom framgår enligt föreliggande uppfinning så utförs all- tid åtminstone ett extraktionssteg i ren koldioxid, såsom t ex i ren superkritisk koldioxid eller ren gasformig koldioxid, vilket inte är fallet vid extraktionen enligt ES 2161616.Furthermore, the present invention is based on the extraction of mussels with pure carbon dioxide. The present invention describes how this is possible and should be implemented. Other co-solvents, such as ethanol, may be used as excipients according to the present invention, but the extraction step is based on the fact that this step is carried out in pure carbon dioxide, such as pure supercritical carbon dioxide. This is different from the prior art, such as the extraction described according to ES 2161616. An example is the extraction of toxic mussels according to the present invention. Thus, according to the present invention, the okadaic acid (OA) dissolves in pure supercritical carbon monoxide, using the components already present in the mussel, and thus a cosolvent, such as ethanol, need not necessarily be used in this step if performed properly. However, ethanol can be used to advantage to streamline the process of the present invention in other ways, such as in terms of separation and yield. As can be seen from the present invention, at least one extraction step is always performed in pure carbon dioxide, such as in pure supercritical carbon dioxide or pure gaseous carbon dioxide, which is not the case in the extraction according to ES 2161616.

Nedan beskrivs vidare olika specifika utföringsformer av föreliggande uppfinning.Various specific embodiments of the present invention are further described below.

Kort beskrivning av ﬁguren Fig. 1 åskådliggör schematiskt olika möjliga processvägar, det vill säga såväl torr som våt väg, enligt föreliggande uppfinning.Brief Description of the Figure Fig. 1 schematically illustrates various possible process paths, i.e. both dry and wet paths, according to the present invention.

Deta|'|erad beskrivning av ugpﬁnningen Det finns olika processvägar att gå för att genomföra förfarandet enligt föreliggande uppfinning, såsom framgår från fig. 1. Detta visas nedan med olika speciﬁka utföringsformer av uppfinningen. En av dessa specifika utför- ingsformer eller processvägar skulle kunna kallas för den ”våta process- vägen”. Enligt denna förfarandeväg processas råmusslor, vilket innebär att en mekanisk förbearbetning är av stor vikt. Enligt en speciﬁk utföringsform av föreliggande uppfinning genomförs därför en förbearbetning av musslorna med en grovkrossmetod vari hela musslor bearbetas mekaniskt och avvatt- nas med 70-90%-ig etanol, tex 80%-ig etanol, som därefter tappas av.DETAILED DESCRIPTION OF THE OWN PENSION There are various process paths to follow to carry out the method of the present invention, as shown in Fig. 1. This is shown below with various specific embodiments of the invention. One of these specific embodiments or process paths could be called the “wet process path”. According to this method, mussels are processed, which means that a mechanical pre-processing is of great importance. According to a specific embodiment of the present invention, therefore, a pre-processing of the mussels is carried out by a coarse crushing method in which whole mussels are mechanically processed and dewatered with 70-90% ethanol, eg 80% ethanol, which is then drained.

Etanolblandningen kan såsom nämnts t ex ligga på 80% etanol /20% vatten (vikt%/vikt%) för grovkrossningen. Denna etanolblandning tar upp vatten från musselköttet då dessa blandas samman, vilket leder till att torrsubstanshalten (TS) i musselköttet ökar från cirka 20% till 40-45% (vikt%). På så vis genom- förs en avvattning av musselköttet. Vid avvattningen kan även en okadasyra- 10 15 20 25 30 533 937 6 fraktion utvinnas, vilken OA-fraktion givetvis innehåller mer OA om toxiska musslor bearbetas. En sådan fraktion leds sedan bort för annan ytterligare bearbetning, såsom med nanofiltrering, hydrolys och koldioxidextraktion för utvinning av ett OA-koncentrat.The ethanol mixture can, as mentioned, be, for example, 80% ethanol / 20% water (wt% / wt%) for the coarse crushing. This ethanol mixture absorbs water from the mussel meat when these are mixed together, which leads to the dry matter content (TS) in the mussel meat increasing from about 20% to 40-45% (weight%). In this way, a dewatering of the mussel meat is carried out. During dewatering, an okadaic acid fraction can also be recovered, which OA fraction of course contains more OA if toxic mussels are processed. Such a fraction is then diverted for other further processing, such as by nanofiltration, hydrolysis and carbon dioxide extraction to recover an OA concentrate.

Efter avvattningssteget blandas mussloma med t ex 93-99%-ig etanol, såsom tex 96%-ig etanol, och eventuellt i ﬂera omgångar, och finkrossas så att dess ytor gnids mot varandra för bildande av en skalmusselkrossbland- ning. Därefter avlägsnas skaldelarna för bildande av en musselköttsbland- ning. Under finkrossningen sjunker skalen (den tyngsta fasta fasen) till botten medan musselköttet har lägre densitet och följer med etanolblandningen (vätskefasen), som pumpas i motsatt riktning till ﬁltrering. Den tyngsta fasta fasen, det vill säga skalet, kasseras. Genom att använda denna metod uppnås ﬂera fördelar i jämförelse med traditionella metoder. Genom metoden som beskrivs ovan så erhålls partiklar på cirka 3-4 mm som utgörs av mussel- skal samt kött som är i form av små partiklar. Eftersom det är köttet som man vill komma åt så innebär denna metod fördelar eftersom det blir förhållandevis enkelt att separera bort det krossade skalet.After the dewatering step, the mussels are mixed with, for example, 93-99% ethanol, such as 96% ethanol, and possibly in three batches, and finely crushed so that its surfaces are rubbed against each other to form a shell mussel crushing mixture. The shell parts are then removed to form a mussel meat mixture. During the fine crushing, the shells (the heaviest solid phase) sink to the bottom while the mussel meat has a lower density and follows the ethanol mixture (the liquid phase), which is pumped in the opposite direction for filtration. The heaviest solid phase, ie the shell, is discarded. By using this method, your advantages are achieved compared to traditional methods. Through the method described above, particles of about 3-4 mm are obtained which consist of mussel shells and meat which is in the form of small particles. Since it is the meat that you want to access, this method entails advantages because it becomes relatively easy to separate off the crushed shell.

Det finns vissa kända metoder för bearbetning av musselblandningar utan föregående avvattning. En sådan metod innefattar mixning av finmalda musslor (med skal) och metanol eller etanol i vatten. Detta ger en ytterst små- kornig blandning, vilket inte är fördelaktigt eftersom det då är svårare att separera köttpartiklarna som man vill samla upp.There are some known methods for processing mussel mixtures without prior dewatering. One such method involves mixing finely ground mussels (with shells) and methanol or ethanol in water. This gives an extremely fine-grained mixture, which is not advantageous because it is then more difficult to separate the meat particles that you want to collect.

Metoden för förbearbetning och avvattning av råmusslor enligt före- liggande uppfinning har ﬂera fördelar. För det första är skalseparationen snabb och effektiv och medför att musselköttet håller en god kvalitet. För det andra är hela förbearbetnings- och avvattningsmetoden snabb och kan genomföras på en tid under 30 minuter. Vidare är avvattningen av musslorna effektiv, vilket ger en förhållandevis hög torrhalt för musslorna. Om denna våtvägsprocess enligt föreliggande uppﬁnning jämförs med t ex en torr väg där musslor kokas för att skal ska kunna avlägsnas och där det kvarvarande köttet sedan frystorkas så är förfarandet enligt föreliggande givetvis mycket snabbare, men också mycket mer energisnålt. Ett förfarande med kokning och frystorkning genomförs under 1-2 dagar och innebär förhållandevis stor 10 15 20 25 30 533 937 7 energiförbrukning vid båda delmomenten samt stor risk för skadlig fettoxida- tion.The method for pre-processing and dewatering of raw mussels according to the present invention has ﬂ your advantages. Firstly, the peel separation is fast and efficient and means that the mussel meat is of good quality. Secondly, the whole pre-processing and dewatering method is fast and can be carried out in a time of less than 30 minutes. Furthermore, the dewatering of the mussels is efficient, which gives a relatively high dry content to the mussels. If this wet road process according to the present invention is compared with, for example, a dry road where mussels are boiled so that shells can be removed and where the remaining meat is then freeze-dried, the process according to the present is of course much faster, but also much more energy efficient. A procedure with boiling and freeze-drying is carried out for 1-2 days and involves a relatively large energy consumption at both sub-steps and a high risk of harmful fat oxidation.

Såsom framgår från ovan så tas eventuellt en OA-fraktion till nanofiltre- ring (se fig. 1). Denna ﬁltrering har enligt en specifik utföringsform till syfte att separera olika komponenter med avseende på molekylvikt. Enligt en speciﬁk utföringsform genomförs därför en membranfiltrering (nanofiltrering) på vätskefasen från fastfasseparationen, det vill säga på den fas som innefattar etanol/vatten från avvattningen. Eftersom separeringen genomförs baserat på molekylvikten hos olika komponenter så har önskad målkomponent eller öns- kade målkomponenter stor betydelse för utformningen av ett membranfilter vid användning av detta. Enligt en specifik utföringsform av föreliggande upp- finning är, såsom nämnts ovan, musslorna toxiska musslor och en membran- filtrering (nanoﬁltrering) genomförs på en OA-fraktion utvunnen från awatt- ningen för separation och tillvaratagande av ett OA-koncentrat. En sådan membranfiltrering genomförs i detta fall för att separera bort fria fettsyror och annat möjligt skräp som man inte vill ha kvar. Eftersom okadasyra (okada- syraekvivalenter) har en molekylvikt (MW) av cirka 800 g/mol så kan en så- dan separation genomföras med högt utbyte. Fria fettsyror (FFA) ligger på ett MW av cirka 250 och dessa komponenter och andra med liknade förhållande- vis låga molekylvikter eller ännu lägre kan på så vis avlägsnas från delen innefattande okadasyra. Det är dock viktigt att inse att det i denna enstegs- filtrering inte är möjligt att få ett 100%-igt utbyte och en del fri fettsyra finns således kvar l den fas som innefattar okadasyra. Fasen med hög halt av fri fettsyra och annat ”skräp” kan givetvis tillvaratas och bearbetas för andra ändamål. Etanolen tas tillvara och kan recirkuleras och återanvändas.As can be seen from the above, an OA fraction may be taken for nanofiltration (see Fig. 1). According to a specific embodiment, this filtration has the purpose of separating different components with respect to molecular weight. According to a specific embodiment, therefore, a membrane filtration (nanofiltration) is carried out on the liquid phase from the solid phase separation, i.e. on the phase comprising ethanol / water from the dewatering. Since the separation is carried out based on the molecular weight of different components, the desired target component or desired target components are of great importance for the design of a membrane filter when using it. According to a specific embodiment of the present invention, as mentioned above, the mussels are toxic mussels and a membrane filtration (nano-filtration) is carried out on an OA fraction recovered from the dewatering for separation and recovery of an OA concentrate. Such membrane filtration is performed in this case to separate away free fatty acids and other possible debris that one does not want to keep. Since okadaic acid (okadaic acid equivalents) has a molecular weight (MW) of about 800 g / mol, such a separation can be carried out in high yield. Free fatty acids (FFA) are at a MW of about 250 and these components and others with similarly relatively low molecular weights or even lower can thus be removed from the part comprising okadaic acid. However, it is important to realize that in this one-step filtration it is not possible to obtain a 100% yield and some free fatty acid thus remains in the phase which includes okadaic acid. The phase with a high content of free fatty acid and other "rubbish" can of course be recovered and processed for other purposes. The ethanol is recovered and can be recycled and reused.

Det är givetvis så att okadasyra inte behöver vara målmolekylen enligt föreliggande uppfinning när friska, men faktiskt även toxiska musslor bear- betas. Såsom nämnts ovan så finns även andra komponenter som kan vara av intresse i musslor och som kan tas tillvara enligt föreliggande uppfinning.It is of course the case that okadaic acid does not have to be the target molecule according to the present invention when healthy, but in fact also toxic mussels are processed. As mentioned above, there are also other components which may be of interest in mussels and which may be utilized in accordance with the present invention.

Exempel på sådana är aminoglukaner, vilka kan tillvaratas genom enzym- behandling, olika funktionella proteiner, vilka genom viss bearbetning kan tillvaratas, samt andra komponenter som kan användas i olika fodertyper, såsom foder till kyckling och ﬁsk. Dessutom finns fett i musslor, vilket fett 10 15 20 25 30 533 937 8 innefattar olika komponenter som kan vara värdefulla inom olika segment. En komponent som är av stort intresse är de så kallade fosfolipidema. Om fosfo- lipider är önskvärda kan ovannämnda avvattning med t ex 80%-ig etanol, vil- ket steg kan kallas en förextraktion, tjäna till att avlägsna eventuellt innehåll av OA, DTX-1 och DTX-2, avlägsna eventuellt innehåll av miljögifter, såsom dioxiner, dibensofuraner, PCB och dess ekvivalenter, DDT och dess ekviva- lenter, med ﬂera liknande miljögifter samt avlägsna metylkvicksilver och andra tungmetaller, såsom t ex kadmium. Samtliga dessa farliga ämnen koncentre- ras till slut via membranfiltrering (nanofiltrering, RO) och kastas, bränns upp eller vad som är lämpligt.Examples of such are aminoglucans, which can be recovered by enzyme treatment, various functional proteins, which can be recovered by certain processing, and other components that can be used in different types of feed, such as feed for chicken and so-called. In addition, there is fat in mussels, which fat includes various components that can be valuable in different segments. One component that is of great interest is the so-called phospholipids. If phospholipids are desired, the above-mentioned dewatering with eg 80% ethanol, which step can be called a pre-extraction, can serve to remove any content of OA, DTX-1 and DTX-2, remove any content of environmental toxins, such as dioxins, dibenzofurans, PCBs and their equivalents, DDT and its equivalents, with liknande your similar environmental toxins as well as removing methylmercury and other heavy metals, such as cadmium. All these hazardous substances are finally concentrated via membrane filtration (nanofiltration, RO) and discarded, burned or whatever is appropriate.

Enligt en annan specifik utföringsform genomgår OA-koncentratet efter membranfiltreringen en extraktion i gasformig koldioxid i en kolonn, varvid bortseparation av etanol genomförs. En sådan kolonn kan vara baserad på såväl ”vanlig” som omvänd fas, t ex baserad på silika (silikapartiklar), alumina (aluminiumoxid) eller t ex Florisil. En sådan extraktion kan vidare genomföras vid tex 50°C. Därefter kan trycket sedan ökas till superkritiskt tillstånd. En sådan betingelse kan även användas redan från början. Enligt en specifik ut- föringsform av föreliggande uppfinning genomgår därför OA-koncentratet (det OA-innehàllande extraktet) efter membranfiltreringen en extraktion i super- kritisk koldioxid, eventuellt efter extraktionen igasformig koldioxid, i en kolonn, varvid bortseparation av fria fettsyror (FFA) genomförs, för koncentre- ring av OA i OA-koncentratet och tillvaratagande av detsamma. Det som sedan följer med koncentratet efter denna extraktion är okadasyra samt viss del kvarvarande fri fettsyra. Det som sker i kolonnen är en separation där an- rikning av vissa komponenter äger rum på partiklarna iden ena änden av kolonnen. Givetvis kan olika typer av kolonner och partiklar användas med liknande och olika resultat, och de exempel som anges ovan ska endast ses som just exempel. Till exempel den kemiska beskaffenheten, såsom polarite- ten, hos partiklarna är av stor betydelse för att driva anrikningen på olika sätt.According to another specific embodiment, after the membrane filtration, the OA concentrate undergoes an extraction in gaseous carbon dioxide in a column, whereby ethanol separation is carried out. Such a column can be based on both "ordinary" and reverse phase, eg based on silica (silica particles), alumina (alumina) or eg Florisil. Such an extraction can furthermore be carried out at, for example, 50 ° C. Thereafter, the pressure can then be increased to the supercritical state. Such a condition can also be used from the beginning. According to a specific embodiment of the present invention, therefore, the OA concentrate (the OA-containing extract) undergoes an extraction in supercritical carbon dioxide after the membrane filtration, optionally after the extraction of gaseous carbon dioxide, in a column, whereby separation of free fatty acids (FFA) is carried out , for concentrating OA in the OA concentrate and recovering the same. What then comes with the concentrate after this extraction is okadaic acid and some remaining free fatty acid. What happens in the column is a separation where enrichment of certain components takes place on the particles at one end of the column. Of course, different types of columns and particles can be used with similar and different results, and the examples given above should only be seen as examples. For example, the chemical nature, such as the polarity, of the particles is of great importance for driving the enrichment in different ways.

För att sammanfatta så kan till exempel utvinning av okadasyra genom extraktion göras på följande sätt enligt föreliggande uppﬁnning. Först genom- förs en extraktion igasformig koldioxid vid t ex 50 bar och 50°C. Detta löser etanolen så att denna kan separeras bort. Därefter genomförs en extraktion i 10 15 20 25 30 533 937 9 superkritisk koldioxid, vilket löser fri fettsyra så att denna kan separeras bort.To summarize, for example, the extraction of okadaic acid by extraction can be done in the following manner according to the present invention. First, an extraction of igneous carbon dioxide is carried out at, for example, 50 bar and 50 ° C. This dissolves the ethanol so that it can be separated off. Then an extraction is carried out in supercritical carbon dioxide, which dissolves free fatty acid so that it can be separated off.

Därefter kan etanol användas igen för eluering av nästan ren okadasyra enligt föreliggande uppfinning.Thereafter, ethanol can be used again to elute almost pure okadaic acid according to the present invention.

Det är viktigt att förstå att det enligt föreliggande uppfinning kan finnas andra målkomponenter med denna ”våta väg” enligt föreliggande uppfinning.It is important to understand that according to the present invention there may be other target components with this "wet road" according to the present invention.

Detta gäller även då toxiska musslor bearbetas och okadasyra (OA) önskas.This also applies when toxic mussels are processed and okadaic acid (OA) is desired.

Exempel på sådana komponenter som kan innefattas i OA-koncentratet (det OA-innehållande extraktet) är DTX-1 och/eller DTX-2, vilka nämnts ovan och som också är toxiner i okadasyragruppen och snarlika OA.Examples of such components which may be included in the OA concentrate (the OA-containing extract) are DTX-1 and / or DTX-2, which are mentioned above and which are also toxins in the okada acid group and similar OA.

Såsom framgår från ovan så behöver inte musselråmaterialet förbe- handlas enligt den speciﬁka utföringsformen som beskrivs ovan utan kan även utgå från en annan typ av råmusselmaterial. Enligt en specifik utförings- form av föreliggande uppﬁnning är musselblandningen musselmjöl. Detta innebär att en det inte längre är fråga om en ”våtprocess” utan istället en ”torr- process” enligt föreliggande uppfinning då detta musselmjöl är torrt och inte innehåller nämnvärd halt av vatten . Musselmjölet som på så vis kan använ- das enligt föreliggande uppfinning har förbehandlats med konventionella metoder. Dessa konventionella metoder utgör ej en del av förfarandet enligt föreliggande uppfinning. l fallet med musselmjöl så har musslor som skördats därefter kokats för att avlägsna skal, t ex genom skakning. Därefter torkas musslorna och mals sedan till ett torrt musselmjöl.As can be seen from the above, the mussel raw material does not have to be pretreated according to the specific embodiment described above, but can also be based on another type of raw mussel material. According to a specific embodiment of the present invention, the mussel mixture is mussel flour. This means that it is no longer a question of a “wet process” but instead a “dry process” according to the present invention as this mussel flour is dry and does not contain a significant content of water. The mussel flour which can thus be used according to the present invention has been pretreated by conventional methods. These conventional methods do not form part of the process of the present invention. In the case of mussel flour, mussels that have been harvested have subsequently been boiled to remove shells, for example by shaking. The mussels are then dried and then ground to a dry mussel flour.

Enligt en specifik utföringsform av föreliggande uppfinning används ett musselmjöl som innefattar toxiska musselrester, varvid ett OA-koncentrat (OA-innehållande extrakt) bildas och separeras bort efter extraktion av musselmjölet i koldioxid, t ex överkritisk koldioxid. OA-koncentratet innefattar sedan åtminstone ﬂytande olja samt fri och/eller förestrad OA, DTX-1 och/eller DTX-2. Detta innebär alltså att en del av OA, DTX-1 och DTX-2 ﬁnns i fri form och en del finns iförestrad form.According to a specific embodiment of the present invention, a mussel flour comprising toxic mussel residues is used, whereby an OA concentrate (OA-containing extract) is formed and separated away after extraction of the mussel flour in carbon dioxide, eg supercritical carbon dioxide. The OA concentrate then comprises at least ﬂ surface oil and free and / or esterified OA, DTX-1 and / or DTX-2. This means that some of OA, DTX-1 and DTX-2 are in free form and some are in esterified form.

Enligt en annan specifik utföringsform av föreliggande uppfinning genomförs en hydrolys på OA-koncentrat, vilken hydrolys antingen är en behandling med hydroxidlösning eller en enzymhydrolys, för omvandling av förestrad OA, DTX-1 och/eller DTX-2 till deras respektive syraformer. Ett sådant hydrolyssteg är enligt uppfinningen givetvis tänkbart på ett OA- 10 15 20 25 30 533 937 10 koncentrat oavsett om detta erhållits genom den våta eller torra process- vägen (se ﬁg. 1).According to another specific embodiment of the present invention, a hydrolysis of OA concentrate, which is either a treatment with hydroxide solution or an enzyme hydrolysis, is carried out to convert esterified OA, DTX-1 and / or DTX-2 to their respective acid forms. According to the invention, such a hydrolysis step is of course conceivable on a concentrate, regardless of whether this has been obtained by the wet or dry process path (see ﬁ g. 1).

Om en hydroxidbehandling, t ex med NaOH, genomförs enligt denna speciﬁka utföringsform så erhålls en blandning som alltså är lik den som erhålls enligt den våta processvägen enligt föreliggande uppfinning som beskrivs ovan. Då kan en dubbelsilikarening sedan genomföras, på samma sätt som för den våta processvägen, för att koncentrera upp OA, DTX-1 och/eller DTX-2.If a hydroxide treatment, for example with NaOH, is carried out according to this particular embodiment, a mixture is thus obtained which is thus similar to that obtained according to the wet process path according to the present invention as described above. Then a double silica purification can then be performed, in the same way as for the wet process path, to concentrate OA, DTX-1 and / or DTX-2.

I fallet med enzymhydrolys så kan detta genomföras med hjälp av åt- mlnstone en lipas. Det finns ﬂera llpaser som fungerar väl då det gäller att hydrolysera fettsyraförestrad och diolförestrad OA, DTX-1 och DTX-2, och dessutom fetter, till exempel grispankreaslipas eller grisleveresteras.In the case of enzyme hydrolysis, this can be done by means of at least one lipase. There are ﬂ your llpases that work well when it comes to hydrolyzing fatty acid esterified and diol esterified OA, DTX-1 and DTX-2, and also fats, for example pig pancreatic lipase or pig liver esterase.

Enligt föreliggande uppfinning finns det olika sätt att genomföra kon- centrering av t ex okadasyra i ett extrakt. Enligt en specifik utföringsform av föreliggande uppfinning genomgår OA-koncentratet en extraktion i super- kritisk koldioxid efter hydroxidhydrolys eller före enzymhydrolys, varvid bortseparation av F FA till extraktionen genomförs, för koncentrering av OA i OA-koncentratet och tillvaratagande av detsamma. Extraktionen kan i detta fall, såsom nämnts, t ex genomföras l en kolonn eller i ett nanofilter som släpper igenom FFA och koldioxid men håller tillbaka de större molekylema OA, DTX-1 och DTX-2. Retentatet kan ledas ut till atmosfärstrycket (omgiv- ningen) där extraktet innehållande OA, DTX-1 och/eller DTX-2 samlas upp.According to the present invention, there are various ways of carrying out the concentration of, for example, okadaic acid in an extract. According to a specific embodiment of the present invention, the OA concentrate undergoes an extraction in supercritical carbon dioxide after hydroxide hydrolysis or before enzyme hydrolysis, whereby separation of F FA into the extraction is carried out, for concentrating OA in the OA concentrate and recovering the same. The extraction can in this case, as mentioned, be carried out, for example, in a column or in a nanofilter which passes through FFA and carbon dioxide but retains the larger molecules OA, DTX-1 and DTX-2. The retentate can be led out to atmospheric pressure (the environment) where the extract containing OA, DTX-1 and / or DTX-2 is collected.

Ett nanofilter innebär i detta fall att en hel del lösningsmedel och annat skräp passerar nanofiltret medan OA, DTX-1 och/eller DTX-2 hålls tillbaka av nanofiltret. l exempel 1 nedan visas ett exempel på framställning av ett OA-inne- hållande extrakt enligt föreliggande uppfinning där den "torra vägen” åskådlig- görs och där användningen av en kolonn eller ett nanofilter enligt ovan för- klaras. Även betingelserna i själva processen kan vara av betydelse för extraktionen enligt föreliggande uppﬁnning. Enligt en speciﬁk utföringsform genomförs extraktionsförfarandet enligt föreliggande uppfinning i en konti- nuerlig process där trycket för extraktionen är 300-500 bar. Enligt en annan 10 15 20 25 30 533 937 11 speciﬁk utföringsform av föreliggande uppﬂnning så är trycket i processen, efter hydrolysen, sänkt till 200-275 bar och ett OA-koncentrat kan pà så vis separeras bort från en ström innefattande stor andel FFA och liten andel OA, DTX-1 och/eller DTX-2. Detta OA-koncentrat enligt ovan kan sedan skickas till preparativ kromatografi för vidare rening.A nanofilter in this case means that a lot of solvent and other debris passes the nanofilter while OA, DTX-1 and / or DTX-2 are held back by the nanofilter. Example 1 below shows an example of the preparation of an OA-containing extract according to the present invention in which the "dry path" is illustrated and in which the use of a column or a nanofilter as explained above is explained. According to a specific embodiment, the extraction process according to the present invention is carried out in a continuous process where the pressure for the extraction is 300-500 bar.According to another specific embodiment of the present invention then the pressure in the process, after the hydrolysis, is lowered to 200-275 bar and an OA concentrate can thus be separated away from a stream comprising a large proportion of FFA and a small proportion of OA, DTX-1 and / or DTX-2. concentrate as above can then be sent to preparative chromatography for further purification.

Orsaken till möjligheten att via en trycksänkning fälla ut OA, DTX-1 och/eller DTX-2 är att OA-molekylen är större än FFA molekylen, 800 respek- tive 250 MW, vilket innebär att lösligheten i koldioxid för dessa två molekyl- slag skiljer sig kraftigt åt. Eftersom lösligheten är direkt proportionell mot trycket så resulterar en viss trycksänkning som är vald så att den ligger inom ett visst intervall i att OA-koncentratet fälls ut medan FFA förblir löst i kol- dioxiden.The reason for the possibility of precipitating OA, DTX-1 and / or DTX-2 via a pressure drop is that the OA molecule is larger than the FFA molecule, 800 and 250 MW, respectively, which means that the solubility in carbon dioxide for these two molecule types differs greatly. Since the solubility is directly proportional to the pressure, a certain pressure drop that is selected so that it is within a certain range results in the OA concentrate precipitating while FFA remains dissolved in the carbon dioxide.

Enligt en annan specifik utföringsform av föreliggande uppfinning recir- kuleras strömmen som innefattar stor andel FFA och liten andel OA, DTX-1 och/eller DTX-2 till extraktionen.According to another specific embodiment of the present invention, the stream comprising a large proportion of FFA and a small proportion of OA, DTX-1 and / or DTX-2 is recycled to the extraction.

För att ge ett exempel på denna tryckreduktion i en process enligt före- liggande uppﬂnning så beskrivs nedan en variant på en processuppställning.To give an example of this pressure reduction in a process according to the present invention, a variant of a process set-up is described below.

Denna uppställning skulle kunna innefatta en extraktor E för t ex torrt mussel- mjöl. Efter denna extraktor E återfinns en behållare för immobiliserat enzym ENZ, följt av en första tryckreduceringsventil V1 och en första separator S1.This arrangement could include an extractor E for eg dry mussel flour. Following this extractor E is a container for immobilized enzyme ENZ, followed by a first pressure reducing valve V1 and a first separator S1.

Detta àterföljs därefter av en andra tryckreduceringsventil V2 och en andra separator S2. E och ENZ arbetar vid högt tryck med ren koldioxid, t ex i inter- vallet 250-350 bar eller 350-500 bar. I koldioxiden löses olja samt OA, DTX-1, DTX-2 och fettsyraförestrad OA, DTX-1, DTX-2 samt diol-OA. När extraktet passerar ENZ sä hydrolyseras estrarna, och det bildas fri OA, DTX1 och DTX-2 samt FFA, även av triglyceriderna som utgör oljan.This is then followed by a second pressure reducing valve V2 and a second separator S2. E and ENZ operate at high pressure with pure carbon dioxide, for example in the range 250-350 bar or 350-500 bar. The carbon dioxide dissolves oil as well as OA, DTX-1, DTX-2 and fatty acid esterified OA, DTX-1, DTX-2 and diol-OA. When the extract passes ENZ, the esters are hydrolyzed, and free OA, DTX1 and DTX-2 and FFA are formed, also by the triglycerides that make up the oil.

Därefter sänks trycket via V1 till t ex ett tryck i intervallet 150-250 bar (om trycket i E var 250-350 bar) eller till t ex ett tryck in intervallet 250-350 bar (om trycket i E var 350-500 bar). Såsom nämnts, OA-familjen (OA, DTX-1 och DTX-2) har molekylvikt runt 800 medan FFA ligger i intervallet av 200-340.Then the pressure is reduced via V1 to eg a pressure in the range 150-250 bar (if the pressure in E was 250-350 bar) or to eg a pressure in the range 250-350 bar (if the pressure in E was 350-500 bar) . As mentioned, the OA family (OA, DTX-1 and DTX-2) has a molecular weight around 800 while the FFA is in the range of 200-340.

Konsekvensen är att lösligheten av OA reduceras snabbare ju mer trycket faller medan lösligheten av FFA reduceras långsammare och fortfarande är ansenlig vid t ex 200 bar. Det innebär att den sämre lösliga OA-familjen kan 10 15 20 25 30 533 937 12 fås att falla ut i S1 medan Iöslighet för FFA fortfarande är ansenlig. Alltså an- rikas OA-familjen i S1.The consequence is that the solubility of OA is reduced more rapidly the more the pressure drops, while the solubility of FFA is reduced more slowly and is still considerable at, for example, 200 bar. This means that the less soluble OA family can be caused to fall out in S1 while solubility for FFA is still considerable. In other words, the OA family is enriched in S1.

Därefter kan tänkas att trycket sänks ytterligare i S2, tex till 50 bar. Då hamnar FFA där. Likaså skulle koldioxidströmmen kunnas ta ut ur S1 och le- das tillbaka till E ett varv till. Denna ström innehållerju redan lösta FFA (me- dan OA föll ut och återfinns i ett precipitat på botten av behållaren S1 ). Kon- sekvensen blir då att extraktionhastigheten totalt ökar och att framställnlngs- processen förkortas då halten OA ökar i extraktet. Detta extrakt kan sedan tas till SPE rening, eller möjligen rentav direkt till preparativ kromatografi.Then it is conceivable that the pressure is lowered further in S2, for example to 50 bar. Then FFA ends up there. Likewise, the carbon dioxide current could be taken out of S1 and led back to E one more lap. This stream contains seven already dissolved FFAs (while OA precipitated and is found in a precipitate at the bottom of the container S1). The consequence will then be that the extraction speed increases in total and that the production process is shortened as the content of OA increases in the extract. This extract can then be taken for SPE purification, or possibly even directly for preparative chromatography.

Såsom framgår från ovan så finner föreliggande uppfinning användning för såväl friska som toxiska musslor. Däremot kan detta få betydelse för hur förfarandet designas eftersom màlmolekylerna i dessa två olika fall ofta inte är desamma. Enligt en specifik utföringsform av föreliggande uppfinning så innefattar mussloma toxiska musslor eller innefattar musselmjölet toxiska musselrester, och där nämnda åtminstone en koncentrerad målkomponent som framställs är OA, DTX-1 och/eller DTX-2, eller derivat därav, vilka genom den preparativa kromatografin kan utvinnas och separeras från varandra, om nödvändigt.As can be seen from the above, the present invention finds use in both healthy and toxic mussels. However, this may have an impact on how the process is designed because the target molecules in these two different cases are often not the same. According to a specific embodiment of the present invention, the mussels comprise toxic mussels or the mussel flour comprises toxic mussel residues, and wherein said at least one concentrated target component is OA, DTX-1 and / or DTX-2, or derivatives thereof, which by the preparative chromatography can extracted and separated from each other, if necessary.

Enligt en annan specifik utföringsform av föreliggande uppfinning så är musslorna friska enligt definition, det vill säga icke-toxiska. Även de icke- toxiska musslorna är av intresse att förbehandla enligt föreliggande uppfinnig.According to another specific embodiment of the present invention, the mussels are healthy by definition, i.e. non-toxic. The non-toxic mussels are also of interest for pretreatment according to the present invention.

Förbearbetningen av dessa friska musslor görs enligt föreliggande uppfinning på principiellt samma sätt som då toxiska musslor bearbetas. Enligt den våta processvägen kan musslorna därför först genomgå en grovkrossning vari musslorna tillplattas för bildande av en grovmusselkrossblandning. En sådan grovmusselkrossblandnlng kan enligt uppﬁnningen sedan avvattnas i ett etanolbad, i t ex 80%-ig etanol, eller genomgå en saltlakeavvattning, därefter finkrossas med tillsättning av t ex 96%-ig etanol, eventuellt i ﬂera omgångar, och genomgå skalbortseparation, varefter en musselkött/etanolblandning tillvaratas. Vid grosskrossningen kan alltså etanolhalten i ett sådant etanolbad ligga på cirka 80%. Etanolhalten ska inte ligga för lågt eftersom detta inte ger en god separation. Å andra sidan ska den inte ligga alltför högt eftersom det då finns risk för att fettet från mussloma följer med vid separationen. Etanolen 10 15 20 25 30 533 937 13 från grovkrossningen avtappas och därefter tillsätts ny t ex 96%-ig etanol, eventuellt i ﬂera omgångar. Då ett fosfolipidextrakt är det som önskas erhållas enligt föreliggande uppfinning så ska alltså etanolhalten ligga på en nivå som ger god separation, som säkerställer att fettet återfinns i önskad fas och att andra oönskade substanser kan avlägsnas. Sådana substanser är till exem- pel musseltoxiner i toxiska musslor, såsom OA vilken kan vara en av mål- molekylerna annars, men som i detta fall måste separeras bort från fettfasen, samt andra typer av gifter, såsom dioxiner, PCB, DDT, miljögifter och tung- metaller (t ex kvicksilver och kadmium). Eftersom koncentreringen önskas drivas mycket långt så kan det vara av relativt sett stor vikt att avlägsna olika typer av gifter. Detta innebär alltså att detta awattningssteg i själva verket även fungerar som ett reningssteg då eventuell okadasyra och dess syskon DTX-1 och DTX-2, samt tungmetaller och andra gifter följer med etanolfasen och alltså inte i fettfasen. I När det gäller avvattnings- och reningssteget så kan detta genomföras iﬂera steg. Enligt en specifik utföringsform av föreliggande uppfinning genom- förs finkrossningen med åtminstone ytterligare en tvättning i etanolbad med tex ny 96%-ig etanol. Detta steg kan alltså göras i ﬂera omgångar, såsom tex 3 gånger. Analyser tas efter hand genom att prover tas ut och analyseras kontinuerligt tills att vattenhalten är tillräckligt låg. Under dessa steg kan alltså tex en 96%-ig etanol användas i etanolbadet. De sista stegen kan även göras i överkritisk (100-500 bar/35-70°C) eller vätskefonnig (70-200 bar/10-30 °C) koldioxid plus etanol i upp till 30% etanolinblandning, vilket då kan minska mängden etanol som behöver indunstas. Efter finkrossningen och skalbort- separationen genomförs en ﬁltrerlng av den erhållna musselkött/etanol- blandning (se ﬁg. 1). Musselköttet avlägsnas sedan i extraktionsförfarandet enligt föreliggande uppfinning (se återigen fig. 1). Enligt en specifik utförings- form av föreliggande uppﬁnning tillvaratas därför en musselkött/etanolbland- ning efter skalseparationen, vilken musselkött/etanolblandning genomgår en filtrering och ytterligare extraktion samt musselköttsavlägsnande för tillvara- tagande av en väsentligen vattenfri musselolje/etanolblandning.The preprocessing of these healthy mussels is done according to the present invention in basically the same way as when toxic mussels are processed. According to the wet process route, the mussels can therefore first undergo a coarse crushing in which the mussels are flattened to form a coarse mussel crushing mixture. According to the invention, such a coarse mussel crusher mixture can then be dewatered in an ethanol bath, in eg 80% ethanol, or undergo a brine dewatering, then finely crushed with the addition of eg 96% ethanol, possibly in two batches, and undergo peel separation, after which a mussel meat / ethanol mixture is recovered. During the crushing, the ethanol content of such an ethanol bath can thus be about 80%. The ethanol content should not be too low as this does not provide a good separation. On the other hand, it should not be too high as there is then a risk that the fat from the mussels will follow the separation. The ethanol 10 15 20 25 30 533 937 13 from the coarse crushing is drained and then new, for example 96% ethanol, is added, possibly in two batches. Thus, since a phospholipid extract is what is desired to be obtained according to the present invention, the ethanol content should be at a level which provides good separation, which ensures that the fat is found in the desired phase and that other undesirable substances can be removed. Such substances are, for example, mussel toxins in toxic mussels, such as OA which may be one of the target molecules otherwise, but which in this case must be separated away from the fat phase, as well as other types of toxins, such as dioxins, PCBs, DDTs, environmental toxins and heavy metals (eg mercury and cadmium). Since the concentration is desired to be driven very far, it can be of relatively great importance to remove different types of toxins. This means that this dewatering step in fact also functions as a purification step as any okadaic acid and its siblings DTX-1 and DTX-2, as well as heavy metals and other toxins follow with the ethanol phase and thus not in the fat phase. I Regarding the dewatering and purification step, this can be done in ﬂ your steps. According to a specific embodiment of the present invention, the fine crushing is carried out with at least one further washing in an ethanol bath with, for example, new 96% ethanol. This step can thus be done in ﬂ your rounds, such as 3 times. Analyzes are taken gradually by taking samples and analyzing them continuously until the water content is sufficiently low. During these steps, for example, a 96% ethanol can be used in the ethanol bath. The last steps can also be done in supercritical (100-500 bar / 35-70 ° C) or liquid (70-200 bar / 10-30 ° C) carbon dioxide plus ethanol in up to 30% ethanol mixture, which can then reduce the amount of ethanol which need to be evaporated. After fine crushing and peeling separation, a filtration of the resulting mussel meat / ethanol mixture is carried out (see ﬁ g. 1). The mussel meat is then removed in the extraction process of the present invention (see again Fig. 1). According to a specific embodiment of the present invention, a mussel meat / ethanol mixture is therefore recovered after the shell separation, which mussel meat / ethanol mixture undergoes a filtration and further extraction as well as mussel meat removal to prepare a substantially anhydrous mussel oil / ethanol mixture.

Den väsentligen vattenfria musselolje/etanolblandningen kan enligt föreliggande uppfinning sedan tillföras till en kontinuerlig process med kol- 10 15 20 25 30 533 937 14 dioxidextraktion och koncentrering av ett DHA-fosfolipidinnehållande extrakt. Även torrt musselmjöl kan enligt föreliggande uppfinning genomgå den torra processvägen så att en sådan väsentligen vattenfri musselolje/etanolbland- ning skapas, vilken sedan på samma vis som ovan kan tillföras till en konti- nuerlig process med koldioxidextraktion och koncentrering av ett DHA- fosfolipidinnehållande extrakt (se ﬁg. 1). Enligt en speciﬁk utföringsform av föreliggande uppﬁnning används därför ett torrt musselmjöl som först even- tuellt genomgår en ren koldioxidextraktion och därefter en koldioxidletanol- extraktion för bildande av en väsentligen vattenfri musselolje/etanolblandning efter lämplig bortseparation av mjölrester.According to the present invention, the substantially anhydrous mussel oil / ethanol mixture can then be fed to a continuous process by carbon dioxide extraction and concentration of a DHA-phospholipid-containing extract. According to the present invention, dry mussel flour can also undergo the dry process path so that such a substantially anhydrous mussel oil / ethanol mixture is created, which can then be added in the same way as above to a continuous process with carbon dioxide extraction and concentration of a DHA phospholipid-containing extract ( see ﬁ g. 1). According to a specific embodiment of the present invention, therefore, a dry mussel flour is used which first possibly undergoes a pure carbon dioxide extraction and then a carbon dioxide ethanol extraction to form a substantially anhydrous mussel oil / ethanol mixture after suitable separation of flour residues.

Precis såsom enligt ovan så kan processen enligt föreliggande upp- finning designas specifikt för att öka separationsgraden. Enligt en speciﬁk utföringsform innefattar därför den kontinuerliga processen åtminstone ett trycksänkningssteg efter extraktionssteget för koncentrering av DHA-fosfolipi- der i det DHA-fosfolipidinnehållande extraktet. Detta fungerar principiellt på samma vis som beskrivits för S1 och S2 ovan.Just as above, the process of the present invention can be specifically designed to increase the degree of separation. According to a specific embodiment, therefore, the continuous process comprises at least one pressure lowering step after the extraction step for concentrating DHA-phospholipids in the DHA-phospholipid-containing extract. This works in principle in the same way as described for S1 and S2 above.

Det finns även andra möjliga utformningar för en process enligt förelig- gande uppfinning. Enligt en specifik utföringsform av föreliggande uppfinning genomgår den väsentligen vattenfria musselolje/etanolblandningen en indunstning där etanolen separeras bort och musseloljan tillvaratas och som sedan genomgår extraktion i ren koldioxid, såsom superkritisk koldioxid, för separation och tillvaratagande av fosfolipider i musseloljan. För att tillvarata fosfolipider i musselolja enligt ovan så hade det inte varit lämpligt att genom- föra detta steg i gasformig koldioxid samt etanol eftersom detta hade medfört att fosfolipider hade följt med i båda faserna. Med andra ord skulle processer enligt känd teknik, såsom enligt ES 2161616, inte vara lämpliga att använda för detta ändamål.There are also other possible designs for a process according to the present invention. According to a specific embodiment of the present invention, the substantially anhydrous mussel oil / ethanol mixture undergoes an evaporation in which the ethanol is separated off and the mussel oil is recovered and which then undergoes extraction in pure carbon dioxide, such as supercritical carbon dioxide, to separate and recover phospholipids in the mussel oil. In order to recover phospholipids in mussel oil as above, it would not have been appropriate to carry out this step in gaseous carbon dioxide and ethanol as this would have meant that phospholipids had followed in both phases. In other words, processes according to the prior art, such as according to ES 2161616, would not be suitable for use for this purpose.

Såsom framgår enligt nedan så är föreliggande uppfinning, enligt en specifik utföringsform, inriktad på framtagande av ett extrakt som är rikt på vissa speciella typer av fosfolipider. Enligt en speciﬁk utföringsform är därför nämnda åtminstone en koncentrerad målkomponent åtminstone en DHA- fosfolipid, såsom DHA-PC, DHA-Lyso PC, DHA-PE, DHA-PS och/eller DHA- 10 15 20 25 30 533 937 15 Pl eller en blandning därav, vilka kan användas som eller i ett läkemedel eller som kosttillskott.As will be seen below, according to a specific embodiment, the present invention is directed to the preparation of an extract which is rich in certain particular types of phospholipids. According to a specific embodiment, therefore, said at least one concentrated target component is at least one DHA phospholipid, such as DHA-PC, DHA-Lyso PC, DHA-PE, DHA-PS and / or DHA-10 mixtures thereof, which can be used as or in a medicine or as a dietary supplement.

Såsom allmänt känt så är omega-3-fettsyror av intresse för människors hälsa. Bland annat anses fetter som innefattar stor andel omega-3 nyttiga och effekter som sådana fetter medför är bland annat sänkning av blodfetter, blodtryck och minskad risk för hjärt- och kärlsjukdomar, förbättring av hjär- nans kapacitet, ökning av mängden serotonin i hjärnan och därmed lindrande av depressioner, bekämpning av inﬂammationer i hjärnans celler och blodkärl samt att cellmembraner blir mer mjuka och elastiska. En speciell typ av omega-3 som finns i större andel i fisk- och skaldjur är ovannämnda DHA (dokosahexaensyra), vilken utgör fokus i föreliggande ansökan. DHA har ock- så positiva effekter som de som beskrivs ovan, och är särskilt av intresse då det gäller funktioner i hjäman och kognition. Det finns idag många personer som får i sig för lite DHA alternativt som inte får tillräckligt mycket DHA att nå vitala ställen i hjärnan. Det är därför av intresse att tillhandahålla preparat eller lösningar eller liknande som innefattar DHA, t ex som kosttillskott eller faktiskt som läkemedel.As is well known, omega-3 fatty acids are of interest to human health. Among other things, fats that contain a large proportion of omega-3 are considered useful and effects that such fats cause include lowering blood fats, blood pressure and reduced risk of cardiovascular disease, improving the capacity of the brain, increasing the amount of serotonin in the brain and thus relieving depression, combating inflammation in the cells and blood vessels of the brain and making cell membranes softer and more elastic. A special type of omega-3 that is present in a larger proportion in seafood is the above-mentioned DHA (docosahexaenoic acid), which is the focus of the present application. DHA also has positive effects such as those described above, and is of particular interest when it comes to functions in the brain and cognition. There are many people today who get too little DHA or who do not get enough DHA to reach vital places in the brain. It is therefore of interest to provide preparations or solutions or the like which contain DHA, for example as a dietary supplement or actually as a medicine.

DHA kan förekomma som DHA-triglycerid eller DHA-fosfolipid. Det finns ett problem med DHA då denna förekommer i triglyceridform. Biotill- gängligheten är inte speciellt hög för denna form då blod-hjärnbarriären utgör ett hinder för denna. Det samma är inte fallet då det gäller DHA-fosfolipider och biotillgängligheten är faktiskt cirka 50 gånger högre i hjärnan för denna form i förhållande till DHA i triglyceridform. Att tillhandhålla ett koncentrat/- extrakt med rikliga nivåer/halter av DHA-fosfolipider bör därför vara av stort intresse för allmänheten. Ett sådant extrakt skulle t ex kunna ges till barn för att öka kognitionen eller som ett nyttigt kosttillskott eller rentav läkemedel till alla och envar för att medföra de positiva effekter som beskrivs ovan. Att till- handahålla ett sådant extrakt är ett av syftena enligt föreliggande uppfinning.DHA can be present as DHA triglyceride or DHA phospholipid. There is a problem with DHA as it occurs in triglyceride form. Bioavailability is not particularly high for this form as the blood-brain barrier is an obstacle to this. The same is not the case with DHA phospholipids and the bioavailability is actually about 50 times higher in the brain for this form compared to DHA in triglyceride form. Provision of a concentrate / extract with abundant levels / levels of DHA phospholipids should therefore be of great interest to the public. Such an extract could, for example, be given to children to increase cognition or as a useful dietary supplement or even medicine to everyone and everyone to bring about the positive effects described above. Providing such an extract is one of the objects of the present invention.

Studier har visat på fördelar med fosfolipider som bärare för DHA.Studies have shown the benefits of phospholipids as carriers for DHA.

Bland annat har studier visat på en förbättring avseende kognitionen hos bam, i så kallade prestationstester. Andra studier har visat att intag av DHA- fosfolipidföda åstadkommer en anrikning av DHA i hjärnan, det vill säga att 10 15 20 25 30 533 937 16 biotillgängligheten för denna form av DHA är högre än i förhållande till DHA- triglyceridblandningar.Among other things, studies have shown an improvement in cognition in children, in so-called performance tests. Other studies have shown that intake of DHA-phospholipid diet provides an enrichment of DHA in the brain, i.e. that the bioavailability of this form of DHA is higher than in relation to DHA-triglyceride mixtures.

Vidare ﬁnns studier som visar på de positiva effekterna som intag av DHA-fosfolipid innebär. Detta äri såväl hjärna som genom anrikning på andra ställen i kroppen, såsom i lever, lungor, plasma och blodet. DHA-fosfolípider kan alltså ha positiva effekter på hälsan och vara effektivt för att förbättra kognitionen, men kan även ha effekt vid återhämtning av vissa störningar. Vid till exempel ryggmärgsskador och hjärnskador så visar vissa studier på att DHA-fosfolipidintag kan vara lindrande och till och med effektfullt för att för- bättra tillståndet. Exempel på tillstånd som kan behandlas är oxidativ stress, inflammatoriska reaktioner, störningar på nervceller och axonal skada. Resul- tat som till exempel kan uppnås är skydd för nervceller, återuppbyggnad och återhämtning av nervtrådar, minskad oxidation i hjärnan samt återhämtning av rörelseförmåga vid olika typer av tillstånd.Furthermore, there are studies that show the positive effects that intake of DHA-phospholipid entails. This is in the brain as well as through enrichment in other places in the body, such as in the liver, lungs, plasma and blood. DHA phospholipids can thus have positive effects on health and be effective in improving cognition, but can also have an effect on the recovery of certain disorders. In the case of spinal cord injuries and brain injuries, for example, some studies show that DHA-phospholipid intake can be relieving and even effective in improving the condition. Examples of conditions that can be treated are oxidative stress, inflammatory reactions, disorders of nerve cells and axonal damage. Results that can be achieved, for example, are protection of nerve cells, reconstruction and recovery of nerve fibers, reduced oxidation in the brain and recovery of mobility in various types of conditions.

Föreliggande uppﬁnning avser vidare ett fosfolipidextrakt innefattande åtminstone 90 vikt% fosfolipider eller derivat därav, varvid åtminstone 20 vikt% av fosfolipiderna eller derivaten därav är DHA-fosfolipider eller derivat därav. Detta innebär att föreliggande uppfinning beskriver ett extrakt som innefattar höga halter av fosfolipider, av vilka DHA-fosfolipider står för en förhållandevis hög andel. Dessa DHA-fosfolipider kan, såsom nämnts, vara åtminstone en av DHA-PC, DHA-Lyso PC, DHA-PE, DHA-PS eller DHA-PI, eller en blandning därav. Det vanligaste fallet enligt föreliggande uppﬁnning är att en blandning av dessa olika DHA-fosfolipider erhålls i extraktet enligt före- liggande uppfinning.The present invention further relates to a phospholipid extract comprising at least 90% by weight of phospholipids or derivatives thereof, wherein at least 20% by weight of the phospholipids or derivatives thereof are DHA-phospholipids or derivatives thereof. This means that the present invention describes an extract comprising high levels of phospholipids, of which DHA phospholipids account for a relatively high proportion. These DHA phospholipids may, as mentioned, be at least one of DHA-PC, DHA-Lyso PC, DHA-PE, DHA-PS or DHA-PI, or a mixture thereof. The most common case of the present invention is that a mixture of these various DHA phospholipids is obtained in the extract of the present invention.

Extraktet som beskrivs enligt föreliggande exempel skiljer sig från extrakt som beskrivs i känd teknik deﬁnierad ovan. Extrakten enligt känd teknik innefattar betydligt högre halter triglycerider och med andra ord inte lika höga halter fosfolipider. Dessutom innefattar dessa extrakt enligt känd teknik inte lika höga halter DHA-fosfolipider.The extract described according to the present example differs from extracts described in the prior art defined above. The extracts according to the prior art comprise significantly higher levels of triglycerides and in other words not as high levels of phospholipids. In addition, these prior art extracts do not contain as high levels of DHA phospholipids.

Såsom framgår så är föreliggande uppﬁnning inriktad på bearbetning och extraktion av musslor och musselblandningar. Däremot är det viktigt att förstå att även andra marina råvaror är möjliga att använda enligt föreliggan- de uppfinning för att framställa ett DHA-fosfolipidinnehållande extrakt enligt 10 15 20 25 30 533 937 17 uppfinningen. Exempel på sådana marina råvaror är olika musseltyper och musselblandningar, t ex torkat musselmjöl, men även krillolja, räkrom, olika typer av fiskoljor, tängräkor och andra räkor, krabbor, och blandningar därav, vissa idag outnyttjade fisksorter samt marina biprodukter. Från vissa sådana råvaror är det alltså möjligt att framställa ett DHA-fosfolipidinnehållande extrakt enligt föreliggande uppfinning.As can be seen, the present invention is directed to the processing and extraction of mussels and mussel mixtures. On the other hand, it is important to understand that other marine raw materials can also be used according to the present invention to produce a DHA-phospholipid-containing extract according to the invention. Examples of such marine raw materials are different types of mussels and mussel mixtures, such as dried mussel flour, but also krill oil, shrimp, various types of fish oils, seaweed shrimp and other shrimp, crabs, and mixtures thereof, some currently unused fish species and marine by-products. From certain such raw materials it is thus possible to prepare a DHA-phospholipid-containing extract according to the present invention.

Enligt en specifik utföringsform av föreliggande uppfinning innefattar fosfolipidextraktet åtminstone 99 vikt% fosfolipider eller derivat därav, varvid mängden DHA-fosfolipider eller derivat därav är i intervallet av 25-50 vikt%, såsom en mängd av DHA-fosfolipider eller derivat därav i intervallen 25-45, 25-40, 25-35, 25-30, 30-50, 30-45, 30-40, 30-35, 35-50, 35-45, 35-40, 40-50, 40-45 och 45-50 vikt%.According to a specific embodiment of the present invention, the phospholipid extract comprises at least 99% by weight of phospholipids or derivatives thereof, the amount of DHA-phospholipids or derivatives thereof being in the range of 25-50% by weight, such as an amount of DHA-phospholipids or derivatives thereof in the range of 25- 45, 25-40, 25-35, 25-30, 30-50, 30-45, 30-40, 30-35, 35-50, 35-45, 35-40, 40-50, 40-45 and 45-50% by weight.

Ett fosfolipidextra kt enligt föreliggande uppfinning har höga halter DHA- fosfolipider och är dessutom är helt fritt från farliga ämnen. Med tanke på det senare är det viktigt att förstå att alla farliga substanser och annat ”skräp” som ﬁnns i vissa av dessa marina råvaror måste avskiljas så att de inte ham- nar i det DHA-fosfolipidinnehällande extraktet enligt föreliggande uppfinning.A phospholipid extract of the present invention has high levels of DHA phospholipids and is also completely free of hazardous substances. In view of the latter, it is important to understand that all hazardous substances and other "debris" found in some of these marine raw materials must be separated so that they do not end up in the DHA phospholipid-containing extract of the present invention.

För till exempel musslor är det därför vidare viktigt att inse att även ätbara musslor kan innehålla okadasyra och att det som skiljer ätbara musslor från icke-ätbara musslor endast är ett bestämt gränsvärde, nämligen just 160 ug okadasyra per kilo rå ätbar del. Därför, vid framställning av ett fosfolipidinne- hållande extrakt även från ätbara musslor, är det av stor vikt att separera bort eventuell okadasyra så att denna inte hamnar i det fosfolipidinnehållande extraktet. Även i ett sådant fall kan det givetvis vara av intresse att ta tillvara okadasyran och koncentrera upp denna i ett separat extrakt. Hur detta går till beskrivs ovan. Eftersom fosfolipider vidare inte löser sig i ren koldioxid så är det vidare fullt möjligt att separera fosfolipider från triglycerider (se fig. 1).For mussels, for example, it is therefore important to realize that edible mussels can also contain okadaic acid and that what distinguishes edible mussels from non-edible mussels is only a certain limit value, namely just 160 ug of okadaic acid per kilo of raw edible part. Therefore, when preparing a phospholipid-containing extract also from edible mussels, it is of great importance to separate off any okadaic acid so that it does not end up in the phospholipid-containing extract. Even in such a case, it may of course be of interest to utilize the okada acid and concentrate it in a separate extract. How this is done is described above. Furthermore, since phospholipids do not dissolve in pure carbon dioxide, it is quite possible to separate phospholipids from triglycerides (see Fig. 1).

Vidare är det inte endast eventuell OA som är möjlig att separera bort enligt föreliggande uppfinning så att ett rent extrakt innefattande DHA-fosfo- lipider kan erhållas enligt uppfinningen. Andra sådana farliga substanser som kan separeras bort är t ex sådana som beskrivs ovan, såsom dioxiner, PCB, DDT, miljögifter och tungmetaller (t ex kvicksilver och kadmium). Dä förfaran- det enligt föreliggande uppfinning medför att oönskade och farliga substanser, 10 15 20 25 30 533 937 18 såsom t ex tungmetaller, kvicksilverinnehållande föreningar och olika miljö- gifter (t ex PCB, DDT), kan avlägsnas kan på så vis renheten iextraktet hållas på en mycket hög nivå. Vissa av dessa substanser är mycket viktig att avlägsna då de kan passera blod-hjärnbarriären. Med andra ord kan även mycket små halter av dem vara viktigt att separera bort och avlägsna så att de inte ﬁnns i slutextraktet som ska konsumeras.Furthermore, it is not only any OA that is possible to separate away according to the present invention so that a pure extract comprising DHA phospholipids can be obtained according to the invention. Other such hazardous substances that can be separated off are, for example, those described above, such as dioxins, PCBs, DDT, environmental toxins and heavy metals (eg mercury and cadmium). Since the process of the present invention means that undesirable and dangerous substances, such as heavy metals, mercury-containing compounds and various environmental toxins (eg PCBs, DDT), can be removed, the purity of the extract can thus be removed. kept at a very high level. Some of these substances are very important to remove as they can cross the blood-brain barrier. In other words, even very small concentrations of them can be important to separate away and remove so that they are not in the final extract to be consumed.

Extraktet enligt föreliggande uppfinning kan inkapslas i olika former, och kan t ex innehållas i täta kapslar som konsumeras av en människa. lnne- hållet frigörs sedan efter förtäring och DHA-fosfolipiderna kan på så vis nå hjärnan hos denna slutkonsument.The extract of the present invention may be encapsulated in various forms, and may, for example, be contained in dense capsules consumed by a human. The content is then released after ingestion and the DHA phospholipids can thus reach the brain of this end consumer.

Beskrivning av ﬁguren l fig. 1 visas ett allmänt processchema för olika möjliga vägar enligt föreliggande uppfinning. Dessa olika vägar utgår från antingen våt process- väg där hela musslor bearbetas eller torr processväg där musselmjöl är startmaterialet. Vidare visas exempel på hur olika målextrakt är möjliga att erhålla, såsom OA-, DTX-1- eller DTX-2-innehållande extrakt från toxiska musslor eller DHA-fosfolipidinnehållande extrakt från ätbara musslor eller musselmjöl.Description of Figure 1 Fig. 1 shows a general process diagram for various possible paths according to the present invention. These different paths are based on either a wet process path where whole mussels are processed or a dry process path where mussel flour is the starting material. Furthermore, examples are shown of how different target extracts are possible to obtain, such as OA-, DTX-1 or DTX-2-containing extracts from toxic mussels or DHA-phospholipid-containing extracts from edible mussels or mussel flour.

Exemgel Exemgel 1. Extraktion av toxiskt musselkött enligt den ”torra vägen” enligt föreliggande uggfinning, för erhållande av ett OA-innehållande extrakt Ett musselmjöl innefattande cirka 5 mg OA/kg torrt musselkött bearbe- tas, det vill säga extraheras i ren koldioxid enligt föreliggande uppfinning. Ett OA-innehållande extrakt innefattande åtminstone ﬂytande olja samt fri och förestrad OA. Under denna extraktion så har oljemängden relativt mot mäng- den okadasyra minskat. Därefter genomförs en hydrolys, såsom en enzym- hydrolys, och då övergår den förestrade okadasyran till dess syraformer. I oljan som återstår finns nu fortfarande cirka 5 mg OA samt cirka 0,5-1,0 g FFA. Oljan blandas och skakas sedan med etanol. Genom indunstning kokas sedan en stor andel etanol bort. Eftersom FFA då fälls ut så separeras OA och FFA, och andelen OA ökar således iförhållande till FFA. På den kvarva- rande lösningen som innehåller etanol, FFA samt OA genomförs därefter en så kallad SPE (solid phase extraction) på en silikakolonn. Genom att först 10 15 20 25 30 533 937 19 genomföra ett steg med gasformig koldioxid (50 bar, 50°C) och därefter ett steg med superkritisk koldioxid (200-350 bar), med efterföljande eluering, kan sedan OA koncentreras i ett extrakt innehållande cirka 5 mg OA och cirka 20 mg FFA (kallat OA-innehållande extrakt). Det som möjliggör denna koncen- trering är faktumet att varm gasformig koldioxiden drar med sig etanolen var- efter den superkritiska koldioxiden drar med sig FFA selektivt. På så vis koncentreras andelen OA upp successivt. Den slutgiltiga blandningen med cirka 1 del OA och 4 delar FFA går sedan till preparativ kromatograﬁ för att OA ska kunna separeras ytterligare från FFA.Exemgel Exemgel 1. Extraction of toxic mussel meat according to the "dry way" according to the present invention, to obtain an OA-containing extract A mussel flour comprising about 5 mg OA / kg dry mussel meat is processed, i.e. extracted into pure carbon dioxide according to the present invention. invention. An OA-containing extract comprising at least ﬂ surface oil and free and esterified OA. During this extraction, the amount of oil relative to the amount of okadaic acid has decreased. Thereafter, a hydrolysis, such as an enzyme hydrolysis, is carried out, and then the esterified okada acid turns into its acid forms. The remaining oil now still contains about 5 mg of OA and about 0.5-1.0 g of FFA. The oil is mixed and then shaken with ethanol. Evaporation then boils off a large proportion of ethanol. Since FFA is then precipitated, OA and FFA are separated, and the proportion of OA thus increases in relation to FFA. On the remaining solution containing ethanol, FFA and OA, a so-called SPE (solid phase extraction) is then performed on a silica column. By first carrying out a step with gaseous carbon dioxide (50 bar, 50 ° C) and then a step with supercritical carbon dioxide (200-350 bar), with subsequent elution, OA can then be concentrated in an extract. containing about 5 mg of OA and about 20 mg of FFA (called OA-containing extract). What makes this concentration possible is the fact that hot gaseous carbon dioxide entrains the ethanol, after which the supercritical carbon dioxide selectively entrains FFA. In this way, the proportion of OA is gradually concentrated. The final mixture with about 1 part OA and 4 parts FFA then goes to preparative chromatography ﬁ so that OA can be further separated from FFA.

Allmänt kan sägas att utbytet av okadasyra ökar med ett ökat tryck, såsom med ett utbyte av OA av 40-45% vid cirka 250 bar och 40°C till ett utbyte av OA av 85-95% vid cirka 500 bar och 40°C i ren koldioxid. Vid ett högre tryck är det vidare möjligt att sänka förbrukningen av koldioxid, trots ökat utbyte av OA.In general it can be said that the yield of okadaic acid increases with an increased pressure, such as with a yield of OA of 40-45% at about 250 bar and 40 ° C to a yield of OA of 85-95% at about 500 bar and 40 ° C in pure carbon dioxide. At a higher pressure, it is also possible to reduce the consumption of carbon dioxide, despite increased yield of OA.

Vid jämförelse med en extraktion i blandning av koldioxid och etanol så är extraktion i ren koldioxid vid högt tryck, såsom vid 500 bar, enligt förelig- gande uppfinning såväl enkelt som råvaru- och energisnålt. gxempel 2._DHA-fosfolipitïnnehållande extrakt enliqt föreliggande uppﬁnning Ett DHA-fosfolipidinnehållande extrakt framställdes enligt föreliggande uppfinning. Det sista extraktionssteget enligt föreliggande uppfinning genom- fördes i ren koldioxid för att möjliggöra god separation av triglycerider och fosfolipider från varandra. l det fosfolipidinnehållande extraktet fanns 24 vikt% DHA-fosfolipider och cirka 60% EPA-fosfolipider (dubbelprov användes vid analysen). Enligt föreliggande uppﬁnning skulle denna koncentrering av DHA- fosfolipider i extraktet kunna ökas. Med referensförsök har påvisats att upp till åtminstone 40 vikt% DHA-fosfolipider skulle vara möjligt i det DHA-fosfolipid- innehållande extraktet enligt föreliggande uppfinning. Andelen DHA-fosfo- lipider som är möjlig beror givetvis dels på hur långt föreliggande koncentre- ring genomförs, men dels även på råvaran som används. Därför bör nivåer upp till 50 vikt% DHA-fosfolipider vara möjligt enligt föreliggande uppfinning.When compared with an extraction in a mixture of carbon dioxide and ethanol, extraction in pure carbon dioxide at high pressure, such as at 500 bar, according to the present invention is both simple and raw material and energy efficient. Example 2._DHA-phospholipitin-containing extract according to the present invention A DHA-phospholipid-containing extract was prepared according to the present invention. The final extraction step of the present invention was performed in pure carbon dioxide to enable good separation of triglycerides and phospholipids from each other. The phospholipid-containing extract contained 24% by weight of DHA phospholipids and about 60% of EPA phospholipids (duplicate was used in the analysis). According to the present invention, this concentration of DHA phospholipids in the extract could be increased. Reference experiments have shown that up to at least 40% by weight of DHA phospholipids would be possible in the DHA phospholipid-containing extract of the present invention. The proportion of DHA phospholipids that is possible depends, of course, partly on how far the present concentration is carried out, but also partly on the raw material used. Therefore, levels up to 50% by weight of DHA phospholipids should be possible according to the present invention.

Claims

10 15 20 25 30 533 937 20 AMENDED REQUIREMENTS

A method for producing at least one concentrated target component from mussels or an already pre-treated mussel flour, the method comprising the following steps: - optionally pre-processing the mussels into a mussel crusher mixture; extraction of the mussel crusher mixture or the mussel meal, at least one extraction step being carried out in pure carbon dioxide; separating the carbon dioxide and substances which dissolve therein to form a mussel oil extract comprising said at least one concentrated target component; and - preparative chromatography of the mussel oil extract to enable the separation and recovery of said at least one concentrated target component, and said at least one concentrated target component being okadaic acid (OA), DTX-1 (dinophysiotoxin-i), DTX-2-din (dinophysiotin-2) one or ﬂ your forms of DHA phospholipids, derivatives thereof or a mixture thereof, and wherein said at least one concentrated target component in the case of OA is completely free of environmental toxins by performing membrane filtration on an recovered OA fraction and in the case of one or ﬂ your forms of DHA phospholipids completely free of environmental toxins and mussel toxins.

A method according to claim 1, wherein pre-processing of the mussels is carried out with first a coarse crushing in which whole mussels are mechanically processed, then a dewatering, then a crushing and peeling separation to form a mussel meat mixture.

Process according to claim 2, wherein the coarse crushing is carried out with the addition of 70-90% ethanol and the fine crushing is carried out with the addition of 93-99% ethanol, the latter optionally with the addition in ﬂ your batches. 10 15 20 25 30 533 937 21

The method of claim 3, wherein the mussels are toxic mussels and a membrane filtration (nanofiltration) is performed on an OA fraction recovered from the dewatering to separate and recover an OA concentrate.

A process according to claim 4, wherein the OA concentrate after the membrane filtration undergoes an extraction in gaseous carbon dioxide in a column, wherein removal of ethanol is carried out.

A process according to claim 4 or 5, wherein the OA concentrate after the membrane filtration undergoes an extraction in supercritical carbon dioxide, optionally after the extraction of gaseous carbon dioxide, in a column, wherein removal of free fatty acids (FFA) is carried out, for concentration of OA in OA the concentrate and its recovery.

The method of claim 1, wherein a mussel flour is used which comprises toxic mussel residues and wherein an OA concentrate is formed and separated away after extraction of the mussel flour in carbon dioxide.

A process according to any one of the preceding claims, wherein hydrolysis is carried out on the OA concentrate, which hydrolysis is either a treatment with hydroxide solution or an enzyme hydrolysis, to convert esterified OA, DTX-1 and / or DTX-2 to their respective acid forms .

The method of claim 8, wherein an enzyme hydrolysis is performed using at least one lipase.

A process according to claim 8 or 9, wherein the OA concentrate undergoes an extraction in supercritical carbon dioxide after hydroxide hydrolysis or before enzyme hydrolysis, wherein separation of FFA into the extraction is carried out, for concentrating OA in the OA concentrate and recovering the same.

Process according to any one of the preceding claims, wherein the process is carried out in a continuous process where the pressure for the extraction is 300-500 bar. 10 15 20 25 30 533 937 22

Process according to claim 11, wherein the pressure after the hydrolysis in the process is lowered to 200-275 bar and a concentrated OA concentrate can thus be separated away from a stream comprising a large proportion of FFA and a small proportion of OA, DTX-1 and / or DTX-2.

The method of claim 12, wherein the stream comprising a large proportion of FFA and a small proportion of OA, DTX-1 and / or DTX-2 is recycled to the extraction.

A method according to any one of the preceding claims, wherein the mussels comprise toxic mussels or the mussel flour comprises toxic mussel residues and wherein said at least one concentrated target component produced is OA, DTX-1 and / or DTX-2, or derivatives thereof, which by the preparative chromatography can be extracted and separated from each other, if necessary.

A method according to any one of claims 1-3, wherein a mussel meat / ethanol mixture is recovered after the shell separation, which mussel meat / ethanol mixture undergoes an filtration and further extraction as well as mussel meat removal to recover a substantially anhydrous mussel oil ethanol mixture.

A process according to claim 1, wherein a dry mussel flour is used which first optionally undergoes a pure carbon dioxide extraction and then a carbon dioxide / ethanol extraction to form a substantially anhydrous mussel oil / ethanol mixture after suitable separation of flour residues.

A process according to claim 15 or 16, wherein the substantially anhydrous mussel oil ethanol mixture undergoes an evaporation in which the ethanol is separated off and the mussel oil is recovered and then undergoes extraction in pure carbon dioxide for separation and recovery of phospholipids in the mussel oil.

A process according to any one of claims 15-17, wherein the substantially anhydrous mussel oil / ethanol mixture is fed to a continuous process by extracting isucritical carbon dioxide and concentrating a DHA-phospholipid-containing extract.

The method of claim 18, wherein the continuous process comprises at least one depressurization step after the extraction step of concentrating DHA phospholipids in the DHA phospholipid-containing extract.

Phospholipid extract comprising at least 90% by weight of phospholipids or derivatives thereof, wherein at least 20% by weight of the phospholipids or derivatives thereof are DHA phospholipids or derivatives thereof and wherein the phospholipid extract is completely free of environmental toxins and any mussel toxins.

Phospholipid extract according to claim 20, comprising at least 99% by weight of phospholipids or derivatives thereof, wherein the amount of DHA phospholipids or derivatives thereof is in the range of 25-50% by weight.

Mussel meat free from environmental toxins and toxic mussel toxins, which mussel meat is produced by a separation during a carbon dioxide-ethanol extraction following a process according to claim 7.