SE527664C2 - Metod och anordning för att reproducerbart mäta och kvantifiera intracellulära objekt - Google Patents

Description

25 30 CH 53 CN Ch .än bilder på histologiska preparat med skepticism, då forskaren själv valt ut bilderna. Det är dessutom ofta omöjligt att reproducera bilderna.

Inom forskningen kring hjärt-kärlsjukdomar och cancer, har studier av intracellulära objekt såsom lipiddroppar och vesikler blivit ytterst viktiga (Unger RH, Lipotoxic diseases, Annu Rev Med. 2002;53:3l9~36. Hammar SP, Metastatic adenocarcinoma of unknown primary origin, Hum Pathol. 1998 Dec;29(12):l393-402), varvid ett stort behov finns för metoder för att studera dessa.

I US 5991028 A visas ett system för cellklassificering varvid cellerna färgas och fotograferas, varefter den fotograferade bilden digitaliseras. Därefter studeras den digitaliserade bilden genom att varje pixel klassificeras efter utseendet på dess spektra. Dessa jämförs sedan med utseenden hos referensspektra varvid cellen i sin helhet klassificeras.

Systemet används framförallt för att detektera och kategorisera olika celltyper och systemet fordrar ett stort bibliotek av lagrade referensspektra för att kunna fastställa cellens tillstànd.

I WO 03091729 Al visas en grafisk metod för att undersöka sjuka celler där undersökningen innefattar färgning, fotografering och digitalisering av cellerna enligt samma metod som omnämns i US 5991028 A ovan. Därefter analyseras ett uppkommet färgspektra och jämförs med tidigare lagrade spektra för att bestämma cellens kondition. Även denna metod kräver ett stort bibliotek av lagrade referensspektra för att kunna fastställa cellens tillstànd.

I US 3919530 A anges ett system för att analysera celler baserat på färgspektra hos ett blodprov. Analysen àstadkoms genom att man skannar ett blodprov och filtrerar 10 15 20 25 30 (Ü BJ w Ch Ch .fin resultatet för att erhålla ett kvantifierat färgspektra.

Resultatet av detta färgspektra konverteras till elektronisk data som sedan behandlas matematiskt.

Inte i något av ovannämnda dokument anges en metod som ger möjlighet att exakt och reproducerbart mäta och kvantifiera intracellulära objekt. Dessa kan vara organeller såsom kärnor, mitokondrier etc, eller mindre objekt såsom lipiddroppar och vesikler. Objekten skall gå att skilja ut genom att de har en färg som skiljer sig från omgivningen.

Redogörelse för uppfinningen Syftet med föreliggande uppfinning är således att tillgodose en metod och en anordning som löser de ovan nämnda problemen. Sagda ändamål uppnås medelst en metod enligt föreliggande uppfinning som i huvudsak kännetecknas av att analyseringssteget innefattar följande steg: analysering av färgerna på den digitala bildens pixlar och sammansättning av pixlar vars våglängder har värden som ligger mellan vissa förutbestämda övre och undre gränsvärden, med intilliggande pixlar vars våglängder också har värden som ligger mellan dessa förutbestämda övre och undre gränsvärden, bildandes specifika objekt av sagda sammanslagna pixlar och registrera antalet av sagda specifika objekt.

Syftet uppnås också med en anordning som i huvudsak kännetecknas av att anordningen innefattar ett datorprogram med medel för att analysera den digitala bildens pixlar och medel för att sätta samman pixlar vars våglängder har värden som ligger mellan vissa förutbestämda övre och undre gränsvärden, med intilliggande pixlar vars våglängder också har värden som ligger mellan dessa förutbestämda övre och undre gränsvärden, och för att registrera antalet av sagda specifika objekt. 10 15 20 25 30 LW NJ sa o\ O\ .Ps Föredragna utföringsformer anges av underkraven.

Kortfattad figurbeskrivning Uppfinningen kommer i det följande att på ett icke begränsande sätt och av illustrativa skäl beskrivas under hänvisning till bifogade figurer i vilka: Figur 1 visar ett digitalt foto av en cell.

Figur 2 visar fotot i figur 1 med cirklar runt om cellens objekt.

Figur 3 visar en digital avbildning av objekten urklippta ur fotot i figur l.

Figur 4 visar antal av och storlek pà de intracellulära objekten.

Figur 5 visar storleken på varje grupp av objekt i förhållande till objektens sammanlagda storlek.

Figur 6 visar antal av och volym hos de intracellulära objekten.

Detaljerad beskrivning av uppfinningen Närmast kommer med hjälp av figurerna, ett tillvägagångssätt vid kvantifiering av lipiddroppar i fettceller, i enlighet med ett fördelaktigt utförande av föreliggande uppfinning, att beskrivas. Informationen som önskas erhållas är: Antal lipiddroppar i celler, storlek på de lipiddroppar som hittas och den sammanlagda arean av de lipiddroppar som hittas.

En fettcell med lipiddroppar odlas pà ett täckglas och färgas med hematoxylin och Oil Red O för att visualisera cellkärna och lipiddroppar. Därefter monteras täckglaset på ett objektsglas och cellerna fotograferas i ett mikroskop med en upplösning som tydligt återger de intracellulära objekt som ska 10 15 20 25 30 U1 N) \J O\ o\ .lås kvantifieras. Bilderna digitaliseras och sparas i exempelvis JPEG-format (figur 1). Därefter analyseras bilden enligt uppfinningen; alla punkter/pixlar på bilden avläses och de som bedöms befinna sig inuti en lipiddroppe 1 identifieras på originalbilden med hjälp av globala och lokala färgkontraster.

Dessa punkters position (var i bilden de befinner sig) undersöks sedan för att avgöra vilka av de utvalda punkterna som är belägna inuti samma lipiddroppe 1. Dessa punkter sätts samman och resulterar i att sammanhängande strukturer med punkter som bedöms vara inuti en lipiddroppe 1 identifieras - det vill säga lipiddroppen. Lipiddropparna erhåller sedan var sin cirkel 2 (visas i figur 2) för att bedöma specificiteten / selektiviteten. Lipiddropparna ”klipps” även ut (figur 3) för att ytterligare påvisa att ingenting som inte är en lipiddroppe har hittats.

I samband med fotograferingen, fotograferas även en mikroskopisk linjal, som jämförs med den aktuella bilden. Detta ger ett värde pà upplösningen (pixlar/pm).

De funna lipiddropparna kategoriseras sedan efter storlek (hur många punkter de innehåller) och jämförs med upplösningen för att få ett värde på den egentliga storleken på lipiddroppen, mätt i um i diameter.

Information om hur många lipiddroppar som finns i bilden av olika storlekar plottas sedan (figur 4). Ytterligare ett diagram avseende hur många punkter som befinner sig i lipiddroppar av en viss storlek, i förhållande till totala antalet punkter visas i figur 5. Den senare ger en uppfattning om vilka lipiddroppar som är mest karakteristiska för cellen.

Figur 4 visar att det till antalet finns flest lipiddroppar i storlekskategorin 0,2 - 0,8 um i diameter. Dock framgår i figur 5, att den mest karakteristiska kategorin av 10 15 20 25 30 UH NJ \J O\ OR .Fu droppar (som har störst total area av dropparna) är i storleken 1,9 - 2,1 um i diameter.

Vilka punkter/pixlar som bedöms tillhöra en lipiddroppe påverkas av att det tröskelvärde som måste överskridas för att en punkt skall anses tillhöra ett objekt kan påverkas manuellt och är beroende av vilket färgämne som används. I exemplet användes Oil Red O, vilket färgar neutral lipid röd, varvid ett tröskelvärde sattes till att rött/(grönt+blàtt) skall vara större än 0.7 för att en punkt skall bedömas vara del av en lipiddroppe.

Genom att behandla ett prov som skall undersökas med olika färgämnen kan de i provet ingående objekt som önskas mätas och kvantifieras, anta skiftande färger. Genom att bestämma flera olika tröskelvärden kan man sålunda mäta och kvantifiera ett flertal ämnen som ingår i provet. Alla objekt som ligger mellan övre och undre tröskelvärdena 0.5 och 0.6 kan exempelvis tillhöra ämne A, de objekt som ligger mellan 0.6 och 0.7 kan exempelvis tillhöra ämne B, de objekt som ligger mellan 0.7 och 0.8 kan exempelvis tillhöra ämne B osv. Pâ detta sätt kan undersökningarna effektiviseras och en helhetsbild ges av de olika intracellulära objekten.

Användningen av datoriserad analys av bilder i digitalt format syftar till att ge en exakt och reproducerbar kvalitativ och kvantitativ analys. Man kan härmed föra vetenskapliga bevis enbart från digitala bilder av histologiska preparat.

Exemplet ovan avser enbart 2-dimensionell analys, men även 3-dimensionell analys kan utföras, varvid objektens antal men även dess volym kan fastställas. Man gör då på motsvarande sätt som visats ovan men fotograferingen sker i ett konfokalt mikroskop. Man erhåller då en 3-dimensionell bild vilken digitaliseras och alla element på bilden avläses och de som 10 15 20 25 30 01 NJ \J O\ O\ .ß- bedömdes befinna sig inuti ett objekt identifieras pà originalbilden med hjälp av globala och lokala färgkontraster.

Dessa elements position (var i bilden de befinner sig) undersökes sedan för att avgöra vilka av de utvalda elementen som är belägna inuti samma objekt. Dessa element paras ihop och resulterar i att sammanhängande strukturer med element som bedöms vara inuti ett specifikt objekt identifieras.

Genom att studera ett prov under en viss tid kan även objektens tillväxt, sammanslagning och rörelser mätas och analyseras - så kallad 4-dimensionell analys. Fotograferingen sker även då i ett ”spinning disc confocal microscope” men uppdateras med jämna mellanrum med exempelvis 30 sekunder mellan fotografierna. Resultatet från en sådan studie redovisas i figur 6. Vid studien uppmättes medeltalet droppar per tidsenhet till 419, antal sammanslagningar till 91 och medelmotiliteten hos droppar mindre än 50 pixlar till 1 um/s.

En användare av ett datorprogram som bygger pà uppfinningen kan själv välja tröskelvärden, noggrannhet vid digitaliseringen av bilden - det vill säga storleken pà pixlarna, tidsintervallet mellan fotograferingarna samt mikroskopets förstoring.

Uppfinningen är framförallt intressant när en eller flera av följande punkter berörs 1. Analys av bilder på preparat vilka behandlats med färgkarakteristiska markörer. 2. Identifiering, kvantifiering och mätning av sammanhängande intracellulära strukturer efter deras färg och uttryck i bilden. 3. Identifiering av strukturer som immunohistokemiska markörer, cellorganeller, lipiddroppar och vesikler.

LH NJ ~a ON ON .län Naturligtvis är uppfinningen inte begränsad till de utföranden som beskrivits ovan och illustrerats på de bifogade ritningarna. Modifieringar är möjliga, speciellt beträffande de olika delarnas beskaffenhet, eller genom användning av jämför- bara tekniker, utan att man för den skull fràngàr det i patentkraven angivna skyddsomràdet.

Claims (9)

10 15 20 25 30 01 AJ \J (v. g\ 4:.. PAIENTKRAV

1. Metod för att reproducerbart mäta och kvantifiera intracellulära objekt, till exempel organeller såsom kärnor, mitokondrier etc, eller andra mindre objekt såsom lipiddroppar eller vesikler, vilken innefattar följande steg: - färgning av cellerna med lämplig färg, - fotografering av cellerna med förstoring, - digitalisering av de fotograferade bilderna och - analysering av sagda bild med ett datorprogram, kännetecknad därav, att analyseringssteget innefattar följande steg: - analysering av färgerna på den digitala bildens pixlar, - sammansättning av pixlar vars våglängder har värden som ligger mellan vissa förutbestämda övre och undre gränsvärden, med intilliggande pixlar vars våglängder också har värden som ligger mellan dessa förutbestämda övre och undre gränsvärden, bildandes specifika objekt av sagda sammanslagna pixlar och - registrering av antalet sagda specifika objekt.

2. Metod enligt patentkrav 2, kännetecknad därav, att analyseringssteget innefattar analys av cellerna med hjälp av ett konfokalt mikroskop för att erhålla en 3-dimensionell analys. 10 15 20 25 30 527 664 10

3. Metod enligt något av ovan nämnda patentkrav, kännetecknad därav, att analysen sker kontinuerligt och innefattar stegen: mätning och analys av objektens tillväxt, sammanslagning och rörelser.

4. Metod enligt något av ovan nämnda patentkrav kännetecknad därav, att den innefattar steget att registrera de specifika objektens utseende.

5. Metod enligt något av ovan nämnda patentkrav kännetecknad därav, att den innefattar steget att registrera de specifika objektens storlek.

6. Metod enligt något av ovan nämnda patentkrav kännetecknad därav, att analysen sker av intracellulära, _färgbara objekt vilka utgöres av immunohistokemiska markörer, cellorganeller, lipiddroppar och/eller vesikler.

7. Metod enligt något av ovan nämnda patentkrav kännetecknad därav, att analyseringssteget innefattar analysering av färgen på varje pixel.

8. Anordning för att reproducerbart mäta och kvantifiera intracellulära objekt till exempel organeller såsom kärnor, mitokondrier etc, eller andra mindre objekt såsom lipiddroppar eller vesikler, varvid anordningen innefattar medel att analysera färgade, förstorade och fotograferade celler vars bilder digitaliserats, kännatecknad därav, att anordningen innefattar ett datorprogram med medel för att analysera den digitala bildens pixlar och medel för att sätta samman pixlar vars våglängder har värden som ligger mellan vissa förutbestämda 10 01 h) \J ax Qx rm ll övre och undre gränsvärden, med intilliggande pixlar vars våglängder också har värden som ligger mellan dessa förutbestämda övre och undre gränsvärden, och för att registrera antalet av sagda specifika objekt.

9. Anordning enligt patentkrav 8, kännetecknad därav, att anordningen innefattar eller är sammankopplad med ett konfokalt mikroskop för 3-dimensionell analys.