SE503289C2 - Ways to determine the concentration of substances in a liquid - Google Patents
Ways to determine the concentration of substances in a liquidInfo
- Publication number
- SE503289C2 SE503289C2 SE9303149A SE9303149A SE503289C2 SE 503289 C2 SE503289 C2 SE 503289C2 SE 9303149 A SE9303149 A SE 9303149A SE 9303149 A SE9303149 A SE 9303149A SE 503289 C2 SE503289 C2 SE 503289C2
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- refractive index
- wavelength
- substances
- wavelengths
- concentration
- Prior art date
Links
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 33
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 51
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000000556 factor analysis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims abstract 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 28
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 19
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 10
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 claims description 3
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 238000000533 capillary isoelectric focusing Methods 0.000 claims description 2
- 238000005515 capillary zone electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 238000004190 ion pair chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 238000009713 electroplating Methods 0.000 claims 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims 1
- 238000005305 interferometry Methods 0.000 claims 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 14
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 9
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 229910001369 Brass Inorganic materials 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000010951 brass Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 3
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 3
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 2
- NHQOULZCPKJYMM-UHFFFAOYSA-M (2e)-1,3,3-trimethyl-2-[(2e)-7-(1,3,3-trimethylindol-1-ium-2-yl)hepta-2,4,6-trienylidene]indole;perchlorate Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O.CC1(C)C2=CC=CC=C2N(C)C1=CC=CC=CC=CC1=[N+](C)C2=CC=CC=C2C1(C)C NHQOULZCPKJYMM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- JKXWXYURKUEZHV-UHFFFAOYSA-M (2z)-1,3,3-trimethyl-2-[(2e)-7-(1,3,3-trimethylindol-1-ium-2-yl)hepta-2,4,6-trienylidene]indole;iodide Chemical compound [I-].CC1(C)C2=CC=CC=C2N(C)C1=CC=CC=CC=CC1=[N+](C)C2=CC=CC=C2C1(C)C JKXWXYURKUEZHV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 238000004847 absorption spectroscopy Methods 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000001818 capillary gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003981 capillary liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002218 isotachophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000004244 micellar electrokinetic capillary chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001448 refractive index detection Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/41—Refractivity; Phase-affecting properties, e.g. optical path length
- G01N21/4133—Refractometers, e.g. differential
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/74—Optical detectors
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
Abstract
Description
10 15 20 30 35 503 289 hos för närvarande tillgängliga refraktometriska detektorer är dock inte tillfredsställande, vilket beror pä att brytningsindexmätningen pâverkas av en rad olika störande faktorer, t.ex. temperatur- och tryckvariationer. Detta minskar värdet av refraktometri i samband med kapillärelektrofores och vätskekromatografi. Det faktum att refraktometri är en generell (och inte selektiv) teknik kan vara en för- eller nackdel i olika tillämpningar. En fördel med refraktometri är att en vâtskas brytningsindex beror av koncentrationen av lösta ämnen, och tekniken är därför sant miniatyriserbar - detta medför att den kan tillämpas även pà smala separationskolonner eller -kapillärer. Vidare är refraktometri en snabb teknik, och refraktometrar är i allmänhet enkla, robusta och billiga instrument. 10 15 20 30 35 503 289 with currently available refractometric detectors is, however, not satisfactory, which is due to the refractive index measurement is affected by a number of different disturbances factors, e.g. temperature and pressure variations. This reduces the value of refractometry associated with capillary electrophoresis and liquid chromatography. The fact that Refractometry is a general (and not selective) technique can be an advantage or disadvantage in different applications. An advantage with refractometry is that the refractive index of a liquid depends on the concentration of solutes, and the technology is therefore true miniaturizable - this means that it can also be applied on narrow separation columns or capillaries. Further is refractometry is a fast technique, and refractometers are in generally simple, robust and inexpensive instruments.
Ovannämnda brister avseende känslighet och selektivitet hos refraktometri avser konventionell refraktometri, vid vilken brytningsindex mäts vid en enda ljusváglängd. Flera förslag har presenterats för att förbättra refraktometri- tekniken och övervinna de nämnda bristerna genom att mäta brytningsindex vid mer än en våglängd samtidigt.The above shortcomings regarding sensitivity and selectivity in refractometry refers to conventional refractometry, at which refractive index is measured at a single light wavelength. Several proposals have been presented to improve refractometry technology and overcome the mentioned shortcomings by measuring refractive index at more than one wavelength at a time.
A. van Heuvelen föreslog i US, A, 4 704 029 en metod att mäta glukoshalten direkt (utan något föregående separationssteg, som t.ex. vâtskekromatografi eller kapillärelektrofores) i blod genom att mäta blodets brytningsindex. En utföringsform var att mäta brytningsindex samtidigt vid tvä olika våglängder, svarande mot brytningsindex' maximum och minimum inom glukos' anomala dispersionsintervall, och läta brytningsindexdifferensen utgöra ett mätt pä glukoshalten.A. van Heuvelen proposed in U.S. Pat. No. 4,704,029 a method to measure the glucose content directly (without any prior separation steps, such as liquid chromatography or capillary electrophoresis) in blood by measuring blood refractive index. One embodiment was to measure refractive index simultaneously at two different wavelengths, corresponding against refractive index 'maximum and minimum in glucose' anomalous dispersion intervals, and let the refractive index difference is a measure of the glucose content.
Fördelen med detta var att mätningen blev selektiv med avseende pà glukos.The advantage of this was that the measurement became selective regarding glucose.
G. Gauglitz, J. Krause-Bonte, H. Schlemmer och A.G. Gauglitz, J. Krause-Bonte, H. Schlemmer and A.
Matthes presenterade i Anal. Chem. 1988, 60, 2609 en metod att mäta brytningsindex vid ett flertal olika våglängder, samtidigt i samband med vätskekromatografi. Tanken var att öka känsligheten genom att mäta inom det anomala dispersionsintervallet, samt att erhålla spektral 10 I5 20 25 30 35 503 289 h) brytningsindexinformation, vilket kan möjliggöra identifiering av analyserade ämnen.Matthes presented in Anal. Chem. 1988, 60, 2609 and method to measure the refractive index at a number of different wavelengths, simultaneously with liquid chromatography. The idea was to increase sensitivity by measuring within the anomaly dispersion interval, and to obtain spectra 10 I5 20 25 30 35 503 289 hrs) refractive index information, which may enable identification of analyzed substances.
Mätning av den anomala dispersionen beskrivs också av A. Hanning i den internationella patentansökan PCT/SE92/00558 som ett sätt att öka känsligheten vid en typ av ytplasmonresonansmâtning (surface plasmon resonance, SPR) och vid liknande mätmetoder, som baserar sig på mätning av kemiska interaktioner pá en sensoryta i form av mätning av förändringar av brytningsindex i ytskiktet.Measurement of the anomalous dispersion is also described by A. Hanning in the international patent application PCT / SE92 / 00558 as a way to increase the sensitivity of a type of surface plasmon resonance measurement, SPR) and for similar measurement methods, based on measurement of chemical interactions on a sensor surface in the form of measurement of changes in refractive index in the surface layer.
Dessa förändringar orsakas av att analyten medför eller påverkar inbindning eller frisåttning av en brytningsindexhöjande substans till respektive från sensorytan. Mer specifikt så ökas känsligheten genom att matcha mätvåglängden med absorptivitetsmaximumet hos den brytningsindexhöjande substans som används i den specifika mätmetoden, företrädesvis ett färgämne eller en kromofor molekyl, och i synnerhet så att mätvåglängden ligger vid eller nära maximumet i absorptivitetens negativa derivata med avseende på våglängden. Detta kan åstadkommas antingen genom att välja en brytningsindexhöjande substans som lämpar sig för mätvåglängden hos ett specifikt instrument eller en speciell applikation, eller genom att välja en mätvàglängd som lämpar sig för en specifik brytningsindexhöjande substans.These changes are caused by the analyte causing or affects the binding or release of a refractive index raising substance to and from sensor surface. More specifically, the sensitivity is increased by match the measurement wavelength with the absorptivity maximum of it refractive index enhancing substance used in the specific the measuring method, preferably a dye or a chromophore molecule, and in particular so that the measurement wavelength is at or close to the maximum in the negative derivatives of absorptivity with respect to the wavelength. This can be accomplished either by selecting a refractive index raising substance such as suitable for the measurement wavelength of a specific instrument or a special application, or by selecting one measuring wavelength suitable for a specific refractive index raising substance.
A. Hanning beskriver också i den svenska patentansökan 9300231-9 ett sätt att bestämma koncentrationen av en analyt i ett vätskeprov genom att mäta vätskans brytningsindex, kännetecknat av att analyten märks med en substans som har högt brytningsindex vid mätvåglängden eller vid minst en av mätvåglängderna. Vidare beskriver A.A. Hanning also describes in the Swedish patent application 9300231-9 a way of determining the concentration of a analyte in a liquid sample by measuring the liquid refractive index, characterized in that the analyte is labeled with a substance that has a high refractive index at the measuring wavelength or at at least one of the measuring wavelengths. Furthermore, A. describes
Hanning i den svenska patentansökan 9302723-3 ett sätt att bestämma koncentrationen av en analyt i en vätskekromatografisk eller kapillärelektroforetisk separation genom att mäta analytens förträngning av en substans i den mobila fasen som en ändring i brytningsindex, kännetecknat av att den förträngda substansen har högt brytningsindex vid mätvåglängden eller vid minst en av mätvåglängderna. 10 15 20 25 30 35 503 289 I enlighet med föreliggande uppfinning har det nu framkommit att den grundläggande principen att mäta brytningsindex vid mer än en våglängd samtidigt ytterligare kan förbättras och göras mer allmângiltig.Hanning in the Swedish patent application 9302723-3 a way to determine the concentration of an analyte in a liquid chromatographic or capillary electrophoretic separation by measuring the constriction of the analyte by a substance in the mobile phase as a change in refractive index, characterized by the repressed the substance has a high refractive index at the measuring wavelength or at at least one of the measuring wavelengths. 10 15 20 25 30 35 503 289 In accordance with the present invention, it has now emerged that the basic principle of measuring refractive index at more than one wavelength at the same time further can be improved and made more universal.
För optiska media (som i föreliggande fall utgörs av den analyserade vätskan) finns ett universellt och entydigt samband mellan absorptionsspektrum och brytningsindex- spektrum. I sin generellaste form uttrycks detta samband av Kramers-Kronigs ekvationer för optisk dispersion (se t.ex.For optical media (which in the present case consists of the analyzed liquid) there is a universal and unambiguous relationship between absorption spectrum and refractive index spectrum. In its most general form, this connection is expressed by Kramers-Kronig's equations for optical dispersion (see e.g.
N. W. Ashcroft, N. D. Mermin, "Solid state physics", W. B.N. W. Ashcroft, N. D. Mermin, "Solid state physics", W. B.
Saunders, Philadelphia, 1976, Appendix K). Mycket grovt sett kan brytningsindexvariationen i närheten av en ljusabsorptionsvåglângd (resonansvåglängd) beskrivas som negativa derivatan av absorptionsspektrumet med avseende på våglängden. Brytningsindex uppvisar ett maximum i närheten av maximum i absorptionens negativa derivata med avseende på våglängd (d.v.s. vid något högre våglängd än resonansvåglângden) och ett minimum i närheten av minimum i avseende på våglängd resonansvåglängden). absorptionens negativa derivata med (d.v.s. vid något lägre våglängd än Brytningsindex' variation med våglängd kallas dispersion; våglängdsområdet mellan minimum och maximum i brytningsindex kallas för det anomala dispersionsområdet, medan övriga våglängder sägs ligga inom det normala dispersionsområdet. Dispersionen har olika tecken inom det normala respektive det anomala området. En förenklad beskrivning av relationen mellan absorption och brytningsindex, vilken bygger på en lokal approximation, ges i C. F. Bohren, D. R. Huffman, "Absorption and scattering of light by small particles", Wiley, New York, 1983, Kapitel 9. Utgående från denna lokala approximation kan visas att brytningsindexdifferensen mellan maximum och minimum i brytningsindex är proportionell mot absorptions- koefficientens maximumvârde. För ett löst ämne i en vätska innebär detta att brytningsindexdifferensen mellan maximum och minimum i brytningsindex (eller brytningsindex- differensen mellan två godtyckliga våglängder i närheten av absorptionsmaximum) är proportionell mot produkten av det 10 15 20 30 35 503 289 lösta ämnets absorptivitet och dess koncentration. Detta styrks experimentellt i nedanstående Exempel. Alltså: Anoca*c (1) , där An = brytningsindexdifferens, a = absorptivitet och c = koncentration. Detta uttryck är lika allmângiltigt som den välkända Lambert-Beers lag inom kvantitativ absorptionsspektroskopi: A = a * b * c (2) , där A = absorbansen och b = ljusstrålens våglängd i mediumet. Dessa två uttryck är analoga, med en viktig skillnad: i Lambert-Beers lag återfinns faktorn b, vilket innebär att den uppmätta absorbansen minskar med våglängd och mätmetodens känslighet försämras alltså vid miniatyrisering. I uttrycket för brytningsindexdifferensen återfinns inte faktorn b: brytningsindexdifferensen är inte vâglängdsberoende, och denna metods känslighet försämras inte vid miniatyrisering.Saunders, Philadelphia, 1976, Appendix K). Very rough seen, the refractive index variation may be close to one light absorption wavelength (resonance wavelength) is described as negative derivatives of the absorption spectrum with respect to wavelength. Refractive index shows a maximum in the vicinity of maximum in the negative derivatives of absorption with respect to at wavelength (i.e. at slightly higher wavelength than resonant wavelength) and a minimum close to the minimum in with respect to wavelength resonance wavelength). the negative derivatives of absorption with (i.e. at a slightly lower wavelength than The variation of refractive index with wavelength is called dispersion; the wavelength range between minimum and maximum in refractive index is called the anomalous dispersion range, while other wavelengths are said to be within the normal range the dispersion area. The dispersion has different signs within it normal and the anomalous area, respectively. A simplified description of the relationship between absorption and refractive index, which is based on a local approximation, ges i C. F. Bohren, D. R. Huffman, "Absorption and scattering of light by small particles ", Wiley, New York, 1983, Chapter 9. Based on this local approximation can be shown that the refractive index difference between maximum and minimum in refractive index is proportional to the absorption coefficient maximum value. For a solute in a liquid this means that the refractive index difference between the maximum and minimum in refractive index (or refractive index the difference between two arbitrary wavelengths in the vicinity of absorption maximum) is proportional to the product of it 10 15 20 30 35 503 289 the absorptivity of the solute and its concentration. This proved experimentally in the Examples below. In other words: Anoca * c (1) , where An = refractive index difference, a = absorptivity and c = concentration. This expression is as universal as the well-known Lambert-Beers law in quantitative absorption spectroscopy: A = a * b * c (2) , where A = the absorbance and b = the wavelength of the light beam in the medium. These two expressions are analogous, with one important difference: in Lambert-Beers law, the factor b is found, which means that the measured absorbance decreases with wavelength and the sensitivity of the measurement method thus deteriorates at miniaturization. In the expression of the refractive index difference factor b is not found: the refractive index difference is not wavelength dependence, and the sensitivity of this method deteriorates not in miniaturization.
Sammanfattningsvis: 1/ Mätning av absorptionsspektrum eller brytningsindexspektrum ger i princip samma spektrala information (vilket uttrycks av Kramers-Kronigs ekvationer). 2/ Absorbansen och brytningsindexdifferensen är båda rätlinjigt relaterade till koncentrationen av analyt (vilket uttrycks av ekvation (1) och (2) ovan). 3/ Detektion genom absorbansmätning ger försämrad känslighet vid miniatyrisering. Detektion genom brytningsindex- differensmätning ger inte försämrad känslighet vid miniatyrisering (vilket uttrycks av ekvation (1) och (2) 'ovan).In summary: 1 / Measurement of absorption spectrum or the refractive index spectrum gives basically the same spectral information (as expressed by Kramers-Kronigs equations). 2 / The absorbance and the refractive index difference are both rectilinearly related to the concentration of analyte (which is expressed by equations (1) and (2) above). 3 / Detection by absorbance measurement results in impaired sensitivity in miniaturization. Detection by refractive index difference measurement does not give impaired sensitivity at miniaturization (which is expressed by equations (1) and (2) 'above).
I sin vidaste mening tillhandahåller föreliggande uppfinning en metod att bestämma koncentrationen av ämnen i en vätska, kännetecknad av att ämnena först separeras genom vätskekromatografi eller kapillärelektrofores, och sedan detekteras genom att mäta vätskeflödets brytningsindex vid mer än en våglängd, varvid detektionssteget innefattar kvantitativ utvärdering av brytningsindex' variation med våglängd.In its broadest sense, the present provides invention a method of determining the concentration of substances in a liquid, characterized in that the substances are first separated by liquid chromatography or capillary electrophoresis, and then detected by measuring the refractive index of the liquid flow at more than one wavelength, the detection step comprising quantitative evaluation of the refractive index 'variation with wave-length.
Metoden sätter inga begränsningar på typ av analyter, dock erhålls högst känslighet om analyterna har hög '503 289 10 15 20 30 35 absorptivitet i närheten av mätväglängderna. Metoden kan användas inom det infraröda, synliga eller ultravioletta vàglängdsomràdet, dock erhàlls högst känslighet om mätvàglängderna väljs nära ett omräde där analyterna har hög absorptivitet. Eftersom de flesta ämnen har hög absorptivitet i det ultravioletta området, fär metoden störst allmängiltighet om minst en av mätvàglängderna ligger i detta omräde. Metoden sätter inga begränsningar pä den kromatografiska eller elektroforetiska separationsmekanism som utnyttjas för separationen.The method places no restrictions on the type of analytes, however, the highest sensitivity is obtained if the analytes are high '503 289 10 15 20 30 35 absorptivity in the vicinity of the measuring path lengths. The method can be used in the infrared, visible or ultraviolet the path length range, however, the highest sensitivity is obtained if the measurement path lengths are selected near an area where the analytes have high absorptivity. Because most substances have high absorptivity in the ultraviolet range, the method greatest universality if at least one of the measuring wavelengths is located in this area. The method does not impose any restrictions the chromatographic or electrophoretic separation mechanism used for the separation.
Tänkbara separationstekniker inkluderar, men begränsas ej till, jonbyteskromatografi, jonparskromatografi, storlekskromatografi, affinitetskromatografi, kapillâr zonelektrofores, kapillâr jonelektrofores, elektrokinetisk kapillâr micellkromatografi (MECC), isotachofores, kapillâr gelelektrofores och kapillâr isoelektrisk fokusering. Andra reversed-phase kromatografi, adsorptionskromatografi, tänkbara kromatografiska eller elektroforetiska separationstekniker är uppenbara för fackmannen. Metoden sätter inga begränsningar pä typ av refraktometer som används för detektionen. Tänkbara refraktometertyper inkluderar, men begränsas ej till, avlänknings- refraktometrar, interferometrar, Fresnel-refraktometrar, ytplasmonresonansrefraktometrar och refraktometrar baserade pä optiska vägledare. Andra tänkbara refraktometertyper är uppenbara för fackmannen.Possible separation techniques include, but are not limited to to, ion exchange chromatography, ion pair chromatography, size chromatography, affinity chromatography, capillary zone electrophoresis, capillary ion electrophoresis, electrokinetic capillary microchromatography (MECC), isotachophoresis, capillary gel electrophoresis and capillary isoelectric focusing. Other reversed-phase chromatography, adsorption chromatography, possible chromatographic or electrophoretic separation techniques are obvious to those skilled in the art. The method puts no restrictions on the type of refractometer that used for detection. Possible refractometer types includes, but is not limited to, diversionary refractometers, interferometers, Fresnel refractometers, surface plasmon resonance refractometers and refractometers based on optical guides. Other possible refractometer types are obvious to those skilled in the art.
Föreliggande uppfunna metod uppvisar flera väsentliga tekniska skillnader jämfört med den metod som beskrivs av van Heuvelen i US, A, 4 704 029 (ovan).The present invented method exhibits several essentials technical differences compared to the method described by van Heuvelen and U.S. Patent No. 4,704,029 (supra).
Heuvelen inser inte, att det i praktiken är omöjligt att bestämma koncentrationen av ett enskilt ämne i en komplex blandning av ett flertal andra, identifierade eller oidentifierade, ämnen, genom att helt enkelt mäta För det första: van brytningsindexskillnaden vid tvä våglängder. Sannolikheten att hitta ett vàglängdspar som är specifikt för just det sökta ämnet är nästintill försumbar, och speciellt så i det fall att de övriga ämnena i blandningen är oidentifierade, Till exempel, när glukos ska bestämmas i blod, kommer ett 10 15 20 30 35 503 289 flertal andra molekylslag, som t.ex. andra sockerarter och att absorbera ljus i sama våglängdsregion som I föreliggande metod kolhydrater, glukos, och därmed störa mätningen. löses detta problem genom att kombinera brytningsindexmätningen med ett kemiskt separatignssteg, nämligen vätskekromatografi eller kapillärelektrofores. På detta sätt separeras först alla de olika ämnena, varefter de detekteras ett efter ett. Det blir alltså praktiskt möjligt att analysera komplexa blandningar av oidentifierade ämnen, såsom t.ex. blod. För det andra: van Heuvelen utnyttjar två specifika våglängder för att bestämma ett specifikt ämne - de valda våglängderna är alltså ämnesspecifika. För att bestämma koncentrationen av flera olika, oidentifierade ämnen i en komplex blandning, skulle man behöva identifiera två specifika våglängder för varje enskilt ämne - detta är både teoretiskt och praktiskt omöjligt. I föreliggande metod, som hänför sig till vätskekromatografi och kapillärelektrofores, utnyttjas två (eller flera) fa5ta_yfiglängder. De valda våglängderna är alltså inte ämnesspecifika. Alla eluerade ämnen kommer att ehuru med varierande känslighet (vissa ämnen koma att visa nära noll detekteras, kan, beroende på omständigheterna, i känslighet). För det tredje: van Heuvelens metod begränsas uttryckligen till det anomala dispersionsområdet.Heuvelen does not realize that in practice it is impossible to determine the concentration of an individual substance in a complex mixture of several others, identified or unidentified, substances, by simply measuring First: van the refractive index difference at two wavelengths. The probability to find a pair of wavelengths that are specific to just that the subject sought is almost negligible, and especially so in it cases where the other substances in the mixture are unidentified, For example, when glucose is to be determined in blood, one comes 10 15 20 30 35 503 289 several other molecular species, such as other sugars and to absorb light in the same wavelength region as In the present method carbohydrates, glucose, thereby interfering with the measurement. solve this problem by combining the refractive index measurement with a chemical separation step, namely liquid chromatography or capillary electrophoresis. On this way, all the different substances are first separated, after which they are detected one by one. So it becomes practical possible to analyze complex mixtures of unidentified substances, such as e.g. Blood. Second: van The hill uses two specific wavelengths to determine a specific topic - the selected wavelengths are thus subject-specific. To determine the concentration of several different, unidentified substances in a complex mixture, one would need to identify two specific wavelengths for each individual subject - this is both theoretical and practical not possible. In the present method, which relates to liquid chromatography and capillary electrophoresis, two are used (or more) fa5ta_y fi glängder. The selected wavelengths are thus not subject-specific. All eluted substances will although with varying sensitivity (certain substances come to show near zero detected, may, depending on the circumstances, in sensitivity). Thirdly: van Heuvelen's method is expressly limited to the anomalous dispersion range.
Metoden baseras på det faktum, att dispersionen har olika i det anomala respektive det Föreliggande uppfunna metod och ställer inga tecken, plus och minus, normala våglängdsområdet. begränsas inte till det anomala området, villkor på dispersionens tecken. Det är dispersionens stgrlek, må så vara positiv eller negativ, som monitoreras.The method is based on the fact that the dispersion has different in the anomalous and the The present invented method and sets none characters, plus and minus, normal wavelength range. not limited to the anomalous area, conditions on the sign of dispersion. It's the dispersion size, whether positive or negative, which is monitored.
Föreliggande metod kan alltså tillämpas i såväl det anomala som det normala området.The present method can thus be applied in both the anomalous as the normal range.
Jämfört med den metod som presenteras av G. Gauglitz et al. (ovan), utgör föreliggande uppfunna förfarande en avsevärt förbättrad metod. Gauglitz mäter brytningsindex' absolutvärde samtidigt vid ett flertal våglängder, men inte i något fall utnyttjar han, eller ens nämner möjligheten att utnyttja, dispersionen (i den vida meningen tsoz 289 10 IS 20 30 35 brytningsindex' variation med våglängd, som t.ex. differens, differential eller derivata med avseende på våglängd) för kvantitativa ändamål. Helt klart är, att användningen av dispersionen för kvantitativa ändamål inte ens implicit är uppenbar för Gauglitz. Tvärtom, han påpekar uttryckligen, att såväl temperaturvariationer, tryckvariationer som mekaniska vibrationer stör den absolutmätande metoden. Han inser inte att alla dessa bruskällor kommer att elimineras mer eller mindre fullständigt om dispersionen monitoreras i stället för brytningsindex' absolutvärde. Vidare definierar Gauglitz explicit teknikens ståndpunkt (“the present state of the art") för sin metod: ett kromatogram där brytningsindex' absolutvärde (vid en våglängd!) monitoreras som funktion av tiden. Inte heller i detta fall utnyttjar han alltså dispersionen för kvantitativa ändamål.Compared with the method presented by G. Gauglitz et al. (above), the presently invented method constitutes a significantly improved method. Gauglitz measures refractive index ' absolute value simultaneously at several wavelengths, but not in any case, he takes advantage of, or even mentions the possibility to utilize, the dispersion (in the broad sense tsoz 289 10 IS 20 30 35 refractive index variation with wavelength, such as difference, differential or derivatives with respect to wavelength) for quantitative purposes. Clearly, that the use of the dispersion for quantitative purposes does not even implicitly obvious to Gauglitz. On the contrary, he points out explicitly, that both temperature variations, pressure variations such as mechanical vibrations disturb it the absolute measurement method. He does not realize all these noise sources will be eliminated more or less completely if the dispersion is monitored instead of refractive index 'absolute value. Furthermore, Gauglitz defines explicit state of the art (“the present state of the species ") for its method: a chromatogram where the refractive index ' absolute value (at a wavelength!) is monitored as a function of the time. Nor in this case does he use dispersion for quantitative purposes.
Jämfört med den internationella patentansökan PCT/SE92/00558 (ovan) hänför sig föreliggande metod inte till ytinteraktioner vid detektionen och inte heller utnyttjas någon brytningsindexhöjande substans. Jämfört med den svenska patentansökan 9300231-9 (ovan) utnyttjar föreliggande metod inte märkning av analyten. Jämfört med den svenska patentansökan 9302723-3 (ovan) utnyttjar föreliggande metod inte detektion av en substans som förtränga av analyten.Compared with the international patent application PCT / SE92 / 00558 (above) does not relate to the present method to surface interactions at detection nor any refractive index raising substance is used. Compared with the Swedish patent application 9300231-9 (above) uses the present method does not label the analyte. Compared with the Swedish patent application 9302723-3 (above) uses the present method does not detect a substance that displace the analyte.
I enlighet med föreliggande uppfinning utgör variationen av brytningsindex med våglängd ett mått på analytens koncentration i vätskan. I den enklaste utföringsformen av denna variant monitoreras brytningsindex vid två olika våglängder, varvid den uppmätta brytningsindexdifferensen utgör ett mått på koncentrationen av analyt i vätskan. Brytningsindexdifferensen blir då linjärt relaterad till koncentrationen enligt ekvation (1) ovan. I andra utföringsformer mäts brytningsindex vid fler än två diskreta våglängder eller över ett kontinuerligt väglängdsintervall. Kvantifieringen kan åter utföras som en enkel differens mellan två värden, eller kvantifierings- förfarandet kan omfatta t.ex. kvotbildning, 10 15 20 30 35 503 289 differentiering, derivatisering eller integrering av det erhållna brytningsindexspektrumet. Överhuvudtaget kan alla typer av metoder för kvantitativ utvärdering av spektra utnyttjas, inklusive multivariata sådana som t.ex. principalkomponentanalys, PLS (partial least squares) och faktoranalys. Vid bristfällig separation, då mer än ett ämne elueras samtidigt, eller vid instabil, lutande eller fluktuerande baslinje, kan t.ex. kurvanpassning eller ovannämnda multivariata metoder utnyttjas för att förbättra analysen.In accordance with the present invention the variation of refractive index with wavelength a measure of the concentration of the analyte in the liquid. In the simplest the embodiment of this variant monitors the refractive index at two different wavelengths, the measured one the refractive index difference is a measure of concentration of analyte in the liquid. The refractive index difference then becomes linearly related to the concentration according to equation (1) above. In other embodiments, the refractive index is measured at more than two discrete wavelengths or over one continuous road length range. The quantification can again be performed as one simple difference between two values, or quantification the procedure may comprise e.g. quota formation, 10 15 20 30 35 503 289 differentiation, derivatization or integration thereof obtained the refractive index spectrum. In general, everyone can types of methods for quantitative evaluation of spectra are used, including multivariate ones such as e.g. principal component analysis, PLS (partial least squares) and factor analysis. In case of defective separation, then more than one substance is eluted simultaneously, or in case of unstable, sloping or fluctuating baseline, e.g. curve fitting or the above multivariate methods are used to improve the analysis.
Informationen om brytningsindex' variation med våglängd kan också användas för att strukturbestämma eller identifiera analyten. Så kan t.ex. brytningsindex mätas vid två våglängder, och informationen om dispersionens tecken och storlek användas för den kvalitativa analysen. Detta är analogt med absorptionsmåtning vid en fast våglängd, vilket också ger begränsad strukturell information. Alternativt kan brytningsindex mätas vid fler ån två diskreta våglängder eller över ett kontinuerligt våglängdsintervall.The information about the refractive index 'variation with wavelength can also be used to structure or identify the analyte. Then e.g. refractive index is measured at two wavelengths, and the information on the signs of dispersion and size are used for the qualitative analysis. This is analogous to absorption measurement at a fixed wavelength, which also provides limited structural information. Alternatively refractive index can be measured at more than two discrete wavelengths or over a continuous wavelength range.
I detta fall används den spektrala informationen för att strukturbestämma eller identifiera analyten. För den kvalitativa analysen kan här en stor mängd olika, väletablerade metoder för utvärdering av spektra användas, t.ex. differentiering, derivatisering, integrering, principalkomponentanalys, PLS, faktoranalys, kurvanpassning eller jämförelse med tabellerade brytningsindexvärden eller referensspektra.In this case, the spectral information is used to structure or identify the analyte. For it qualitative analysis can here a large variety, well-established methods for evaluating spectra are used, for example differentiation, derivatization, integration, principal component analysis, PLC, factor analysis, curve fitting or comparison with tabulated refractive index values or reference spectra.
Mätningen av brytningsindex vid de olika våglängderna måste ske samtidigt eller i mycket snabb följd, så att de olika tidsberoende bruskällorna inte gör sig gällande. För mätning vid två våglängder kan man t.ex utnyttja en ljuskälla med två emissionsvåglângder, vilka träffar två olika detektorelement (som i nedanstående Exempel), ett enda detektorelement i kombination med ett snabbt roterande filter eller två olika laservåglängder vilka alternerande slås av och på i snabb följd. För mätning över ett större våglängdsintervall kan utnyttjas t.ex. en lampa med flera emissionslinjer eller med ett brett emissionsintervall, i 10 15 20 30 35 503 289 10 kombination med en monokromator (ibland kallad polykromator, eftersom alla våglängder tilläts passera genom provet samtidigt) och en diodarray eller CCD- detektor. Alternativa tekniska lösningar för att utföra mätningen simultant eller i snabb följd är uppenbara för fackmannen.The measurement of the refractive index at the different wavelengths must be done simultaneously or in very rapid succession, so that they different time-dependent noise sources do not apply. For measurement at two wavelengths, one can, for example, use one light source with two emission wavelengths, which hit two different detector elements (as in the Example below), a single detector element in combination with a fast rotating filters or two different laser wavelengths which alternate turns on and off in quick succession. For measurement over a larger wavelength ranges can be used e.g. a lamp and more emission lines or with a wide emission range, i 10 15 20 30 35 503 289 10 combination with a monochromator (sometimes called polychromator, since all wavelengths were allowed to pass through the sample simultaneously) and a diode array or CCD detector. Alternative technical solutions to perform the measurement simultaneously or in rapid succession are obvious to the professional.
Liksom fallet är för brytningsindexdetektion i allmänhet, kräver inte heller föreliggande metod att absolutvärdet av brytningsindex mäts. Det väsentliga är att mäta förändringar med tiden, och därför räcker det att mäta relativt brytningsindex eller att mäta någon egenskap som är relaterad till brytningsindex, såsom t.ex. brytningsvinkel, ljusintensitet eller fasskillnad (beroende pá vilken typ av refraktometer som används).As is the case for refractive index detection in generally, the present method also does not require that the absolute value of the refractive index is measured. The essential thing is that measure changes over time, and therefore it is enough to measure relative refractive index or to measure any property that is related to the refractive index, such as e.g. refraction angle, light intensity or phase difference (dependent on the type of refractometer used).
Föreliggande uppfunna förfarande har ett antal fördelar jämfört med konventionell enväglängdsrefraktometri. Genom att utvärdera brytningsindex' variation med våglängd vid konstant tid (en "ögonblicksbild") istället för att mäta absolut brytningsindex, minskar inflytandet fràn de ovannämnda tidsberoende bruskällorna, som t.ex. temperatur, tryck och mekaniska rörelser, vilket ger ökat signal-till- brus-förhällande och förbättrad känslighet. Mätning vid flera våglängder ger spektral information, som kan användas för kvalitativ analys. Graden av universell kontra selektiv detektion kan styras genom val av mätvàglängder. Den konventionella refraktometrins fördelar finns dock kvar: miniatyriserbarhet, snabbhet, enkelhet, robusthet och låg kostnad. Noteras kan också att konventionell enváglängds- refraktometri kan utföras även med en refraktometer konstruerad för flerváglängdsmätningar. Sälunda kan en konventionell envàglängdsmâtning och en flervàglängdsmätning utföras simultant i en och samma cell.The present inventive method has a number of advantages compared to conventional one-way refractometry. Through to evaluate the refractive index variation with wavelength at constant time (a "snapshot") instead of measuring absolute refractive index, reduces the influence of the the above-mentioned time-dependent sources of noise, such as temperature, pressure and mechanical movements, which gives increased signal noise-enhancing and improved sensitivity. Measurement at multiple wavelengths provide spectral information, which can be used for qualitative analysis. The degree of universal versus selective detection can be controlled by selecting measurement wavelengths. The however, the advantages of conventional refractometry remain: miniaturization, speed, simplicity, robustness and low cost. It can also be noted that conventional one-way refractometry can also be performed with a refractometer designed for multi-wavelength measurements. Thus, one can conventional one-way length measurement and a multipath measurement is performed simultaneously in one and the same cell.
Det inses direkt, att de kriterier för en idealisk detektor för vâtskekromatografi eller kapillärelektrofores som har lagts fram ovan, komer att uppfyllas av en refraktometer som använder sig av föreliggande uppfunna metod. 10 15 20 30 35 503 289 ll Metoden enligt föreliggande uppfinning kommer nu att illustreras i det följande, icke begränsande Exemplet, varvid även refereras till de bilagda figurerna, varav: Figur 1 är en skissartad ritning av den experimentella uppställning som används i Exemplet; Figur 2 är en skissartad ritning av det vâtske- hanteringssystem som används i Exemplet; Figur 3 är ett diagram som visar brytningsindexspektrum för fârgämnet HITC som används i Exemplet; och Figur 4 är en graf som visar avstånd mellan laserljus- flâckar som funktion av HITC-koncentrationen.It is immediately realized that the criteria for an ideal liquid chromatography or capillary electrophoresis detector which has been presented above, will be fulfilled by one refractometer using the present invention method. 10 15 20 30 35 503 289 ll The method of the present invention will now be illustrated in the following, non-limiting Example, also referring to the attached figures, of which: Figure 1 is a sketchy drawing of the experimental arrangement used in the Example; Figure 2 is a sketchy drawing of the liquid management systems used in the Example; Figure 3 is a graph showing the refractive index spectrum for the dye HITC used in the Example; and Figure 4 is a graph showing distances between laser light sources. spots as a function of HITC concentration.
EXEMPEL Differentiell refraktgmeter En experimentell differentiell refraktometer konstruerades såsom skissartat visas i Figur 1.EXAMPLE Differential refractometer An experimental differential refractometer constructed as sketched is shown in Figure 1.
Instrumentet bestod av två lasrar 1 och 2, respektive, en prismaformad flödeskyvett 3, en CCD-kamera 4, en TV-skärm 5 och en Polaroid®-kamera 6.The instrument consisted of two lasers 1 and 2, respectively, one prism-shaped flow cuvette 3, a CCD camera 4, a TV screen 5 and a Polaroid® camera 6.
Båda lasrarna 1 och 2 var av diodtyp med kollimerande optik. Laser 1 hade våglängd 660 nm (mer exakt 658,5 nm) (Melles-Griot) och drevs av ett spänningsaggregat (Mascot Electronics Type 719). Den andra lasern 2 hade våglängd 780 nm (Spindler & Hoyer) och drevs av ett andra spännings- aggregat, Diode Laser DL 25 Control Unit (Spindler & Hoyer). De två lasrarna 1 och 2 monterades i rät vinkel mot varandra på en stálplatta 7.Both lasers 1 and 2 were of the diode type with collimating optics. Laser 1 had a wavelength of 660 nm (more precisely 658.5 nm) (Melles-Griot) and powered by a power supply (Mascot Electronics Type 719). The second laser 2 had a wavelength of 780 nm (Spindler & Hoyer) and was driven by a second voltage unit, Diode Laser DL 25 Control Unit (Spindler & Hoyer). The two lasers 1 and 2 were mounted at right angles to each other on a steel plate 7.
I laserstrålarnas skärningspunkt fastskruvades ett svàrtat mâssingsrör (visas ej; innerdiameter 20 mm) i platta 7. Mâssingsröret hade slitsar, i vilka monterades ett filter 8 (Melles-Griot Short wavelength pass filter) med cutoff-våglängd cirka 700 nm i 45° vinkel mot strålriktningarna. Detta filter 8 transmitterade 660 nm- strålen från laser 1 men reflekterade 780 nm-strälen från laser 2, med den resulterande effekten att de två strålarna ficks att sammanfalla. Ett hål med 1 mm diameter tjänstgjorde som utgàngsspalt. 10 15 20 25 30 35 503 289 12 Flödeskyvett 3, en kommersiell kyvett med två prismaceller (bestående av två 45° prismaceller, 1,5 x 7 mm, volym 8 pl, med hypotenusorna mot varandra) avsedd för en brytningsindexdetektor till vätskekromatografi (Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Sweden), fastskruvades sedan på utsidan av mâssingsröret i anslutning till dess utgångsspalt. Endast en av de två prismacellerna i kyvett 3 användes, och anslöts genom slangar (visas ej) till ett enkelt vâtskehanteringssystem som beskrivs nedan (den andra prismacellen förblev tom).One was screwed into the intersection of the laser beams black brass tube (not shown; inner diameter 20 mm) i plate 7. The brass pipe had slots, in which were mounted one filter 8 (Melles-Griot Short wavelength pass filter) with cutoff wavelength approximately 700 nm at a 45 ° angle to beam directions. This filter 8 transmitted 660 nm the beam from laser 1 but reflected the 780 nm beam from laser 2, with the resulting effect of the two rays had to coincide. A hole with a diameter of 1 mm served as a starting point. 10 15 20 25 30 35 503 289 12 Flow cuvette 3, a commercial cuvette with two prism cells (consisting of two 45 ° prism cells, 1.5 x 7 mm, volume 8 pl, with the hypotenuses facing each other) intended for a refractive index detector for liquid chromatography (Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Sweden), was then screwed to the outside of the brass tube in connection to its output slot. Only one of the two the prism cells in cuvette 3 were used, and connected through hoses (not shown) for a simple liquid handling system as described below (the other prism cell remained empty).
Stålplatta 7 förankrades med en bult 10 i ena änden av en aluminiumplatta 9, och var alltså vridbar. CCD-kamera 4 (Panasonic WV-CD50), vilken drevs av ett spânningsaggregat Panasonic WV-CD52, monterades på andra ändan av platta 9 på ett avstånd av cirka 0,8 m (något varierande mellan de olika försöksserier som beskrivs nedan) från flödeskyvett 3, och var justerbar i vertikalled med hjälp av en mikrometerskruv, En bockad, svart stålkåpa placerades över CCD-kameran för att skärma av ströljus.Steel plate 7 was anchored with a bolt 10 at one end of an aluminum plate 9, and was thus rotatable. CCD camera 4 (Panasonic WV-CD50), which was powered by a power supply Panasonic WV-CD52, mounted on the other end of plate 9 on a distance of about 0.8 m (slightly varying between them different test series described below) from flow cuvette 3, and was adjustable vertically using a micrometer screw, A bent, black steel cover was placed over CCD camera to screen off scattered light.
Bilden från CCD-kameran projicerades på en TV-skärm 5 (Electrohome 10"), på vilken tejpats fast ett transparent rutnät (overheadfilm på vilken kopierats ett millimeter- papper med 1,4 X förstoring). Detta transparenta rutnät användes för att mäta avstånd på TV-skärm 5 medelst ruträkning. TV-skärmen fotograferades med en kamera 6 (Polaroidc) 600 SE) på ett stativ, på ett avstånd av cirka 0,5 m och med film Polaroidc) 611 Video Image Recording Film. Förstoringen från CCD-kamera 4 till TV-skärm 5 var cirka 30 X.The image from the CCD camera was projected on a TV screen 5 (Electrohome 10 "), to which a transparent tape is taped grid (overhead film on which a millimeter copy has been copied paper with 1.4 X magnification). This transparent grid was used to measure distance on TV screen 5 by means of grid count. The TV screen was photographed with a camera 6 (Polaroidc) 600 SE) on a stand, at a distance of approx 0.5 m and with film Polaroidc) 611 Video Image Recording Film. The magnification from CCD camera 4 to TV screen 5 was about 30 X.
Lasrarna 1 och 2 justerades i sid- och höjdled, och mâssingsröret i sidled så att snygga, symetriska ljusbilder (diameter 1-1,5 mm på CCD-kameran) från de två lasrarna erhölls strax ovanför varandra i höjdled pá TV- skärmen. Som generell strategi användes låg laserintensitet, hög kontrast på skärmen och exponeringstid 1/4 sekund. Därefter justerades skärmens ljusstyrka tills en för ögat skarp bild erhölls på skärmen, och slutligen 10 15 20 30 35 503 289 13 justerades blândaren tills en skarp bild erhölls pà fotografiet.Lasers 1 and 2 were adjusted laterally and vertically, and the brass tube sideways so that they look good, symmetrical slides (diameter 1-1.5 mm on the CCD camera) from the two the lasers were obtained just above each other in height on the TV screen. As a general strategy, low was used laser intensity, high screen contrast and exposure time 1/4 second. Then the screen brightness was adjusted until an eye-catching image was obtained on the screen, and finally 10 15 20 30 35 503 289 13 the blender was adjusted until a sharp image was obtained the photograph.
Ljusfläckarnas läge bestämdes genom att ta ett fotografi av Tv-skärm 5, och sedan genom rutråkning i ett mikroskop bestâma läget för ljusflåckarnas vänstra och högra kant, respektive, och därefter anta att varje flåcks centrum làg mittemellan de bàda kanterna.The position of the light spots was determined by taking one photography of TV screen 5, and then by boxing in one microscopes determine the position of the left and right light spots right edge, respectively, and then assume that each flake center low midway between both edges.
Vâtskehanteringsgystem Vätskehanteringssystemet, som visas i Figur 2, bestod av en peristaltisk pump 11 (P1, Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Sweden). Pà ena sidan var pump 11 ansluten till en provbehàllare 12 via en slang 13, och pä andra sidan till en manuell vridventil 14 via en slang 15. En slang 16 anslöt ventil 14 till slask. Via en 0,4 m kanyl 17, anslöt en slang 18 ventil 14 med flödeskyvett 3, vilken beskrevs i anslutning till figur 1. En slang 19 anslöt kyvett 3 med en kyvettslask. Den manuella ventilen 14 möjliggjorde pumpning av vätska antingen till slask eller till kyvett 3.Liquid management system The fluid management system, shown in Figure 2, existed of a peristaltic pump 11 (P1, Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Sweden). On one side, pump 11 was connected to a sample container 12 via a hose 13, and to others side to a manual rotary valve 14 via a hose 15. A hose 16 connected valve 14 to slack. Via a 0.4 m cannula 17, a hose 18 connected valve 14 with flow cuvette 3, which was described in connection with Figure 1. A hose 19 was connected cuvette 3 with a cuvette slap. The manual valve 14 enabled pumping of liquid either to sludge or to cuvette 3.
Under mätningarna, som beskrivs nedan, pumpades vätska med cirka 23 pl/min genom flödeskyvetten. Vid vätskebyte vreds ventil 14 till slask, och flödet tiofaldigades för att rensa pumpslangarna 13 och 15. Sedan sänktes flödet igen, ventilen vreds till kyvettläge och vätska pumpades i minst 15 minuter genom kyvetten (pà grund av dödvolymen i kanyl 17) innan mätning gjordes. nin v f r ' n'n r En citratbuffert (pH 3, 0,1 M citrat, 0,4 M NaCl, 0,05% TweenC)20) bereddes genom att lösa 21 g citronsyra (M&B p.a.) och 23 g natriumklorid (Merck p.a.) i 1000 ml avjoniserat vatten. 5 ml TweenC)20 (Calbiochem 655206, 10%, protein grade) tillsattes. 4 M natriumhydroxid (p.a.) tillsattes för att justera pH från 1,95 till 3,00, och lösningen filtrerades genom ett 0,22 pm filter. 500 ml av citratbufferten blandades sedan med 500 ml spektrografiskt ren etanol och homogeniserades med ultraljud nägra minuter.During the measurements, described below, liquid was pumped at about 23 pl / min through the flow cuvette. When changing fluids valve 14 was turned to sludge, and the flow was increased tenfold to clean the pump hoses 13 and 15. Then the flow was reduced again, the valve was turned to the cuvette position and liquid was pumped in at least 15 minutes through the cuvette (due to the dead volume in cannula 17) before measurement was made. nin v f r 'n'n r A citrate buffer (pH 3, 0.1 M citrate, 0.4 M NaCl, 0.05% TweenC) 20) was prepared by dissolving 21 g of citric acid (M&B) p.a.) and 23 g of sodium chloride (Merck p.a.) in 1000 ml deionized water. 5 ml TweenC) 20 (Calbiochem 655206, 10%, protein grade) was added. 4 M sodium hydroxide (p.a.) was added to adjust the pH from 1.95 to 3.00, and the solution was filtered through a 0.22 μm filter. 500 ml of the citrate buffer was then mixed with 500 ml spectrographically pure ethanol and homogenized by sonication for a few minutes.
En 500 pM stamlösning av fârgämnet HITC (1,1',3,3,3',3'-hexametylindotricarbocyanin) bereddes sedan 10 ß 20 30 35 503 289 M genom att lösa 14 mg HITC jodid (Sigma H0387, 94% renhet, molvikt 537 g/mol; Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., U.S.A.) i 50 ml av den ovan beredda citrat/etanol- bufferten. Efter homogenisering med ultraljud några minuter, filtrerades lösningen genom ett 0,45 um filter.A 500 pM stock solution of the dye HITC (1,1 ', 3,3,3', 3'-hexamethylindotricarbocyanine) was then prepared 10 ß 20 30 35 503 289 M by dissolving 14 mg of HITC iodide (Sigma H0387, 94% purity, molecular weight 537 g / mol; Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., U.S.A.) in 50 ml of the citrate / ethanol prepared above the buffer. After homogenization with ultrasound some minutes, the solution was filtered through a 0.45 μm filter.
En spâdningsserie till sju olika koncentrationer HITC gjordes genom att späda olika volymer av HITC-stamlösningen till 25 ml med citrat/etanol-buffert: HITQ (nd) Hgïç-kgnç. (gu) 25 500 12,5 250 6,25 125 3,125 62,5 1,563 31,25 0,781 15,63 0 O nin v r ' 'n x Brytningsindexspektrum för 1 mM HITC visas i Figur 3 (heldragen linje: teoretiskt beräknad kurva, kryss: experimentella data). Som framgär härav, ligger mätvàglängden 780 nm (laser 2) nära maximum i brytningsindex, pà dess högvàglängdssida, medan den andra mätvàglàngden 660 nm (laser 1) ligger pà brytningsindexets minimumplatà. _ Med hänvisning till den ovan beskrivna apparaten (Figur 1 och 2), justerades flödeskyvettens (3) position genom att fylla denna med etanol/vatten 50/50 (avjoniserat vatten och spektrografiskt ren etanol) med hjälp av en spruta och sedan vrida stälplattan (7) tills de tvä laserljusfläckarna centrerades ovanför varandra pá CCD-kameran. Avståndet mellan flödeskyvett och CCD-kamera var 73 cm.A dilution series to seven different HITC concentrations was done by diluting different volumes of the HITC stock solution to 25 ml with citrate / ethanol buffer: HITQ (nd) Hgïç-kgnç. (gu) 25 500 12.5 250 6.25 125 3,125 62.5 1,563 31.25 0.781 15.63 0 O nin v r '' n x The refractive index spectrum of 1 mM HITC is shown in Figure 3 (solid line: theoretically calculated curve, cross: experimental data). As can be seen from this, lies measuring wavelength 780 nm (laser 2) near maximum i refractive index, on its high wavelength side, while the other the measuring wavelength 660 nm (laser 1) is on the refractive index minimum plate. _ With reference to the apparatus described above (Figure 1 and 2), the position of the flow cuvette (3) was adjusted by fill this with ethanol / water 50/50 (deionized water and spectrographically pure ethanol) using a syringe and then turn the adjusting plate (7) until the two laser light spots centered on top of each other on the CCD camera. The distance between flow cuvette and CCD camera was 73 cm.
Sedan utfördes brytningsindexmâtningar för var och en av de olika HITC-koncentrationerna, vilka beskrivits ovan, varvid vâtskehanteringen skedde såsom beskrivits ovan under "Vätskehanteringssystem". Laserintensiteterna, TV-skärmens ljusstyrka och kamerans exponeringstid och bländare justerades för varje färgâmneskoncentration för att erhàlla skarpa bilder av ljusfläckarna. 10 15 503 289 15 För varje färgämneskoncentration togs två fotografier med nägra minuters mellanrum. Avståndet mellan de två laserljusflâckarna uppskattades som beskrivits ovan genom ruträkning. Resultaten presenteras i Figur 4, som visar medelvärdet av ljusfläcksavstànden i millimeter som funktion av HITC-koncentration. Sambandet är rätlinjigt med mycket god passningsgrad, determinationskoefficienten är O,9992. Den räta linjens lutning, det vill säga känsligheten med avseende på HITC-koncentration, år 3,1 pm/pM, eller i vinkelenheter 0,00024 °/pM, eller i brytningsindexenheter (RIU) 2,0 pRIU/pM.Then, refractive index measurements were performed for each of the different HITC concentrations described above, the liquid handling taking place as described above below "Fluid management system". The laser intensities, the TV screen brightness and camera exposure time and aperture was adjusted for each dye concentration to obtain sharp images of the light spots. 10 15 503 289 15 For each dye concentration, two photographs were taken every few minutes. The distance between the two the laser light spots were estimated as described above by grid count. The results are presented in Figure 4, which shows the mean value of the light spot distance in millimeters as function of HITC concentration. The relationship is linear with very good degree of fit, the coefficient of determination is O, 9992. The slope of the straight line, that is sensitivity to HITC concentration, year 3.1 pm / pM, or in angular units 0.00024 ° / pM, or in refractive index units (RIU) 2.0 pRIU / pM.
De ovan beskrivna experimenten demonstrerar tydligt genomförbarheten hos föreliggande uppfunna förfarande.The experiments described above clearly demonstrate the feasibility of the present inventive method.
Uppfinningen begränsas givetvis inte till de ovan speciellt beskrivna utföringsformerna, utan en rad förändringar och modifieringar kan göras utan att frángà det generella, uppfunna förfarandet såsom det definieras i följande patentkrav.The invention is of course not limited to the above in particular described embodiments, without a series of modifications and modifications can be made without departing from the general, invented the procedure as defined below patent claims.
Claims (10)
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9303149A SE503289C2 (en) | 1993-09-28 | 1993-09-28 | Ways to determine the concentration of substances in a liquid |
| JP7510250A JPH09503064A (en) | 1993-09-28 | 1994-09-26 | A new method for detecting substances in liquids |
| EP94929070A EP0721580A1 (en) | 1993-09-28 | 1994-09-26 | A new method of detecting substances in a liquid |
| AU78259/94A AU7825994A (en) | 1993-09-28 | 1994-09-26 | A new method of detecting substances in a liquid |
| PCT/SE1994/000887 WO1995009355A1 (en) | 1993-09-28 | 1994-09-26 | A new method of detecting substances in a liquid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9303149A SE503289C2 (en) | 1993-09-28 | 1993-09-28 | Ways to determine the concentration of substances in a liquid |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SE9303149D0 SE9303149D0 (en) | 1993-09-28 |
| SE9303149L SE9303149L (en) | 1995-03-29 |
| SE503289C2 true SE503289C2 (en) | 1996-05-13 |
Family
ID=20391230
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE9303149A SE503289C2 (en) | 1993-09-28 | 1993-09-28 | Ways to determine the concentration of substances in a liquid |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0721580A1 (en) |
| JP (1) | JPH09503064A (en) |
| AU (1) | AU7825994A (en) |
| SE (1) | SE503289C2 (en) |
| WO (1) | WO1995009355A1 (en) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19540456C2 (en) * | 1995-10-30 | 1997-10-09 | Buschmann Johannes | Method of measuring glucose concentration in a liquid and use of the method |
| US5870185A (en) * | 1996-10-21 | 1999-02-09 | C.F.C. Technology, Inc. | Apparatus and method for fluid analysis |
| US7200494B2 (en) | 2001-10-30 | 2007-04-03 | Hitachi, Ltd. | Method and apparatus for chromatographic data processing |
| JP3807306B2 (en) | 1999-09-27 | 2006-08-09 | 株式会社日立製作所 | Chromatographic data processing apparatus, chromatographic data processing method, and chromatographic analyzer |
| JP2004016609A (en) | 2002-06-19 | 2004-01-22 | Omron Healthcare Co Ltd | Method and apparatus for measuring concentration of bodily fluid component |
| GB0415882D0 (en) * | 2004-07-15 | 2004-08-18 | Univ Southampton | Optical sensors |
| CN105378458B (en) * | 2013-06-07 | 2021-05-25 | 马尔文仪器有限公司 | Detector Array-Based Sample Characterization |
| CN112147098B (en) * | 2020-11-03 | 2024-01-16 | 安徽大学 | Gas type and concentration detection system based on anomalous dispersion effect |
| CN117214125B (en) * | 2023-11-09 | 2024-01-26 | 南京盛略科技有限公司 | Liquid component detection system and method based on detection optical fiber |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL66127A (en) * | 1982-06-24 | 1987-11-30 | Israel State | Method and apparatus for measuring the index of refraction of fluids |
| US4704029A (en) * | 1985-12-26 | 1987-11-03 | Research Corporation | Blood glucose monitor |
-
1993
- 1993-09-28 SE SE9303149A patent/SE503289C2/en not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-09-26 AU AU78259/94A patent/AU7825994A/en not_active Abandoned
- 1994-09-26 WO PCT/SE1994/000887 patent/WO1995009355A1/en not_active Ceased
- 1994-09-26 EP EP94929070A patent/EP0721580A1/en not_active Withdrawn
- 1994-09-26 JP JP7510250A patent/JPH09503064A/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU7825994A (en) | 1995-04-18 |
| JPH09503064A (en) | 1997-03-25 |
| EP0721580A1 (en) | 1996-07-17 |
| SE9303149L (en) | 1995-03-29 |
| SE9303149D0 (en) | 1993-09-28 |
| WO1995009355A1 (en) | 1995-04-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Betteridge et al. | A highly sensitive flow-through phototransducer for unsegmented continuous-flow analysis demonstrating high-speed spectrophotometry at the parts per 10 9 level and a new method of refractometric determinations | |
| Nylander et al. | Gas detection by means of surface plasmon resonance | |
| US7982875B2 (en) | Method and apparatus for measuring the scattered light signals from a liquid sample | |
| Brown | High Pressure Liquid Chromatography: Biochemical and Biomedical Applications | |
| US7961318B2 (en) | Circular birefringence refractometer: method and apparatus for measuring optical activity | |
| US3713743A (en) | Forward scatter optical turbidimeter apparatus | |
| US4088407A (en) | High pressure fluorescence flow-through cuvette | |
| US10648907B2 (en) | Total protein measurement using whole blood refractometry | |
| US20210096128A1 (en) | Determination of protein concentration in a fluid | |
| JPH05240774A (en) | Optical cell and optical detection device and sample separation detection device using the same | |
| JP2520212B2 (en) | Concentration measuring device | |
| US20100182606A1 (en) | Apparatus and method for multi-parameter optical measurements | |
| EP0672249B1 (en) | Use of capillary electrophoresis for quantitating the concentration of protein components and of the total protein in fluids | |
| SE503289C2 (en) | Ways to determine the concentration of substances in a liquid | |
| US20050168726A1 (en) | Enhanced sensitivity differential refractometer incorporating a photodetector array | |
| JP3318657B2 (en) | Optical measuring device for measuring transmitted and scattered light | |
| CN1648639A (en) | Enhanced sensitivity differential refractometer measurement cell | |
| SE500817C2 (en) | Methods to determine the concentration of an analyte in a liquid chromatographic or capillary electrophoretic flow by measuring the refractive index of the liquid | |
| FI112540B (en) | Method for illuminating particles in a medium for optical analysis and optical particle analyzer | |
| Hanning et al. | A spectroscopic refractometer for temperature-independent refractive index detection | |
| RU2589374C1 (en) | Refractometric detector with laser module and chromatographic channel in non-metal design for liquid chromatography and method of detecting organic and inorganic substances with refractometric detector | |
| CN110531003A (en) | A method for measuring glucose content in compound electrolyte glucose injection | |
| SE501663C2 (en) | Refractometric method for indirect detection of a substance | |
| JPH0783819A (en) | Particle measuring device | |
| JP2006343326A (en) | Tool for measuring differential refractive index |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| NUG | Patent has lapsed |
Ref document number: 9303149-0 Format of ref document f/p: F |