SE465943B - Metod foer samtidig detektering av olika analyter, spec antikroppar med "elispot" tekniken - Google Patents

Description

10 15 20 25 30 35 465 943 Uppfinningens ändamål och viktigaste kännetecken Ändamålet med föreliggande uppfinning är att åstadkomma en metod baserad på ELISPOT-metoden med vilken man samtidigt kan detektera minst två olika typer av antikroppar och/eller antigener. Detta har enligt uppfinningen uppnåtts genom att cellsuspensionen tillsättes till den fasta immunosorbenten och att därefter eller samtidigt därmed tillsättes minst två olika typer av sagda andra antikroppar, varvid vardera typ av sagda andra antikroppar förmår binda till en och endast en av minst två antigeniskt distinkta typer av anti- kroppar som skall detekteras och vilka andra antikroppar är försedda med olika enzymer, att man efter inkubering och tvättning av immunosorbenten tillsätter en första indikator- substans och eventuella färgade fläckar medges att framkal- las, att efter tvättning av immunosorbenten en andra in- dikatorsubstans tillsättes vilken uppvisar en särskiljande färgningseffekt jämfört med den första indikatorsubstansen och eventuella färgade fläckar medges att framkallas, och att efter tvättning av immunosorbenten, och eventuell uppre- pad tillsats av ytterligare indikatorsubstanser var och en uppvisande en särskiljande färgningseffekt relativt varan- dra och den första och den andra indikatorsubstansen, de olika typerna av antikroppar och/eller antigener utsöndrade och/eller frigivna av enskilda celler detekteras samtidigt genom räkning av på den fasta immunosorbenten framkallade fläckar med distinkt färg.

Beskrivning av ritningen Uppfinningen kommer i det följande att närmare beskrivas med hänvisning till bifogade ritning, vilken schematiskt visar en framkallad platta uppvisande fläckar av olika färg in- dikerade i form av fyllda resp. ofyllda ringar, indikerande närvaro av två antigeniskt distinkta typer av antikroppar och/eller antigener. 10 15 20 25 30 35 465 945 Beskrivning av uppfinningen Enligt det nedan beskrivna utföringsexemplet har använts en kombination av de ovan angivna indikatorsystemen i form av AP- och HRP-märkta antikroppar och motsvarande kromogena substrat för samtidig detektering av distinkta typer av antikroppsproducerande celler. I det beskrivna exemplet visualiserades zoner av IgG och IgA antikroppar bundna till en fast bärare och producerade av distinkta celler, i form av blå respektive röda fläckar motsvarande vardera av dessa olika typer av antikroppar.

Vid försöket erhöll fyra vuxna frivilliga försökspersoner en intramuskulär injektion av ett trivalent influensa virusvac- cin, typ A och B (Wyett Laboratories, PA). Perifera mononuk- leära celler från blod (PBMC) uppsamlades mellan 5 och 12 dagar efter immunisering, vilket är den tidpunkt när mängden av antigen-specifika spontant bildade antikroppsproducerande celler i cirkulationssystemet är känd att vara maximal. PBMC isolerades från hepariniserat venöst blod genom centrifuge- ring på Ficoll-Hypaque (Böyum,1968). Interfas-PBMC tvättades två gånger med isoton fosfatbuffrad saltlösning (0,0l M fosfat, 0,15 M NaCl, pH 7,4 och suspenderades åter till lämplig densitet i ett kulturmedium bestående av RPMI 1640 (Gibco, Glasgow, Skottland) tillsatt med 5 % fetalt bovinse- rum (FBS) (Irvine Scientific, Santa Ana, Kalifornien).

RQHQQDS AP- och HRP-konjugerade affinitetsrenade antihumana IgA och IgG antikroppar från get tillhandahölls i form av kommersi- ell produkt. Den kromogena substratlösningen för AP, be- stående av 5-brom-4-klor-3-indolylfosfattoluidinsalt och p- nitroblå-tetrazoliumklorid (BCIP/NBT) framställdes enligt tillverkarens föreskrifter (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien). Först upplöstes separat 15 mg BCIP reagens och 10 15 20 25 30 35 465 943 4 30 mg NBT salt med 1 ml dimetylformamid (DMF) och tillsattes sedan till 100 ml av en lösning av 0,1 M NaHC03, 1mM MgClW pH9,8. Lösningen av HRP-kromogent substrat framställdes genom att lösa 25 mg 3-amino-9-etylkarbazol (AEC) i 2 ml DMF följt av tillsats av 95 ml 0,05 M acetatbuffert, pH 5,0 (f0,2) och 40 ul 30% EQOZ. Ovan angivna substratlösningar filtrerades (0,45 pm) för att avlägsna partikulära substan- ser. AEC/Hgh-lösningen blev färglös efter filtrering medan BCIP/NBT lösningen förblev svagt gul. Båda enzymsubstratlös- ningarna kan förvaras mörkt vid 4°C upp till l vecka.

Metod Metoden enligt uppfinningen består av fem steg: 1) framställning av en fast immunoadsorbent, 2) inkubering av cellsuspensionen, 3) tillsats av både AP- och HRP-konjugerade antikroppar, 4) satsvis tillsats av AP- och HRP-kromogena substrat vilket framkallar olösliga blå resp. röda fläckar. 5) räknande av fläckarna.

Den standardiserade ELISPOT-tekniken modifierades genom användande av nitrocellulosamembran som fast bärare i stäl- let för polystyren. Enskilda brunnar i Millifilter HA 96- brunnars provplattor (Millipore, Bedford, MA) fylldes med 0,075-0,1 ml PBS innehållande 0,2 pg influensavirus-hemag- glutinin Plattorna fick stå över natten vid 4°C. Icke-adsorberat protein avlägsnades genom tre efterföljande manuella tvättningar med PBS och plattorna (Wyett Laboratiores). nedsänktes i denna buffert under 5 min. Brunnarna tömdes på tvättbuffert och den yttre ytan hos nitrocellulosamembranet torkades noggrant med absorberande papper. För att mätta kvarstående proteinbindningsställen pà den fasta bäraren fylldes enskilda brunnar med 0,2 ml av provkulturmedium och plattorna inkuberades vid 37°C under minst 30 min. i en fuktig atmosfär med 7 % C02. Brunnar exponerade för ett ir- 10 15 20 25 30 35 465 945 5 relevant antigen, tetanustoxoid (TT) (Wyett) (0,1 pg/brunn) preparerades på samma sätt för kontrolländamàl.

Innehållet i brunnarna ersattes med 0,1 ml cellsuspensioner innehållande olika antal PBMC. Rutinmässigt användes minst tre set tredubbla brunnar. Varje set brunnar erhöll 2 x IOÉ 105 och 5 x 104 PBMC/brunn. Plattorna inkuberades under 3-4 tim. vid 37°C i en C02 inkubator. I ett experiment inkubera- des PBMC under 5 tim. vid 37°C med olika koncentrationer (5x1o'* M, 10-3 M, 2 x 10* M) av aykloneximid (sigma) i provkulturmedium, tvättades, resuspenderades och placerades i ett medium innehållande cykloheximid.

Vid fullföljandet av cellinkuberingsperioden sköljdes plat- torna tre gånger manuellt med PBS och tre gånger med PBS innehållande 0,05% Tween 20 (PBS-T) och nedsänktes sedan i PBS-T under 5 min. Fördjupningarna tömdes på tvättbuffert och plattans yttre yta torkades såsom i det första steget.

Därefter tillsattes till varje fördjupning 0,1 ml PBS-T innehållande 1% FBS och en blandning av antihumana IgG- och IgA-antikroppar från get konjugerade med AP resp. HRP eller vice versa. Optimala koncentrationer av AP- och HRP-märkta antiglobuliner bestämdes i preliminära experiment. Koncen- trationer varierande från 0,5 pg/ml till 2,5 pg/ml användes för båda typer av enzymkonjugat. Plattor inkube-rades under 3 tim. vid 4°C. Plattorna sköljdes fyra gånger med PBS och nedsänktes i 0,05 M trisbuffert saltlösning, pH 8,0, under 5 min. före framkallning.

Plattorna tömdes på tvättbuffert och torkades som ovan.

Brunnarna exponerades för 0,1 ml BCIP/NBT substratlösning och undersöktes med avseende på uppkomsten av blå fläckar.

Dessa reaktioner uppstod vanligen inom 5-10 min. Plattorna tilläts framkallas under ytterligare 5-10 min. varefter de sköljdes med PBS och torkades. Därefter tillsattes till varje brunn 0,1 ml AEC/H55 substrat vilket gav röda fläckar inom 1-3 min. Plattorna fick framkalla under en varierande 10 15 20 465 943 6 tid (upp till 10 min.) och sköljdes sedan med kranvatten. Då en omfattande bakgrundsfärgning kan uppträda vid alltför långa inkubationstider är det viktigt att övervaka kontroll- brunnar (ej exponerade för celler) under enzymsubstratreak- tionen.

Framkallade plattor torkades och individuella fördjupningar undersöktes med avseende på förekomsten av blà och röda fläckar (se ritning). Dessa reaktioner räknades vid làg förstoring (x40 till x60). Vid låg förstoring definerades positiva reaktioner som cirkulära, väl avgränsade, tätt granulerade foci i nivå med bakgrunden. Deras diameter varierade fràn 0,05 mm till 0,2 mm. Små täta partiklar kunde tillfälligtvis iakttagas speciellt vid överexponering för enzymsubstraten. Dessa icke-granulära fläckar uppstod van- ligen ovanför bakgrundens plan och kunde särskiljas från verkliga fläckar.

I nedanstående tabell 1 görs en jämförelse mellan en-färgs - och två-färgs ELISPOT för räkning av antigenspecifika IgG- och IgA-producerande celler. Perifera blod PBMC erhölls från en frivillig 7 dagar efter immunisering med influensaviru- svaccin. Värdena uttryckas som medelvärdet av antalet fläck- bildande celler (SFC) hos fyrdubbla provfördjupningar.

F", 10 15 20 25 30 35 465 945 Tabell 1 Antal sFc/uPPBMc i fördjupningar framkallade med HRP anti-IgG HRP anti-IgA - 5080 (62l)° AP anti-IgA 3920 (420)b 3730 (470) 3445 (376) AP anti-IgG 4153 (537) 4540 (420) - 4860 (515) 3636 (354) a övre värden motsvarar antal röda fläckar framkallade med HRP-konjugerade anti-Ig antikroppar och AEC/H53 kromo gent substrat b lägre värden indikerade med fetstil motsvarar antal blå fläckar framkallade med AP-konjugerade anti-Ig och BCIP/NBT substrat.

Undersökningen indikerar att AP-BCIP/NBT reaktionerna inte har någon nämnvärd effekt på den efterföljande framkall- ningen av HRP-AEC/H45 reaktionerna. Vidare syntes känslighe- ten för båda enzymsubstratsystemen att vara jämförbara, då liknande antal fläokbildande celler (SFC) detekterade av samma anti-immuno-globinpreparat märkt med endera av en- zymen.

Beskaffenheten av de använda enzym-antikroppkonjugaten i den uppfinningsenliga tvâ-färgs ELISPOT - metoden måste noggrant beaktas, då dubbla (indigo) fläckar kan uppträda med kon- jugat innehållande korsreaktiva antikroppar. Således utgör monokromatiska (röda eller blå) fläckar en ideal inre kon- 10 15 20 25 30 35 465 943 8 troll av analysmetodens specificitet för detektering av antigeniskt distinkta produkter producerade av olika celler. Även om två enzym-antikroppskonjugat kan vara lika specifika kan de uppvisa olika affinitet för bindning till kognata immunoglobuliner och/eller olika enzymaktiviteter, vilket resulterar i olika färgningsintensitet av motsvarande fläck- ar. I sådana situationer bör tillämpas en korrektionsfaktor (förhållande mellan antal fläckar utvecklade med en given antikropp konjugerad med HRP och antal fläckar utvecklade med samma antikroppspreparat men märkta med AP) för att korrigera för eventuella differenser i känslighet.

Under optimala förhållanden kunde PBMC - producerande IgG antikroppar och PBMC - producerande IgA antikroppar mot influensavirus detekteras samtidigt för alla fyra undersökta försökspersoner. Virusspecifika ASC detekterades redan 5 dagar efter immunisering med influensavirusvaccin. Antalet fläckbildande celler (SFC) nådde ett maximum dag 7. Under dag 9-12 minskade frekvensan av virusspecifika SFC markant (ej visat). Influensavirusspecifika IgG-SFC och IgA-SFC svar följde ett liknande kinetiskt mönster men skiljde sig i magnitud. Således dominerade hos tre av försökspersonerna IgG-sm (sszo :f 983 dag 7 IgG sFc/w* PBMC gentemot 140 i 69 dag 7 IgA SFC/105; n=3). Hos den fjärde försökspersonen var magnituden pà influensavirusspecifika IgA - svar dag 7 mycket höga (3910/106 PBMC i: 420 SFC) vilket är nästan jämförbart med IgG svaren (5080 i 621 SFC/106 PBMC).

Specificiteten hos analysmetoden för samtidig detektering av influensavirus - specifika IgA ASC och IgG ASC dokumentera- des genom flera observationer. För det första förhindrade utelämnandet av celler, antigenbeläggning eller märkta anti- kroppar efterföljande utveckling av fläckblandning. För det andra resulterade inkuberingen av PBMC i brunnar belagda med ett irrelevant antigen (tetanustoxoid) i frånvaro av detek- terbara fläckar (tabell 2). För det tredje inhiberade, beroende på doseringen, inkubering av influensavirusimmuna F\ t!! 10 15 20 25 30 35 465 943 9 celler med graderade mängder influensavirusantigen under cellinkuberingen fläckbildning (tabell 2). Det bör noteras att sådana behandling icke enbart resulterade i en reduce- ring av antalet SFC utan också i en minskning av diametern hos de återstående fläckarna. I motsats härtill hade till- sats av tetanustoxoid ingen effekt. Slutligen inhiberade markant behandling av cellerna med cykloheximid före och under cellinkuberingsperioden bildandet av influensavirus- specifika IgG- och IgA- förmedlade fläckar (tabell 2). Det faktum att "dubbla" (bikromatiska) fläckar aldrig observera- des bekräftade den höga graden av specifitet hos det en- zymmärkta antikroppspreparatet använt som klasspecifikt reagens i denna analys.

I nedanstående tabell 2 visas specificiteten hos två-färgs ELISPOT analys för samtidig detektering av influensavirus- specifika IgA- producerande PBMC. Perifera PBMC frán blod erhölls från en donator dag 7 efter immunisering med in- fluensavirusvaccin. PBMC anlyserades genom två-färgs ELISPOT analys för ett antal virusspecifika ASC. IgG SFC och IgA SFC utvecklades med AP-konjugerade anti-IgG resp. HRF- konjuge- rade anti-IgA följt av BCIP/NBT (blått) och AEC/H55 (rött) enzymsusbstrat. Värdena representerar medelvärden av SFC hos fyrdubbla provfördjupningar /105 PBMC. Data inom parentes indikerar inhiberingen i procent.

Tabell 2 Inhibitor tillsatt antal sFc/lofi PBMC per provfördjupning IgG (blå) (IgA) röd - 6560 220 Influensavirus 15ug 120 (98%) 0 (100%) 3ug 1400 (79%) 45 (80%) 0.6pg 2720 (59%) 96 (57%) 0.12pg 3840 (42%) 240 (-11%) 10 15 20 25 30 35 465 943 10 Tetanustoxoid 6120 (6.7%) 197 (l0.4%) 100pg cykioneximid* 2 x 10-3 M 720 (89%) 20 (91%) 10* M 2000 (69.s%) 70 (6s.2%) s x 10-* M 2960 (54.e%) 100 (54.5%) Behandling med cykloheximid påverkade ej cellernas livs duglighet (bestämd genom färgningsexklusion med trypan blått).

Av preliminära jämförande experiment framgick att den upp- finningsenliga metoden var minst fem gånger känsligare än de ursprungliga ELISPOT - metoderna utförda på plastytor och framkallade antigen med parafenyldiamin/H55 i. agar (HRP system) eller BCIP (AP system) förstärkt med NBT. De höga bindnings- och retentionsegenskaperna hos nitrocellulosabä- raren för proteinantigener kan svara för en sådan ökning av känsligheten. Användandet av nitrocellulosamembraner i ELISPOT - analys som nyligen introducerats ( J. Immunol.

Methods 1985, 79,195; Möller och Borrebaeck "A filter immu- noplaque assay for the detection of antibody - secreting cells in vitro") minimerar väsentligen kraven hos de tidiga- re teknikerna på relativt stora mängder beläggningsmaterial.

Dessutom förlitar sig inte denna metod på användandet av ett gelöverdrag, såsom är fallet med vissa peroxidaskromogener på plastytor.

Den uppfinningsenliga metodens användbarhet har även verifi- erats för samtidig detektering av andra Ig isotyper (IgM, IgG subklasser) i både humana och murina system. Metoden bör även vara användbar för detektering av andra typer av anti- kroppsproducerande celler, t.ex. lymfokinproducerande cel- ler, samt för detektering av antigener, dvs viruset självt eller delar av detta, eller samtidig detektering av både antikroppar och antigener. De antikroppar eller antigener som skall detekteras kan vara av eukaryotiskt, bakteriellt, f! <4/ f) 10 15 20 465 943 ll viralt eller parasitärt ursprung.

Ytterligare visualiseringssystem, t.ex. silver-immunoguld - färgning (J. Immunol. Methods, 1987, 104, 281, Walker och Dave "The rapid and sensitive enumeration of antibody - secreting cells using immunogold/silver staining") kan även vara användbara för samtidig detektering av flera immunore- aktiva substanser. Det torde därvid vara möjligt att under- söka huruvida tvà eller flera antigeniskt distinkta pro- dukter härrör från samma eller olika celler.

De till bäraren bundna receptorerna dvs. antigenerna eller antikropparna (i det fall antigener skall detekteras) kan vara av en enda typ med förmåga att reagera med de olika typer av antikroppar resp. antigener som skall detekteras.

De kan även vara av olika typ vilka reagerar med var sin typ av antikroppar och/eller antigener som skall detekteras. Den fasta bäraren kan även bestå av två motstående plattor eller blad, varvid en typ av antigen resp. antikropp kan vara bunden till den ena plattan och en annan typ av antigen resp. antikropp är bunden till den motstâende plattan, varvid cellsuspensionen anbringas mellan plattorna. Det blir på detta sätt möjligt att samtidigt detektera fler typer av antigener och/eller antikroppar.

Claims (8)

10 15 20 25 30 35 465 945 u, P A T E N T K R A V

1. Metod för detektering av antikroppar och/eller antigener utsöndrade och/eller frigivna av enskilda celler enligt ELISPOT-tekniken, varvid en cellsuspension bringas i kontakt och inkuberas med korresponderande antigener och/eller antikroppar bundna till en fast immunosorbent, att därefter eller samtidigt tillsättes andra antikroppar riktade mot och med förmåga att bindas till de antikroppar resp. antigener som skall detekteras, och vilka andra antikroppar är försedda med ett enzym vilket reagerar med en indikator- substans vilken har en färgningseffekt som efter fram- kallning ger färgade fläckar motsvarande zoner av fast fas- bundna antikroppar och/eller antigener utsöndrade och/eller frigivna av enskilda celler, varvid sagda fläckar räknas i ett slutsteg, där varje fläck motsvarar en enskild antikropps- och/eller antigensutsöndrande cell, k ä n n e t e c k n a d d ä r a v, att cellsuspensionen tillsättes till den fasta immuno- sorbenten och att därefter eller samtidigt därmed tillsättes minst två olika typer av sagda andra antikroppar, varvid vardera typ av sagda andra antikroppar förmår binda till en och endast en av minst två antigeniskt distinkta typer av antikroppar som skall detekteras och vilka andra antikroppar är försedda med olika enzymer, att man efter inkubering och tvättning av immunosorbenten tillsätter en första indikatorsubstans och eventuella färgade fläckar medges att framkallas, att efter tvättning av immunosorbenten en andra indikatorsubstans tillsättes vilken.uppvisar en särskiljande färgningseffekt jämfört med den första indikatorsubstansen och eventuella färgade fläckar medges att framkallas, och att efter tvättning av immunosorbenten, och eventuell upprepad tillsats av ytterligare indikatorsubstanser var och en uppvisande en särskiljande färgningseffekt relativt varandra och den första och den andra indikatorsubstansen, de olika typerna av antikroppar och/eller antigener utsöndrade och/eller frigivna av enskilda celler detekteras VI l0 15 20 25 30 35 465 943 /5 samtidigt genom :räkning av' pá den fasta immunosorbenten framkallade fläckar med distinkt färg.

2. Metod enligt patentkrav 1, k ä n n e t e c k n a d d ä r a v, att de till den fasta immunosorbenten bundna antigenerna och/eller antikropparna är av en enda typ med förmåga att reagera med de olika typer av antikroppar som skall detekteras.

3. Metod enligt patentkrav 1, k ä n n e t e c k n a d att de till den fasta immunosorbenten bundna antigenerna d ä r a v, och/eller antikropparna är av olika typ, varvid varje typ förmår reagera med en och endast en av minst två typer av de antikroppar och/eller antigener som skall detekteras.

4. Metod enligt något eller några av föregående patentkrav, k ä n n e t e c k n a d d ä r a v, att antigener och/eller antikroppar av samma eller olika typ två motstående ytor hos två fasta immunosorbenter, varvid cellsuspensionen anbringas mellan är bundna till de båda immunosorbenterna.

5. Metod enligt något eller några av föregående patentkrav, k ä n n e t e c k n a d d ä r a v, att som indikatorsystem användes antikroppar märkta med alkalisk oxidas och motsvarande kromogena substrat. fosfatas respektive horseradish

6. Metod enligt patentkrav 5, k ä n n e t e c k n a d d ä r a v, att sagda kromogena substrat utgörs av 5-brom-4-klor-3- indolylfosfat-toluidinsalt och p-nitroblå-tetrazoliumklorid (BCIP/NBT) respektive 3-amino-9-etyl-karbazol (AEC).

7. Metod enligt något eller några av föregående patentkrav, 465 943 /1/ k ä n n e t e c k n a d d ä r a v, att de antikroppar som skall detekteras utgörs av antigeniskt distinkta typer av Ig-antikroppar.

8. Metod enligt något eller några av föregående patentkrav, k ä n n e t e c k n a d d ä r a v, att de antikroppar och/eller antigener som skall detekteras utgörs av produkter av eukaryotiskt, bakteriellt, viralt eller parasitärt ursprung.