SE510363C2 - Användning av en flytande kristallin fas för att bestämma fördelningen av en kemisk substans mellan en hydrofob och en hydrofil miljö - Google Patents

Description

1 Qæoåfzåmvmc (m, 10 25 Ett traditionellt sätt att mäta en kemisk substans preferens för endera en hydrofob miljö eller en hydrofil miljö är att sätta substansen ifråga till ett system be- (1971) Chem Oktanol är en alkohol med mycket låg stående av oktanol och vatten (se t ex Leo m fl Rev 7l:525-616). löslighet i vatten och får representera den hydrofoba miljön. Efter att jämvikt ställt in sig, kan koncentratio- nen av substansen ifråga bestämmas i dels oktanolfasen, dels vattenfasen. Den kvot som erhålles mellan koncentra- tionerna, [substans]OktanO1/[substans]vatten, brukar benäm- nas fördelningskoefficient och betecknas Koktanol/vatten.

En substans med förkärlek för oktanolfasen kommer att ge ett värde pä Koktanol/vatten som är större än 1, medan en substans med förkärlek för vatten ger ett värde som är mindre än l. En fördel med denna metod är att förfarandet är enkelt och att de ingående substanserna är billiga.

Ett problem med systemet oktanol/vatten är emeller- tid, att det dåligt imiterar den situation som räder i levande organismer, där den hydrofoba miljön ofta utgörs av cellmembran och endast i undantagsfall av kolväte i bulkfas. lamellärt biskikt av polära lipider, Cellmembranets struktur består av ett s k där det inre av membranet i de flesta fall kan liknas vid betingelserna hos ett vätskeformigt kolväte. Ett alternativ till systemet oktanol/vatten skulle därför vara att använda ett system, där den hydrofoba miljön representeras av lamellära biskikt av polära lipider.

Lamellära biskikt kan antingen erhållas från cell- membran, t ex röda blodkroppar, eller i form av på konst- gjord väg tillverkade vesiklar av membranlipider (se t ex (1994) l:273-282). En gemensam egenskap hos dessa system är, att Pauletti & Wunderli-Allenspach Eur J Pharm Sci användningen av dem för att bestämma fördelningen av en substans omfattar komplexa preparations- och separations- steg jämfört med systemet oktanol/vatten. Detta gör mem- 10 U 20 30 960903 Pflsvsoizuboc GG/bn 3 510 363 bransystemen mindre lämpade för rutinanalys. De med mem- bransystemen bestämda fördelningskoefficienterna har dock visat sig ge intressant information, som kompletterar resultaten fràn systemet oktanol/vatten, vilket väl moti- verar användandet av alternativ till det senare.

Beskrivning av uppfinningen Föreliggande uppfinning uppfyller dels kravet på att bättre representera de hydrofoba miljöerna i levande orga- nismer, dels kravet pà enkel hantering. Den hydrofoba miljön utgörs enligt uppfinningen av biskikt av polära lipider organiserade i form av en kubisk flytande kristal- Den kubiska fasen utmärks dessutom av att den kan att den lin fas. existera i jämvikt med en omgivande vattenlösning, har mycket hög viskositet.

Det är av stor fördel att vid användning enligt upp- finningen lipiderna i den kubiska fasen kan tillverkas av ett brett spektrum av biologiskt relevanta lipider. Sådana lipider kan vara biologiska lipider, semisyntetiska lipi- der, syntetiska lipider eller blandningar därav. Exempel på biologiska lipider i den kubiska fasen är monoglycerider, sfingolipider eller blandningar fosfolipider, glykolipider, av dessa, men de utgöres företrädesvis av monoglycerider.

Exempel på monoglycerider är glycerylmonooleat, glycerylmonolinoleat samt glycerylmonolinolenat, och blandningar av dessa kan även användas. Även en blandning av monoglycerider och fosfolipider kan utnyttjas vid användning av den kubiska fasen enligt uppfinningen, varvid en blandning av diacylfosfatidylkolin och diacyl- fosfatidyletanolamin företrädesvis användes.

Den kubiska fasens inre struktur medför, att den på molekylär nivà liknar de membranstrukturer som finns hos celler och vesiklar. Den fasta konsistensen hos den kubiska fasen medför dessutom, att den mycket lätt kan separeras från en omgivande vattenlösning. Genom att flera typer av 960903 P:\S760lfl .DOC GG/bn 510 363 15 biologiskt relevanta lipider kan användas för att åstad- komma den kubiska fasen, blir möjligheterna stora att skapa system, som är lämpade för speciella ändamål, t ex för att efterlikna olika slags barriärer i en levande organism.

En annan fördel med systemet är, att det låter sig användas för automatisk bestämning eftersom det på grund av den kubiska fasens styvhet är mycket lätt att separera vattenfasen från den kubiska fasen. Då man använder en icke-finfördelad kubisk fas, vattenfasen, dvs vända en provampull upp och ned för att på behöver man bara dekantera av så sätt i denna separera vattenfas från kubisk fas. Däref- ter kan de båda faserna var för sig analyseras med avseende på sitt innehåll. Denna metod är speciellt tillämpbar i de fall då man använder sig av radioaktivt märkta substanser, t ex i scintigrafiska metoder, vilka kan vara i hög grad automatiserade. I vätskekromatografi är det vanligt, att en speciell provtagningsutrustning suger upp prov ur en provampull. Föreliggande system kan användas även i dessa fall eftersom styvheten hos den kubiska fasen medför, att prov kan tas på vattenfasen utan att den kubiska fasen interfererar med provtagningen.

En viktig aspekt i analyssammanhang är den tid som åtgår för experimentet ifråga. Föreliggande system baserar sig på att jämvikt skall ställa in sig, och den tid detta tar beror framför allt på system och storlek samt på den yta, som den kubiska fasen exponerar mot vattenfasen.

Systemets storlek beror inte enbart på den önskade nog- grannheten vid bestämning av fördelningskoefficienten utan också på analysmetodens noggrannhet. Den yta som den kubiska fasen exponerar mot vattenfasen avgörs av prov- ampullens geometri. Ett sätt att öka ytan är, att finför- dela den kubiska fasen genom att utnyttja någon form av inert bärare i partikelform. Ett exempel är utnyttjandet av porösa sfärer av cellulosa, men uppfinningen utesluter inte andra bärarmaterial så länge som de inte påverkar bildandet 15 20 35 960903 P:\S760l8 .DOC GG/bn 5 510 363 av den kubiska fasen. Detta kontrolleras med röntgen- diffraktion, kärnmagnetisk resonansspektroskopi eller med bägge metoderna. Om den kubiska fasen bildas i och/eller på en partikelformad bärare, kan dessa partiklar packas i en kolonn för bestämning av fördelningen i det fall en vattenfas används som mobil fas. Metoden enligt uppfinningen kommer då att få karaktären av en kromato- grafisk metod. Uppfinningen omfattar också möjligheten att den kubiska fasen får bildas på kolonnens väggar. Enligt uppfinningen kan således den kubiska fasen i jämvikt med en hydrofil fas vara i form av en homogen fas, en finfördelad fas i form av diskreta partiklar eller en blandning därav.

Bestämningen av fördelningen av en kemisk substans mellan en hydrofob miljö och en hydrofil miljö bygger på att lipidstrukturen inte pâverkas i någon högre grad. Om koncentrationen blir alltför hög, kan strukturen hos den kubiska fasen emellertid påverkas så, att en annan fas bildas. koncentration kemisk substans, Kännedom om strukturen hos denna fas och den som krävs för dess bildande, kan tillföra ytterligare information till den intresserade.

En annan möjlighet är, att följa jämviktsinställningen med avseende på tiden. Information från sådana försök kan ge information om den kemiska substansens transportvägar i systemet. Försöken kan också användas för att utröna de optimala förhållanden som erfordras för analysnoggrannhet och för bestämning av fördelningskoefficienten med avseende pá tid för jämvikt.

Sammanfattningsvis utgör föreliggande uppfinning ett ur hanterbarhetssynpunkt överlägset system för att bestämma fördelningen av en substans mellan en hydrofob miljö i form av ett biskikt av polära lipider och en hydrofil miljö, varvid preparations- och separationsstegen kraftigt redu- cerats i komplexitet samtidigt som systemet erbjuder fram- ställning av fyllfärdiga provampuller i form av förpack- ningar, som lämpar sig för de på marknaden förekommande 960903 P:\57E016 .DOC GG/bn 510 363 6 20 25 30 35 automatiserade analysmetoderna. Exempel på sådana metoder är vàtskekromatografi och scintigrafi. Möjligheten att kunna packa kromatografiska kolonner med föreliggande system är ytterligare ett exempel på systemets mångsidig- het. För analyspersonalen utgör föreliggande uppfinning ett bekvämt sätt att utan tidskrävande och komplicerade preparations- och separationssteg mäta fördelningen av en kemisk substans mellan en hydrofob miljö och en hydrofil miljö. För den personal som utvärderar resultaten av mätningen, medför föreliggande uppfinning att ett system nu finns tillgängligt som närmare efterliknar de betingelser som råder i biologiska system.

Exempel Exempel l. Beskrivning av det generella utförandet av upp- finningen.

Fall l - Vattenlösliga substanser.

Föreliggande uppfinning bygger på att de lamellära biskikten i den kubiska fasen bildas spontant i kontakt med en vattenlösning. Vesiklar och liposomer à andra sidan tillverkas genom att mekanisk energi tillförs. Den bildade kubiska fasen karaktäriseras med hjälp av röntgendiffrak- tion och kärnmagnetisk resonansspektroskopi. Dessa metoder ger upplysningar beträffande huruvida den kubiska fasen är uppbyggd av lamellära biskikt eller inte samt dess dimen- sioner.

Fördelningen av en substans X mellan lipider och vatten i systemet beskrivs av följande fördelnings- koefficient.

Kbiskikt/vatten = Kbl/w = [X]lipid/ïxïvatten (1) där [X]1ipid/Vatten är koncentrationen av substansen X i lipid- resp vattendelen av systemet. För att kunna bestämma Kbl/W kan man gå tillväga på flera sätt. Om vlipid är voly- men lipid, vl volymen vattenlösning utan substans X samt vg 30 960903 P : \5760l8 .DOC GG/bn 510 363 volymen vattenlösning med substans X i en koncentration av [X]0 mol/liter, kan fördelningskoefficienten uttryckas Kbl/W = (V2 <[X]0-IX1w>/íxlw - v1}/viipid (2) där [X]w är koncentrationen av X i vattenfasen vid jämvikt.

Ekvationen 2 kan användas om enbart vattenfasen och inte lipidfasen analyseras med avseende pà sitt innehåll av X.

Om både vattenfas och kubisk fas analyseras med avseende på sitt innehåll av substansen X, kan följande fördelningskoefficient bestämmas Kkubisk fas/vatten = KQ/w = [X]Q/[X]w (3) där [XJQ är koncentrationen av X i den kubiska fasen. Ett samband mellan Kbl/W och KQ/W kan härledas om volymsandelen vatten i den kubiska fasen samt koncentrationen av X i vattendomänen hos den kubiska fasen är kända. Den förra kan bestämmas med hjälp av röntgendiffraktion. Om det antages, att koncentrationen av X i vattendomänen i den kubiska fasen är [X]w, samband erhållas dvs samma som i vattenfasen, kan följande Kbl/w = {KQ/w ' fw}/{l-fw} (4) där fw är volymsandelen vatten i den kubiska fasen.

Fall 2 - I vatten svàrlösliga substanser.

I detta fall kan det vara lämpligare att blanda en känd mängd av substansen ifråga med en känd volym av en blandning av polära lipider för att möjliggöra upplösning av substansen i lipiderna före tillsatsen av vattnet, Vaq, och före utbildandet av den kubiska fasen. Beräkningen av fördelningskoefficienten kan ske med följande formel Kbi/w = lX1o/txlw - Vaq/Vlipia <5) 510 363 H 20 25 960903 P:\5760l8.DOC GG/bn Exempel 2. Bestämning av fördelningskoefficienter för klometiazole Klometiazole (CMZ) är ett läkemedel som vid lågt pH föreligger i en laddad form och vid högt pH i en neutral form. Glycerylmonooleat(Grindsted/Danisco A/S, Brabrand, 0,74 ml, Därefter sattes 0,3 ml vatten till tre av ampullerna, pH 3,4, Den kubiska fasen fick utbildas över natten.

Danmark), tillsattes var och en av sex ampuller. och 0,3 ml citratbuffert, sattes till återstående tre ampuller.

Därefter tillsattes till var och en av ampullerna 1,0 ml av lösningar med olika koncentrationer CMZ.

Efter 120 tim analyserades innehållet med avseende på I detta exempel är v1ipid=O,74 ml, v1=0,3 ml, v2=l,0 ml och fw=O,4.

CMZ i både vattenfasen och den kubiska fasen.

Fördelningskoefficienten Kbl/W beräknades med hjälp av ekvationerna (2) och (4). Parametrarna [X]w och Kbl/W i de tre systemen (I, II och III) bestämdes till I II III [X]0/mg/ml 0,28 1,5 3,0 vatten, DUW/mg/ml 0,0072 0,036 0,076 vatten, Kbl/W, ekv (2) 57,0 57,9 57,9 vatten, [X]Q/mg/ml 0,243 1,286 2,463 vatten, Kbl/W, ekv (4) 55,6 55,7 53,3 citrat, [Xlw/mg/ml 0,014 0,067 0,136 citrat, Kbl/W ekv (2) 28,4 32,0 31,5 citrat, [XJW/mg/ml 0,243 1,166 2,366 citrat, Kbl/w, ekv (4) 28,2 26,9 28,3 Tabellen visar, att de erhållna resultaten är relativt okänsliga för halten av CMZ i ursprungslösningen. 20 30 960903 P: \S7601! .DOC GG/bn 510 363 I det fall då enbart halten CMZ i vattenlösningen är känd, kan bestämningen av fördelningskoefficienten utföras med rimlig noggrannhet. Om den laddade formen av CMZ huvud- sakligen uppträder i citrat-systemet, är det också rimligt att fördelningskoefficienten då är lägre än i vatten.

Exempel 3. Bestämning av fördelningskoefficienten för lido- kain genom samtidig tillsats av all vattenlösning.

Lidokain är ett lokalbedövningsmedel som vid lågt pH föreligger i en laddad form och vid högt pH i en neutral form. Glycerylmonooleat, 2 ml, vägdes in i tre ampuller, varefter 2,5 ml av en buffertlösning av pH 4, 7 eller 10, innehållande 1,00 mg lidokain per ml, sattes till endera av de tre ampullerna. Därefter sattes 0,5 ml av resp buffert- lösning till ampullerna.

Efter 24 tim analyserades innehållet i vattenfasen spektrofotometriskt (262 nm) med avseende på lidokain. I detta exempel är v1ipid=2 ml, v1=0,5 ml, v2=2,5 ml och [X]0=1,O0 mg/ml. Fördelningskoefficienten Kbl/W beräknades med hjälp av ekvation 2. Parametrarna [X]w och Kbl/W i de tre systemen (I, II och III) bestämdes till I II III pH 4 7 io [x]w/mg/ml 0,68 0,21 0,073 Kbl/W 0,7 8,9 31,2 Då pKa för lidokain är 8, dominerar den laddade formen vid pH 4, medan den oladdade dominerar vid pH 10, Således bör Kbl/w(laddad) vara 0,7 och Kbl/w(oladdad) vara 31,2. 960903 P:\S76018.DOC GG/bn 10 510 363 lO Ü 25 30 Exempel 4. Bestämning av fördelningskoefficienten för lido- kain genom tillsats av vattenlösning efter det att den kubiska fasen bildats.

Glycerylmonooleat, 2 ml, vägdes in i tre ampuller, varefter 0,5 ml av en buffertlösning av pH 4, 7 eller 10, sattes till endera av de tre ampullerna, och den kubiska fasen fick utbildas under ett dygn i värmeskáp vid 37 °C.

Därefter sattes 2,5 ml av samma buffertlösning innehållande 1,00 mg lidokain per ml till respektive ampull.

Efter ytterligare 24 tim analyserades innehållet i vattenfasen spektrofotometriskt (262 nm) med avseende på lidokain. I detta exempel är v1ipid=2 ml, v1=0,5 ml, v2=2, 5 ml och [X]Q=l,00 mg/ml. Fördelningskoefficienten Kbl/W beräknades med hjälp av ekvation 2. Parametrarna [X]W och Kbl/W i de tre systemen (I, II och III) bestämdes till I II III pH 4 7 10 [xlw/mg/ml 0,66 0,22 0,073 Kbl/W 0,8 8,4 31,2 Eftersom föreliggande uppfinning utnyttjar jàmvikts- egenskaper hos systemet, kommer inte ordningsföljden för tillsatser att spela någon roll så länge som jämvikt råder i systemet. Överensstämmelsen vid jämförelse av resultaten från exempel 3 och 4 visar detta med önskvärd tydlighet.

Exempel 5. Bestämning av fördelningskoefficienten för NaCl. vägdes in i tre ampuller, 0,067 eller 0,10 mol/liter sattes till endera av de tre ampuller- Glycerylmonooleat, 2 ml, varefter 6 ml av en vattenlösning av NaCl med 0,033, na.

Efter tre dygn bestämdes NaCl-halterna i de tre ampullerna genom konduktometriskt analys av vattenfaserna.

W U 20 25 30 960903 P:\5760l8.DOC GG/bn ll 510 363 I detta exempel är v1ipid=2 ml, v1=0 ml och v2= 6 ml. För- delningskoefficienten Kbl/W beräknades med hjälp av ekvation 2. Parametrarna [X]w och Kbl/W i de tre systemen (I, II och III) bestämdes till I II III [mg/mol/licer 0,033 0,067 0,100 [X]w/mol/liter 0,036 0,071 0,106 Kbl/w -0,2s -0,17 -0,17 Den negativa fördelningskoefficienterna som erhålls i detta fall visar, att NaCl undviker vattendomänen i den kubiska fasen, vilket får till följd att koncentrationen av saltet ökar i vattenfasen, som står i jämvikt med den kubiska fasen. Eftersom ekvation 2 bygger på ett antagande, att koncentrationen av den aktuella substansen är lika i allt vatten i systemet, så blir effekten att en negativ fördelningskoefficient erhålls. En slutsats är alltså, att relativt små joner, såsom Na* och Cl“, skyr vattendomäner i närheten av lipider, medan stora joner, såsom den laddade formen av lidokain (Exempel 3 och 4), har en viss affinitet till lipidsystemet.

E¿emp§l_§. Bestämning av fördelningskoefficienten för alfentanil, fentanyl och sufentanil genom samtidig tillsats av all vattenlösning.

Alfentanil, fentanyl och sufentanil tillhör gruppen allmänanestetika, som vid lågt pH föreligger i en laddad form och vid högt pH i en neutral form. Dissociations- konstanterna är för de tre substanserna 6,5, 8,4 respektive 8,0. 0,9 ml av en buffertlösning av pH 4, 7 eller 10, innehållande läkemedlet, sattes till endera av de tre ampullerna. 950903 P:\S76fllB.DOC GG/bn l2 510 363 lO Efter 4 dygn analyserades innehållet i vattenfasen med avseende på läkemedel medelst högpresterande vätskekromatografi (HPLC). I detta exempel är v1ipi¿=0,3 ml, v1=0 ml och v2=0,9 ml. Fördelningskoefficienten Kbl/W [X]w och beräknades med hjälp av ekvation 2. Parametrarna Kbl/W i de tre systemen bestämdes till Alfentanil: I II III pH 4,09 7,33 9,66 [X]0/mg/liter 0,500 0,500 0,500 [X]w/mg/ml 0,203 0,0l48 0,0l80 Kbl/W 4,4 98 80 Fentanyl: I II III pH 4,09 7,33 9,66 [X]0/mg/liter 0,200 0,200 0,200 [X]w/mg/ml 0,0422 0,0056 0,00025 Kbl/w 11,2 104 2397 Sufentanil: I II pH 4,0 6,0 [ing/mg/liter 0,100 0,100 [X]w/mg/ml 0,0l33 0,00535 Kbl/W 19,6 53 För de tre substanserna alfentanil, fentanyl och sufentanil är fördelningskoefficienterna i systemet oktanol/vatten 128, 813 respektive 1778. visar med önskvärd tydlighet, att denna inbördes ordning Resultaten ovan mellan substanserna också uppträder i föreliggande system.

Claims (8)

10 15 20 25 30 971003 C:\57S\01B-K2 .DOC GG 510 363 PATENTKRAV

1. Användning av en kubisk, flytande kristallin fas för att bestämma fördelningen av en kemisk substans mellan hydrofob och hydrofil miljö, varvid den hydrofoba miljön represen- teras av ett lamellärt biskikt av lipider i den kubiskt flytande kristallina fasen och den hydrofila miljön av en med den kubiska fasen i jämvikt stående hydrofil fas.

2. Användning enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d av att lipiderna i den kubiska fasen utgörs av biologiska lipider, semisyntetiska lipider, syntetiska lipider eller blandningar därav.

3. Användning enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a d av att de biologiska lipiderna i den kubiska fasen utgörs av monoglycerider, fosfolipider, glykolipider, sfingolipider eller blandningar därav.

4. Användning enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a d av att de biologiska lipiderna utgörs av monoglycerider.

5. Användning enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a d av att monoglyceriderna utgörs av glycerylmonooleat, glycerylmonolinoleat, glycerylmonolinolenat eller blandningar därav.

6. Användning enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a d av att lipiderna i den kubiska fasen utgörs av en blandning av monoglycerider och fosfolipider.

7. Användning enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a d av att lipiderna i den kubiska fasen utgörs av en blandning av diacylfosfatidylkolin och diacylfosfatidyletanolamin.

8. Användning enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d av att den kubiska fasen i jämvikt med en hydrofil fas är i form av en homogen fas, en finfördelad fas i form av diskreta partiklar eller en blandning därav.