SE460519B - System foer att reducera den verksamma populatione n av en blodbestaandsdel i blod med ett fotoaktivt kemiskt aemne - Google Patents

Description

460 519 2 cyter ur blodet. Det är sålunda t.ex. känt att mata blodet genom en kontinuerlig centrifug, i vilken man försöker att selektivt avlägsna lymfocyter för att reducera populationen av de senare i det därigenom behandlade blodet. I allmänhet har emellertid denna teknik varit ineffektiv dels på grund av att densitetsskillnader- na mellan blodfraktionerna innehållande de oönskade lymfocyterna och fraktioner innehållande önskade blodkomponenter är otillräck- liga för att säkerställa att en hög andel av de förra avlägsnas medan höga andelar av de senare hålls kvar.

Det är också väl känt att behandla sjukdomar, såsom leukemi, med elektromagnetisk högenergistrålning inkluderande området för rönt- genstrålning. Även om sådan behandling ofta inriktas på inre kropps- organ, i vilka blodcellerna bildas, har det också varit känt att bestrâla blodet med röntgenstrålning utanför kroppen (blodet har först tagits ut), varigenom strålningen ej riktats direkt mot krop- pen eller inre organ hos densamma. Denna teknik är visserligen ef- fektiv men ej selektiv, genom att den intensivt nedbry;ande ener- gin förutom att förstöra oönskade celler, inaktiverar eller för- stör komponenter i blodet, som är önskvärda att kvarhålla i Vi' talt tillstånd.

Bland farmaceutiska medel som används fbr att behandla överskott av lymfocytpopulationer beroende på leukemi återfinns medel som är aktiva mot själva lymfocyten. Kortison är ett sådant medel men dess verkan är emellertid begränsad eftersom den ej fullständigt undertrycker den abnorma metaboliska aktiviteten hos den sjukdoms- alstrande lymfocyten. Den mekanism, varmed kortison påverkar lym- focytceller, är ej helt klarlagd men man tror att ämnet specifikt binds till kortisonreceptorer i lymfocyten och medbringas av dessa mobila receptorer till cellens kärna, där den förändrar cellens metaboliska aktivitet.

Vissa andra kemiska ämnen är kända eller antas svagt bindas till nukleinsyrorna hos vissa kärnförsedda celler, där de skjuts in ge- nom att bilda molekylära komplex genom kemiska lågenergireaktio- ner eller intermolekylära attraktioner, vilka vanligen är över- gående och otillräckliga för att påtagligt påverka hastigheten för DNA-syntesen i cellen.

Vissa ligerande proteiner kända som antikroppar är också aktiva mot lymfocyter. Växelspelet mellan en antikropp och en specifik lymfocyt kräver att lymfocyten har en plats eller antigen, som är geometriskt och kemiskt receptiv mot en motsvarande aktiv plats på antikroppen. De krafter, som binder en antikropp till en anti- gen, består av attraherande krafter inkluderande vätebindningar, ' opolär bindning, jonsamverkan och van der Waals-krafter, vilkas styrka är omvänt proportionell mot avståndet mellan de samverkan- de grupperna. Sålunda kan strukturella variationer i lymfooytmem- branet med uppgift att förändra antigenens geometri fungera så att antikroppens bindning till antigenen förhindras. När väl en antikropp binds till en antigen på en cell, kan cellen undergâ "antigen modulation“ eller förändrad cellulär differentiering och därigenom bryta antikropparnas bindning på densamma och förstöra antikropparnas affinitet mot densamma. När en lymfocyts membran har en struktur, som blockerar antikroppen från dess antigenplats, kommer antikroppen, även om den fortfarande attraheras till anti- genen, att vara ur stånd att bilda någon bindning av permanent slag. Även om variationer i cellstrukturen mera är regel än undan- tag med maligna celler och "antigenmodulation“ i hög utsträckning, förekommer i antikropp-cellantigenkopplingar, har det ej varit möjligt att effektivt bekämpa leukemiceller med antikroppar.

Användningen av antikroppar för att permanent inaktivera eller ta bort immunogena kemikalier, som kan återfinnas i blodet, såsom oönskade naturliga antikroppar, har också förhindrats av antikrop- pens oförmåga att irreversibelt eller starkt komplexbindas med antigener.

Ovan beskrivna farmakologiska reaktioner kan förstärkas med an- vändning av fotoaktiva kemiska analoger. Fotoaktiva kemiska ämnen är föreningar som innehåller en eller flera grupper, som excite- ras av tillfällig ultraviolett strålning och som i aktiverat till- stånd har en tendens att bilda kovalenta bindningar med angränsan- de kemiska grupper. Reaktiviteten hos olika fotoaktiva ämnen vari- erar från de kemiskt specifika till ämnen med stor reaktivitet mot 460 519 4 praktiskt taget vilken grupp som helst, vilket är fallet med diazo- och azidgrupper. Diazo- och azidgrupperna utgör föredragna fotoaktiva grupper för kemiska ämnen för användning enligt upp-« finningen med fotoaktivitet, som är väsentlig vid förfarandet enligt uppfinningen. Före tillkomsten av föreliggande uppfinning har fotoaktiva kemiska ämnen använts endast i mycket begränsad omfattning. På klinisk nivå har en klass av fotoaktiva förenin- gar, psoralenerna, använts för att behandla patienter som lider av psoriasis. Andra användningsområden för dessa ämnen har be- stått i nästan uteslutande experimentella undersökningar av cel- lens fysiologi och kemi, som rapporterats t.ex. i följande ar- tiklar i Annals of N.Y. Acad, Sci. 346, "Photoaffinity Probes in the Antibody Combining Region", Richards, F.F. och Lifter, J., sid. 78-89 och "Photolabile Antibiotics as Probes of Ribosomal Structure and Function", Cooperman, B.S., sid. 302-323.

Med systemet enligt uppfinningen möjliggörs säker och effektiv reduktion av den verksamma populationen av vissa blodbeståndsie- lar. Närmare bestämt gör uppfinningen det möjligt att reducera den verksamma populationen av vissa kärnförsedda celler och oöns- kade kemiska antigensubstanser, såsom oönskade autoreaktiva an- tikroppar, i blodet hos en mänsklig individ.

Systemet enligt uppfinningen kännetecknas av att det innefattar (a) en kontinuerligt arbetande transportanordning avsedd att transportera blod från en patient genom en blodbehandlingskamma- re och tillbaka till patienten, (b) en tillförselanordning för att tillföra ett fotoaktivt ke- miskt ämne till blodet, som transporteras genom kammaren, vilken kammare omfattar en ledning för passage av blodet, vilken led- ning är konstruerad av-ett material väsentligen transparent för aktiverande UV-strålning och vilken ledning bildar en tunn trans- portväg med en tjocklek av mellan 0,05 och 10 mm genom kammaren för att tillhandahålla en adekvat uppehâllstid för blodet som skall exponeras för UV-strålning, (c) en UV-strålkälla med sina spektralkomponenter väsentligen inom området mellan 3200 och 4000 A med toppintensiteter vid ca 3600 - 3700 Å, varvid nämnda blodbehandlingskammare är avpassad 460 519 5 för att ta emot UV-strålning från nämnda källa och nämnda medel kan vara aktiverat för att bilda fotoaddukter med receptorer på eller i nämnda blodbeståndsdel och (d) en blodseparationsanordning nedströms om blodbehandlingskam- maren för att ta emot helblod från nämnda tnansportanordning och för att återföra en blodfraktion därtill, vilken separationsan- ordning är utformad för att avskilja minst en blodfraktion be- rikad på en beståndsdel, som skulle kunna överbelasta patientens organsystem från blodet som transporteras genom nämnda transport- anordning.

Vid bestrålning induceras det fotoaktiva kemiska ämnet att bil- da en permanent fotoaddukt med dess associerade plats i eller på den kärnförsedda blodcellen eller immunogena kemikalien, var- igenom säkerställes att den addukterade beståndsdelen förstörs.

Det bestrålade blodet återföres sedan till patienten.

När ett fotoaktivt kemiskt ämne med affinitet för nukleinsyran hos den kärnförsedda cellen, såsom lymfocyter, används i samband med uppfinningen, drar nämnda intermolekylära attraherande kraf- ter medlet in i en förbindelse med nukleinkärnorna hos lymfocy- terna. Före aktiveringen har ämnet ringa eller ingen effekt på cellens kemi men vid bestrålning bildar ämnet vissa kovalenta bindningar med nukleinsyrorna i cellen och inhiberar därigenom cellens metaboliska funktion. På detta sätt har cellens proces- ser avbrutits och isynnerhet dess förmåga att delas och resulta- te; blir att cellen går under.

Fotoaktiva kemiska ämnen med affinitet för DNA har vid använd- ning i samband med uppfinningen en mycket önskvärd fördel genom att försvagningen och förstöringen av lymfocyter tenderar att vara selektiv för vissa sjukdomar, såsom leukemi gentemot de cel- ler som man helst önskar reducera, på grund av det faktum att det är sådana celler som undergår den mest intensiva metaboliska 'aktiviteten, varigenom de utgör de celler som utg§r det största föremålet för undanröjande behandling enligt uppfinningen.

Kortison är ett kemiskt ämne som har affinitet för vissa recep- . uzf--rv a »mt-_ ' " ~ 460 519 torer i lymfocetcellen. Som tidigare nämnts har kortison när det gäller att reducera den verksamma lymfocytpopulationen hos patienter lidande av leukemi inte varit helt tillfredsställande.; Enligt föreliggande uppfinning kan emellertid kortison användas för att behandla leukemi på ett nytt och vida effektivare sätt.

Innan det används i samband med uppfinningen måste kortison först göras fotoaktivt. Fackmannen på området inser att fotoaktiverin- gen av kortison kan uppnås med användning av etablerad kemisk teknik. Detaljerna i denna kemi bedöms ej ligga inom föreliggan- de uppfinnings ram, som är begränsad till ett system, varigenom vissa kemiska ämmen kan användas för att uppnå tidigare icke upp- nådda reduktioner i den verksamma populationen av vissa blodbe- ßtåfidsdslar, Fackmannen på området inser också att med använd- ning av etablerad kemisk teknik inkluderande vid behov sådan för skydd av bindningsplatsen, kan kortison infuseras med en foto- aktiv grupp i flera positioner och att de substituerade kortiso- nerna kan utvärderas och den homolog, som bibehåller den största procentandelen av kortisonets normala biologiska aktivitet lätt bestämmas._Kemin vid ovan beskrivna fotoaktivering och bestäm- ning av den mest aktiva homologen är noggrant diskuterad i föl- jande artiklar: 1. Katzenellenbogen, J.A., H.N. Myers och H.J. Johnson, Jr., 1973, J. Org. Chem. 38: 3525-33. 2. Katzenellenbogen, J.A., H.J. Johnson, Jr. och H.N. Myers, 1973, Biochemistry 12: 4085-92, 3. Katzenellenbogen, J.A., H.J. Johnson, Jr., H.N. Myers, 1974, Biochemistry 13: 2896-94.

K.E. Carlson och Såsom framgår av dessa artiklar har fotoaktiveringen av steroi- der uppnåtts med stor framgång genom att substituera de fotoak- tiva grupperna kända som diazo- och azidgrupper. Dessa grupper har var för sig en hög grad av inbyggd fotoaktivitet och denna aktivitet bibehålles när de får ingå i ett annat kemiskt ämne, > som därigenom blir fotoaktivt.

Med användning av känd fotoderivatiseringsteknik kan 16-di-azo- kortison, som utgör den föredragna substansen för användning en- 460 519 ligt uppfinningen för att kvarnålla en hög grad av dess ur- sprungliga farmakologiska aktivitet, syntetiseras i högt utbyte genom att först nitrosera kortison till 16-oximokortison, som kan överföras till 16-diazokortison genom kloraminoxidattion.

Andra substituerade kortisoner kan tas fram genom nitrering av kortison med salpetersyra i isättika. Produkterna från detta nitreringssteg är flera azidderivat, som lätt kan separeras me- delst kolonnkromatografi. De använda reaktionsparametrarna för att tillverka dessa produkter återfinns i detalj i nämnda artikel av Katzenellenbogen i J. Org. Chem. 38: 3525-33.

Fotoderivatiserad kortison med ovan angivna föredragna struktur eller en av andra möjliga, mindre föredragna homologer tränger vid tillsats till blodet lätt in i lymfocyterna eller andra kärn- försedda celler och associerar sig med kortisonreceptorplatser- na i dessa celler. Efter ett lämpligt intervall, framräknat för att göra det möjligt för en hög procentandel av det substituera- de kortisonet att nå fram till dessa receptorplatser, vanligen mellan 1 minut och 2 timmar och företrädesvis mellan 5-15 minu- ter, kommer det blod som innehåller en dos av upplöst fotoaktive- rat kortison som närmar sig det som konventionellt används vid cancerbehandling, vanligen mellan ca 1 nanogram och 100 mikro- gram per ml blod, att bestrålas med UV-strålning. Genom bestrâl- ningen av blodet aktiveras de fotoaktiva grupperna på kortisonmo- lekylerna in situ vid kortisonreceptorplatserna och leder till bildning av fotoaddukter mellan det substituerade kortisonet och kortisonreceptorn och följden blir att receptorns förmåga att överföra kortison vitalt till den fortsatta metaboliska aktivi- teten hos cellen förstörs. Pâ detta sätt har en mycket stor an- del av kortisonreceptorerna 1 lymfocyterna inaktiverats, celler- na kommer mycket snabbt att bli ur stånd att fungera och isynner- het att dela sig och det sker en snabb nedbrytning av dem.

Antikroppar specifika mot speciella blodbeståndsdelar kan alst- ras men som ovan nämnts har det ej varit möjligt att använda dem med goda resultat för att reducera populationen av maligna cel- ler i blodet på grund av variationerna i strukturen som är gemen- samma med maligna celler och cellfenomen, såsom antigenmodula- 460 519 tion, som gör det möjligt för celler att befria sig från komp- lexbundna antikroppar. Sålunda kan t.ex. antikroppar som är spe- cifika för en särskild typ av malign T-lymfocyt, vara ur stånd att komplexbildas med en stor andel celler av nämnda typ i blo- det oavsett om antikropparna har affinitet mot dessa celler, och en avsevärd andel lymfocyter som komplexbundits av antikroppar- na sprider ut sina bundna antigener, varigenom antikropparnas grepp om dem-bryts. Enligt föreliggande uppfinning kan emeller- tid fotoaktiverade antikroppar användas för att reducera den verksamma lymfocytpopulationen till en tidigare icke uppnâelig grad. Dessutom kan med användning av systemet enligt uppfinningen fotoaktiverade antikroppar, som är specifikt reaktiva mot andra blodbeståndsdelar, såsom oönskade antikroppar, också användas för att reducera populationen av dessa beståndsdelar i blodet med samma goda verkan.

De metoder, varmed en antikropp specifik för en speciell cell eller immunogen kemikalie framställes och renas, är väl kända inom området och behöver ej beskrivas här och det må vara till- räckligt att säga att stora mängder mycket specifika monoklona antikroppar kan framställas genom Hybridoma eller andra etable- rade tekniker.

Den kemiska teknik, varmed en antikropp som används enligt upp- finningen kan göras fotoaktiv, utgör också väl känd teknik för~-J fackmannen. Det är också uppenbart för fackmannen att praktiskt taget alla antikroppar har ett antal platser lämpliga för foto- aktiv derivatisering. metoder, varmed kroppar som är främmande för en antikropp kan adderas därtill utan att skada antikroppens förmåga att komplexbildas med dess specifika antigener har t.ex. beskrivits i the Handbook of Experimental Immunology, Weir, D.M., pub. J.ß.1.ipp'1ncott, 1978, sia. 1s.1-1s.3o. För befrämjande av syftet med uppfinningen är det viktigt att derivatiseringen ej förstör det kombinerande området hos antikroppen, som är speci- fikt för målcellen. Härvid bör nämnas att med hänsyn till antalet »àategtiella platser tillgängliga för derivatisering på de fles- ta antikroppar och de många olika tekniker, varmed de kan infu- ceras med en fotoaktiv grupp, såsom de föredragna diazo- och 460 519 9 azidgrupperna, blir det knappast nödvändigt att företa försik- tighetsåtgärden att specifikt skydda det kombinerande området.

När det emellertid är uppenbart att det kombinerande området på en antikropp på annat sätt skulle kunna förstöras genom foto- derivatiseringen av denna antikropp, kan man emellertid tilläm- pa etablerad teknik för att skydda kombinationsplatser och ef- terföljande avlägsnande ur skyddsgruppen.

När fotoaktiverade antikroppar specifikt reaktiva för vissa blodbeståndsdelar, som t.ex. enligt en föredragen utföringsform av uppfinningen kan vara de maligna T-lymfocyterna hos en pati- ent, sättes till den patientens blod vid tillämpning av systemet enligt uppfinningen, komrfl; de mycket snabbt att komplexbindas med T-lymfocyter, för vilka det föreligger den nödvändiga mot- svarigheten till antikroppkombinerande område och cellens an- tigenplats. På grund av felaktigheter i sina egna kombinerande områden eller i målcellernas receptorer kan emellertid många antikroppar trots att de attraheras till mållymfocyterna, vara ur stånd att bilda ett verkligt antikropp-antigenkomplex. Vid bestrålning med UV-strålning vid en våglängd i stånd att aktive- ra den specifika fotoaktiva gruppen, som infuserats i antikrop- parna, kommer de fotoaktiva grupperna på antikropparna som har komplexbundits att företrädesvis bilda fotoaddukter med de komp- lexbundna cellerna och därigenom permanent binda dem till deras komplexbundna antikropp och därmed mäjligheten till antigen mo- dulering elimineras, vilket skulle kunna möjliggöra att komplex- et kan brytas. Andra antikroppar, som man tidigare misslyckats med att komplexbinda med någon av målcellerna, till vilka de attraherades på grund av otillräcklig motsvarighet i respektive bindningsområden, kommer vid fotoaktivering företrädesvis att bilda fotoaddukter med dessa celler och därmed skapa ett foto- adduktkomplex av tidigare ej existerande slag. På det beskrivna sättet kan doser av fotoaktiverad antikropp som närmar sig de, som konventionellt används vid behandling av sjukdomar, dvs i storleksordningen från ca 1 nanogram till 100 mikrogram per ml blod, tillföras med terapeutisk verkan.

Ovan beskrivna fotoinducerade antikropp-antigenkomplexbildning 4-60 519 w förstärks genom infusionen av multipla fotoaktiva grupper i an- tikroppstrukturen, ty närvaron av flera fotoaktiva grupper på antikroppen ökar sannolikheten för att en enkel antikropp skall förmå komplexbildas med mer än en mâlcell. När sådana antikrop- par används enligt uppfinningen, har de en förbättrad benägenhet att bilda nätverk eller kedjor av komplexbundna celler, som kan avlägsnas ur blodet med speciell utrustning.

Det ligger också inom uppfinningens ram att antikroppar som är specifika mot särskilda oönskade naturliga antikroppar eller and- ra immunogena kemiska ämnen kan göras fotoaktiva och användas enligt uppfinningen för att bilda komplex, som starkt binder des- .sa kemikalier och underlättar deras avlägsnande ur kroppen med betydligt större effektivitet än vad som tidigare varit möjligt.

Enligt uppfinningen kan, oavsett den typ av fotoaktivt kemiskt ämne som används, blod som tagits ut ur en patient för behand- ling hanteras satsvis men företrädesvis formas till ett extra- korporealt flöde och matas genom en behandlingsstation, där be- strålningen utföres. En sådan behandlingsstation kan ha formen av en långsträckt, tillplattad rörformad kanal, vars väggar är i huvudsak transparenta för det infallande ultravioletta ljuset (UV), som används för att aktivera det fotoaktiva kemiska ämnet.

Representativa bestrålningsdoser ligger mellan ca 0,1 - 100 joule per cm2 och företrädesvis mellan ca 5-60 joule per gmz blodyta oavsett om metoden tillämpas på kontinuerlig eller dis- kontinuerlig basis och representativa värden på flödeshastighe- ten genom bestrålningsstationen kan ligga inom omrâdet ca 10-75 Iml/min.

Efter behandlingen kan hela satsen eller det bestrâlade flödet av uttaget blod âterföras till patienten. Beroende på vilket fotoaktivt kemiskt ämne som används vid behandlingen av blodet kan det emellertid vara att föredra att filtrera eller centrifu- gera det behandlade blodet innan det återföres till patienten.

De fall, då en sådan behandling skall bedömas vara lämplig, ut- reds närmare i efterföljande detaljerade beskrivning av uppfin- ningen. . 460 519 11 Uppfinningen är schematiskt illustrerad med exempel i bifogade ritningsfigurer, av vilka , fig. 1 visar ett schematiskt flödesdiagram illustrerande en fö- redragen utföringsform av ett system fungerande i enlighet med uppfinningen, fig. 2 schematiskt från sidan visar bestrålningsstationen i sys- temet enligt fig. 1, fig. 3 schematiskt visar en översiktsbild av en utföringsform av bestrålningsstationen enligt fig. 2 och 1 fig. 4 och 5 visar tvärsektionerna utmed linjerna 4-4 respektive 5-S i fig. 3 och illustrerar konfiguratàmmuna för flödespassage in i och ut ur anordningen i fig. 3.

Fig. 1 visar schematiskt ett system 10 för tillämpning enligt uppfinningen. Förutom bestrålningskällan utgör övriga komponen- ter i systemet 10 i och för sig konventionella och kända delar och det finns därför ingen anledning att närmare gå in i detalj på dessa.

Såsom framgår av figuren kan blod tas ut ur patienten som vid 12.

Vanligen tas blodet ut via en nål, som t.ex. kan föras in vid den högra antekubitala venen. I figuren 1 antas att behandlingen av blodet enligt uppfinningen utföres kontinuerligt, dvs för un- derlättande av efterföljande diskussion kan flödet betraktas som kontinuerligt från uttaget vid 12 till det slutliga âterförandct av blodet till patienten vid 14. Detta återförande 14 utföre» van-k ligen via en recipientnål placerad i vänstra antekubitala venen.

När flödet är kontinuerligt på detta sätt, ligger ett typiskt blodflöde tillämpbart på uppfinningen inom området ca 10-75 ml/min. företrädesvis inom området ca 40-50 ml/min. De angivna flödeshas- tigheterna åstadkoms med hjälp av en pump 16 placerad i det ext- rakorporeala blodflödet indikerat vid 18 och kan utgöras av en eller flera typer av pumpar som används för blodpumpning inklu- sive sådana pumpar som finns tillgängliga från Haemonetics Corp. under modellbeteckningen 30.

Antikoaguleringsmedel injiceras såsom är känt inom medicinen fö- reträdesvis i det extrakorporeala blodflödet vid 20, dvs nära 460 51-9 ”y _12 punkten för bloduttaget. Sådana antikoaguleringsmedel kan utgö- ras av lösningar av vätecitratdextros och/eller heparin eller andra kända kompositioner användbara för detta ändamål.

En innesluten vensensor 22 återfinns företrädesvis i flödet 18 för inom tekniken känt ändamål. En sådan sensor består i princip av en reservoar eller buffertvolym, vars syfte är att förhindra eller inhibera uppkomst eller fortsatt existens av bubblor i blodflödet.

Enligt en föredragen tillämpningsmetod av uppfinningen sättes det fotoaktiva kemiska ämnet företrädesvis till blodet hos den mänskliga individen externt och kan sålunda, såsom är visat i systemet 10 i fig. 1, tillföras blodflödet nedströms om pumpen 16 och strax uppströms om den plats där blodet kommer in i be- strålningsstationen 24. ' 1 Bland föredragna fotoaktiva kemiska ämnen för användning i sam- band med uppfinningen återfinns fotoaktiverad kortison, fotoak- tiverade-antikroppar som är specifikt reaktiva mot maligna lym- qfocyter och fotoaktiverade antikroppar specifikt reaktiva mot en patients oönskade antikroppar. Även andra fotoaktiva kemiska 'ämnen är användbara i samband med uppfinningen. Den grundläggan- , de teknik, som används vid tillförandet av de fotoaktiva kemis- ka ämnena, är.att lösa desamma i en isoton lösning, som därefter direkt injiceras i blodflödet; som vid 26. Ämnena injiceras i en takt som är anpassad till blodflödet så att man uppnår en kon- centration i blodet som når fram till bestrålningsstationen 24 inom ett önskat område, som är specifikt för varje kemiskt ämne.- Det huvudsakliga syftet med de hittills beskrivna delstegen är att uppnå den önskade lösta koncentrationen av det fotoaktiva' kemiska ämnet innan blodet införes i bestrålningsstationen. En- ligt en annan aspekt av uppfinningen behöver det fotoaktiva äm- net nödvändigtvis ej direkt införas genom injicering i det ext- rakørpoieaia blodflödet 18 strömmande 1 fig. 1. Istället är det också acceptabelt att uppnå den önskade koncentrationen av fo- toaktivt ämne genom direkt på patienten. Alternativa metoder för administrering av 460 519 13 andra fotoaktiva kemiska ämnen inom ramen för uppfinningen och lämpliga doser därför är uppenbara för fackmannen.

Det är emellertid enligt uppfinningen att föredra att tillföra de fotoaktiva kemiska ämnena till det extrakorporeala flödet (eller till en extrakorporeal volym av en blodsats) i syfte att uppnå mera exakta koncentrationsnivåer och vidare för att undvi- ka eller minimera eventuella bieffekter och liknande, so kan inträffa genom administrering av någon medicin direkt till kropps- systemet.

Vid bestrålningsstationen 24 bestående av en bestrålningskammare 28 och strålkälla 30 utsättes blodet, som nu i lösning innehåller den önskade koncentrationen fotoaktivt kemiskt ämne, för ultravio- lett bestrålning (UV) och företrädesvis utföres UV-bestrålning med huvudparten av de spektrala komponenterna inom det föredragna området för aktivering av det specifika fotoaktiva ämne, som an- vändes vid behandlingen. Konstruktionsmaterialen i bestrâlnings- stationen 24 väljs så att de ej blockerar bestrålningen inom den önskade delen av UV-spektrat.

I fig. 2 visas en vertikalprojektion av en bestrålningsstation 24 av en typ, som är lämplig för användning i samband med upp- finningen. En sådan station består av en blodbehandlings- eller bestrålningskammare 28 med ett intag 31 och ett uttag 32 möjlig- görande blodflöde genom kammaren och på avstånd därifrån en käl- la 30 för UV-bestrålning. Kammaren 28 kan anta olika former, varvid det främsta kravet på densamma är att väggen 34 mot strål- ningskällan 30 i huvudsak är transparent för infallande UV-strål- ning. Kammaren (eller åtminstone väggen 34) kan därför bestå av olika, i huvudsak UV-transparenta plaster, som vanligen används vid rörkonstruktion för administrering av standardiserade intra- venösa lösningar, såsom polyvinylklorid och liknande.

Enligt en föredragen utföringsform av bestrålningskammaren 28, som är lätt anpassad för användning vid såväl kontinuerlig som satsvis tillämpning av uppfinningen, utgöres anordningen av ett enkelt hölje, som bestrålas ovanifrån och underifrån. Enligt den- na utföringsform strömmar sålunda blodet som skall behandlas ge- 460 519 1,, nom bestrålningskammaren 28 i det centrala utrymmet 36, som har huvudsakligen tunn rektangulär tvärsektion. Kammarens 28 ytarea är anpassad efter bestrålningskällorna för att ge det inneslut- na blodet den önskade stråldosen. Enligt en alternativ utförings- form har blodbehandlingskammaren 28 en konfiguration såsom är visat i fig. 3, 4 och 5. I detta fall är en rörslinga 38, som i tvärsektionen (fig. 5) är tillplattad till en mycket långsträckt ellips, fast monterad i eller på en bärplatta 40. Blodintaget 30 till slingan har cirkulär tvärsektion och befinner sig, för att använda samma benämningar som i fig. 1, vid en punkt nedströms om pump 16. Intaget för det fotoaktiva kemiska ämnet är schema- tiskt angivet vid 26. Den mycket tillplattade tvärsektionen på slingan möjliggör ett stabilt flöde för blodet genom slingan men, vilket är ännu viktigare, möjliggör en god exponerir; för det strömmande blodet för den infallande UV-strålningen. Uttaget 32 har åter en cirkulär tvärsektion.

Oavsett utformningen på kammaren 28 föredras att kammaren är så tunn som är praktiskt möjligt. Kamrar med en tjocklek av ca 0,05- 10 mm ligger inom ramen för uppfinningen, varvid kammartjockle- kar inom området ca 0,05 - 1 mm föredras. A UV-källan 30 kan bestå av en eller flera vid varandra eller på annat sätt anordnade UV-ljuskällor 41, vilka var och en kan vara försedd med en reflektor 42. UV-källorna kan utgöras av kommer- siellt tillgängliga lampor, av vilka en mångfald är kända inom tekniken.

Som exempel kan källan 30 bestå av en enda 1000 watt Hg-lampa av den typ som är tillgänglig från Oriel Corporation i Stamford, Connecticut, USA, under modellbeteckningen 6287. Vid användning med lämpliga filter ger denna ljuskälla ett gott, relativt kon- tinuerligt spektrum med hög intensitet på strålningen mellan 3200 och 4000 A med en emissionstopp vid ca 3650 A, vilket före- dras när psoralen är det fotoaktiva ämnet som används vid förfa- randet. Denna lampa med en lämplig reflektor kan placeras ca 5-30 cm från kammaren 28. Med de flödeshastigheter som tilläm- pas enligt en aspekt av uppfinningen ger en sådan strålkälla ab- sorberad energi i det strömmande blodet inom det område som är 460 519 15 av intresse för tillämpning av systemet enligt uppfinningen.

Blodflödet från bestrålningsstationen 24 visad i fig. 1 kan via uttaget 32 direkt återföras till patienten vid 14. Eventuellt kan emellertid före âterförandet till.patienten\blodet värme- växlas för reglering av temperaturen till patientens cirkuleran- de blod. En värmeväxling är under alla omständigheter nödvändig, när det behandlade-blodet genom behandlingen har uppnått en tem- peratur, som avsevärt avviker från patientens.

När uppfinningen tillämpats för att nedbringa den verksamma lym- focytpopulationen i blodet med användning av antingen ett DNA- aktivt ämne eller en fotoaktiverad kortison, kommer de behandla- de lymfocyterna vid återförandet till patienten som en följd av behandlingen att snabbt brytas ned och förstöras av de normala processer, som försiggår i patienten. Närmare bestämt kommer ge- nom behandlingen enligt nämnda utföringsform av uppfinningen de metaboliska funktionerna hos de behandlade lymfocyterna att för- sämras i sådan omfattning att med passande doser av fotoaktivt ämne och UV-bestrålning en avsevärd andel av de behandlade cel- lerna förstörs successivt under en period av dagar. En fördel med detta är, att det då blir möjligt att behandla i huvudsak hela blodmängden hos en patient vid en enda behandling utan att för- orsaka katastrofal överbelastning av kroppens blodreningssystem, vilket annars skulle bli fallet om hela populationen av behand- lade lymfocyter togs ut för behandling samtidigt.

När fotoaktiverade antikroppar, som är specifika för en malign lymfocyt, används vid de föredragna utföringsformerna av upp- finningen, kommer det blod, som återföres till patienten att ha lymfocyterna (eller alternativt en oönskad antikropp) komplex- bunden av den aktiverade antikroppen och på så sätt förhindrad från att avlägsnas ur blodflödet. Eftersom emellertid de foto- aktiverade antikroppskomplexen bildade enligt denna utförings- form av uppfinningen i huvudsak helt bildas innan blodet exci- teras av bestrålningsstationen 24, måste blodet antingen doseras med relativt små mängder aktiverad antikropp för att inte chocka eller överbelasta patientens biologiska blodfiltreringssystem 16 460 519 eller måste det behandlade blodet filtreras eller centrifugeras innan det återförs till patienten. _ Oavsett vilket fotoaktiverat ämne som används vid uppfinningen eller med vilken mängd det administreras, kan belastningen på kroppens organsystem ytterligare minskas genom att i samband med föreliggande system använda en kontinuerlig centrifug 44 (eller annat filtreringssystem), vilken anordning har flera funktioner.

Det bör påpekas att kontinuerliga centrifuger av den här använ- da typen sedan länge används i blodflödesbehandlingssystem kom- mersiellt tillgängliga från flera tillverkade inkluderande Haemonetics Corporation of Braintree, Massachusetts och IBM Corporation, Medical Products Division, Monsey, New York, USA.

I de kända systemen, i vilka sådana anordningar har använts, finns samtliga element i fig. 1 närvarande med det enda viktiga undantaget för bestrálningsstationen 24. Den kontinuerliga cent- rifugens funktion i sådana kända system har varit att separera överskottslymfocyter eller andra blodbeståndsdelar av intresse.

När detta tillämpades var det en nackdel med ett sådant system att det var ineffektivt, dvs centrifugeringsprocessen kunde som bäst ta bort ca 40-50% av lymfocyterna, och tyvärr avlägsnades också komponenter, som man i själva verket önskade ha kvar.

I systemet 10 enligt uppfinningen kanrtvå funktioner utföras av den kontinuerliga centrifugen 44. En av dessa är att avlägsna lymfocyter eller andra komplexbundna blodbeståndsdelar såsom ovan nämnts. Eftersom uppfinningen i sina kortisonbehandlings- utföringsformer i första hand bygger på en reduktion av funktio- nen hos lymfocyterna till att slutgiltigt reducera den verksamma populationen av densamma, behöver man ej lita till centrifugen 44 i samma utsträckning som fallet varit i förut kända samman- hang. Ur mekanisk synpunkt innebär detta att man ej behöver ar- beta så nära gränslinjen för den specifika vikten mellan lymfo- cetfraktionen i blodet och de önskade fraktionerna i blodet, som man försöker kvarhålla. Man kan sålunda undvika oönskad separe- ring av de önskat kvarhållnafraktionerna i hela blodet. 460 519 17 Vid de utföringsformer av uppfinningen där fotoaktiverade anti- kroppar används kommer bildade antikroppskomplex att lätt se- pareras från de övriga önskade blodfraktionerna antingen genom filtrering eller i den angivna centrifuganordningen 44.

Den kontinuerliga centrifugen 44 kan vidare användas för ytter- ligare viktiga ändamål. Isynnerhet kan en del eller praktiskt taget hela blodplasman tas ut vid 46 och ersättas med färsk plasma vid 48. Denna tvätteknik gör det möjligt att effektivt avlägsna överskottet av fotoaktivt kemiskt ämne som kan finnas närvarande i blodplasman och ersätta plasman vid 46 med isoton vätska fri från nämnda ämne. När sålunda blodet återföres till patienten vid 14, är det i huvudsak fritt från varje överskott av kemiskt ämne, dvs andra än sådana, som kombinerats med den behandlade blodbeståndsdelen på beskrivet sätt.

Det bör också på nytt understrykas att även om den tekniken att tillämpa uppfinningen såsom är illustrerat i fig. 1 innebär ett kontinuerligt förlopp, kan blodbehandlingen enligt uppfinningen utföras genom satsvis teknik. Sålunda kan t.ex. en viss bestämd kvantitet blod från början tas ut ur patienten. Denna kvantitet eller sats kan redan innehålla de önskade kvantiteterna löst fo- toaktivt kemiskt ämne, t.ex. genom föregående administrering på patienten, eller kan ämnet blandas externt med det uttagna blo- det. Blodsatsen innehållande det önskade ämnet kan sedan över- föras till en bestrålningsstation, där den önskade kvantiteten UV-energi får infalla mot blodet. Under denna process kan blod- satsen strömma genom stationen på ovan beskrivet sätt eller, om kvantiteten blod är lämplig och blodbehandlingskammaren 28 av lämpliga dimensioner, kan satsen behandlas under statiska betin- gelser tills den önskade energin tagits upp. Därefter tas det behandlade blodet ut ur bestrålningsstationen och centrifugeras antingen på ovan beskrivet sätt eller återföres direkt till pa- tienten.

Nedan angivna kemiska ämnen vet man samverkar med intakta cel- ler efter exponering för UV och synligt ljus. Dessa medel kan också användas i systemet enligt uppfinningen. 460 519 18 1. Eridinium och akridiner (Yielding, K.L.,och Yielding, L.W.: Photoaffinity labelling of DNA. Annals of N.Y. Acad. Sci. 346: 368-378, 1989) - även adriamycin, daunomycin och rubidazon. 2. Sulfonamider, sulfonylkarbamider, fenotiaziner, tetracykli- ner, stenkolstjäraderivat, antracen, pyridin, fenantren (Kornhauser, Al; Molecular aspects of phototoxicity, Annals of N.Y. Acad. Sci. 346: 398-414, 1980). 3. Specifikt reaktiva antikroppar (Richard, F.F. och Lifter, J.: Photoaffinity probes in the antibody combining region, Annals of N.Y. Acad. Sci. 346: 78-89, 1980).

Efterföljande exempel avser att illustrera tillämpningen av sys- temet enligt uppfinningen för âstadkommande av en terapeutisk reduktion i den verksamma populationen av en blodbeståndsdel i blodet hos en patient. 500 cm3 blod togs ut ur en patient som led av akut leukemi. Det- ta blod hölls i en blodpåse och ledningar drogs från blodpåsen till blodbehandlingssystemet och därifrån tillbaka till blod- påsen.

Vid detta experiment bestod det använda systemet av en pump och en multi-pass UVA-exponeringsstation med en exponeringskammare uppvisande en tjocklek av 1,0 mm och en total ytarea av 0,312 m2.

Exponeringskammaren bestrålades ovanifrån och underifrån med ult- raviolett A ljuskällor som gav strålning med huvudparten av de spektrala komponenterna inom området 3200 - 400' Å med toppvär- den på intensiteten vid ca 3600 - 3700 Å. Mängden strålning, som inföll mot exponeringskammarens ytor uppmättes vid ca 28,8 J/ cmz/h.

En mängd DNA-aktivt ämne i blodet som behandlades av 100 nano- gram/ml uppnåddes genom oral administrering av DNA-aktivt ämne på patienten 2 timmar innan mankog ut blodet för detta försök.

Efter uttaget doserades blodprovet med 20 enheter heparinsulfat per ml blod för att förhindra koagulering av blodet i apparatu- fen. 460 519 19 Antalet vita celler i blodprovet före påbörjad undersökning var 500 000/mm3, vilken mängd mycket ogynnsamt låter sig jämföras med en normal mängd av 5000 celler/mm3. En undersökning av cel- lerna avslöjade att praktiskt taget samtliga celler i provet var maligna T-lymfocyter.

Under arbetets gång togs blod ut ur blodsäcken med en hastighet av 40 ml/minut, matades genom bestrålningskammaren och återför- des sedan till blodpåsen. Ett prov togs i returledningen före påbörjad UVA-bestrålning och med 1 timmes intervall därefter, varvid det sista provet togs 3 timmar efter påbörjad bestrål- ning. Proven förvarades i kulturer, varifrån lika stora mängder togs ut för utvärdering den tredje, fjärde, femte och sjätte da- gen efter bestrålningen. ' Varje prov, som togs ut av de tre bestrålade blodproven, testa- des med avseende på totala antalet kärnförsedda blodceller och antalet av celler som fanns kvar i levande tillstånd. Antalet levande kärnförsedda celler som fanns kvar i ett prov bestämdes genom behandling med trypanblått, som absorberas av döda kärn- försedda celler och stöts bort av levande celler.

De i efterföljande tabell angivna värdena är uppställda enligt följande: Spalt I - intervall efter bestrålning tills utvärdering av cell- antalet i provet utfördes (dagar), Spalt II - antalet kärnförsedda celler i provet vid tiden för utvärderingen (x 104).

Spalt III - totala antalet kärnförsedda celler (levande + döda) / antalet kärnförsedda celler vid tidpunkten noll (procent).

Spalt IV - levande kärnförsedda celler/totala antalet kärnför- sedda celler vid tidpunkten noll (procent). 20 Behandling av 500 ml blodsystem I II III IV Kontroll 6 94 94 36 (obestrålat) taget 3 33 46 35 1 timma efter 4 35 49 28 WA' 5 21 29 14 bestrålning 5 27 37 13 Prov O 125 100 100 taget 3 83 66 48 2 timmar efter 4 47 37 21 WA' s 41 32 13 bestrålning 5 13 10 2 Prov 0 137 100 97 taget 3 70 51 29 3 timmar efter 4 43 31 12 UVA- s 12 16 2 bestrålning 6 9 7 1 Av tabellen framgår att man genom tillämpning av uppfinningen åstadkomit en snabb nedbrytning av överskottet av lymfocytpo- pulationen i det behandlade blodet utan synliga, kliniskt menli- ga effekter på övriga blodbeståndsdelar. Analysen visade att in- om 6 dagar efter behandlingen hade populationen av levande lym- focytceller i varje blodprov avsevärt reducerats. Inom 6 dagar efter exponeringen i den beskrivna apparaturen för perioder om 1, 2 och 3 timmar hade den procentuella andelen levande lymfo- cyter som fanns kvar i det behandlade blodet reducerats till 13, 2 respektive 1 procent av de ursprungliga värdena. Som jäm- fjrelse innehöll ett kontrollprov, som ej exponerats med UVA, 86% av lymfocytpopulationen levande efter samma tid. 460 519 h? -A Uppfinningen har beskrivits i anslutning till specifika utfö- ringsformer men det är uppenbart att man kan företa flera varia- tioner av uppfinningen utan att gâ utanför uppfinningens ram.

Uppfinningen skall sålunda betraktas som bred och begränsas en- bart av den ram som uppställs i efterföljande patentkrav.

Claims (4)

10 15 20 25 30 35 460 519 ' ' a -zm PäCGIIILKIäV l. System för att reducera den verksamma populationen av en blodbeståndsdel i blod med ett fotoaktivt kemiskt ämne. valt bland fotoaktiva kemiska ämnen av den typ. som är i stånd att undergå intermolekylär eller kemisk association med l. steroídreceptorplatserna hos kärnförsedda blodceller.

2. antigenplatserna hos kärnförsedda blodceller eller

3. antigenplatserna hos immunogena kemikalier k ä n n e t e c k n a t av att det innefattar (a) en kontinuerligt arbetande transportanordning avsedd att transportera blod frän en patient genom en blodbehandlingskam- mare och tillbaka till patienten, . (b) en tillförselanordning för att tillföra ett fotoaktivt kemiskt ämne till blodet. som transporteras genom kammaren, vilken kammare omfattar en ledning för passage av blodet. vilken ledning är konstruerad av ett material väsentligen transparent för aktiverande UV-strålning och vilken ledning bildar en tunn transportväg med en tjocklek av mellan 0.05 och 10 mm genom kammaren för att tillhandahålla en adekvat uppe- hållstid för blodet som skall exponeras för UV-strålning. (c) en UV-strålkälla med sina spektralkomponenter väsentligen inom omrâdet mellan 3200 och 4000 Å med toppintensíteter vid ca 3600 - 3700 Å, varvid nämnda blodbehandlingskammare är avpassad för att ta emot UV-strålning från nämnda källa och nämnda medel kan vara aktiverat för att bilda fotoaddukter med receptorer på eller i nämnda blodbeståndsdel. (d) en blodseparationsanordning nedströms om blodbehandlings- och kammaren för att ta emot helblod från nämnda transportanordning och för att återföra en blodfraktion därtill. vilken separa- tionsanordning är utformad för att avskilja minst en blodfrak- tion berikad på en beståndsdel. som skulle kunna överbelasta patientens organsystem från blodet som transporteras genom nämnda transportanordning. k ä n n e t e c k n a t av att blod-

2. System enligt krav 1. behandlingskammaren har en tjocklek av mellan 0.05 och 1.0 mm. 23 460 519

3. System enligt krav l eller 2. k ä n n e t e c k n a t av att det dessutom innehåller en.värmeväxlaranordning avsedd att ställa in temperaturen på det behandlade blodet på samma temperatur som det cirkulerande blodet i patientens kropp. innan det återföres till patienten.

4. System enligt något av krav 1 _ 3. k ä n n e t e c k n a t av att det innefattar en centrifuq för att separera ut delar av nämnda blod.