SE452199B

SE452199B - PROCEDURE FOR IMMUNE ELECTROPHORETIC INVESTIGATION

Info

Publication number: SE452199B
Application number: SE7811720A
Authority: SE
Inventors: Olof Vesterberg
Original assignee: Olof Vesterberg
Priority date: 1978-11-13
Filing date: 1978-11-13
Publication date: 1987-11-16
Also published as: SE7811720L; DE2944127A1

Description

10 15 20 25 30 35 452 199 _ 2 _ _ _ lika förfaranden är att en stor andel av de reaktiva ämnena som finnes i gelen ej kommer till användning. En annan nack- del är att man ej därmed och i kombination med t.ex. protein- färgningsmetoder kan mäta mycket låga halter av proteiner. 10 15 20 25 30 35 452 199 _ 2 _ _ _ Equal processes are that a large proportion of the reactive substances contained in the gel will not be used. Another neck- part is that you do not thereby and in combination with e.g. protein- Staining methods can measure very low levels of proteins.

Endast under mycket gynnsamma förhållanden är det möjligt att mäta en proteinkoncentration på ca 5 mg per liter. Käns- ligheten är följaktligen god. Det föreligger emellertid ofta behov av att mäta mycket lägre halter av proteiner än de ovan nämnda.Only under very favorable conditions is it possible to measure a protein concentration of about 5 mg per liter. Emotional the similarity is consequently good. However, it is often present need to measure much lower levels of proteins than those above mentioned.

En ytterligare nackdel med användningen av en på en platta horisontellt placerad gel är svårigheten att i brunnar i den- na applicera så stora provvolymer som vore önskvärt för att få tillräcklig känslighet. En annan nackdel med den s.k. rakeb elektroforesmetoden är dessutom att den är relativt tidsödande I många fall låter man elektroforesen pågå i 6 till 12 timmar, t.ex. över natten. Detta beror delvis på att kylningen, som erhålles från en under nämnda glasplatta placerad kylare ej är så effektiv som skulle behövas för att möjliggöra sådan ökning av den pålagda elektriska effekten, att den erforder- liga elektroforestiden avsevärt förkortades. Nackdelar med vekarna är bl.a. att de är svåra att hålla rena. Ändamålet med uppfinningen är att åstadkomma ett nytt och för- delaktigt förfarande, vilket medger kvantífiering av lägre koncentrationer av ämnen än som är möjligt med raketmetoden, varvid samtidigt åtgången av mängden dyra reagens, såsom immn- grbuliner, blir mindre per prov, vari koncentration av ämnen skall bestämmas. Det har visat sig, att det nya förfarandet, vilket definieras i kravet l, medger användning av betydligt högre fältstyrkor, vilket medför kortare elektroforestid. Den- na tid kan med det nya förfarandet nedbringas till omkring en sjättedel av den tid, som normalt användes vid raketelektrb- foresen. Detta är mycket värdefullt, t.ex. vid användning inom sjukvården, där kort svarstid ofta är angelägen. Den ökade känsligheten beror bl.a. på att det vid det nya förfa- randet är lätt att applicera provvolymer, som kan vara åt- minstone tio gånger större än de som användes vid raketelekto- lO lö 20 25 30 35 452 199 foresen.An additional disadvantage of using one on a plate horizontally placed gel is the difficulty of in wells in the apply as large sample volumes as would be desirable to get sufficient sensitivity. Another disadvantage of the so-called rakeb the electrophoresis method is also that it is relatively time consuming In many cases the electrophoresis is allowed to last for 6 to 12 hours, for example overnight. This is partly due to the cooling, which is not obtained from a cooler placed under said glass plate is as effective as would be needed to enable such increase in the electrical power applied, that it requires electrophoresis time was significantly shortened. Disadvantages of the wicks are i.a. that they are difficult to keep clean. The object of the invention is to provide a new and improved participatory procedure, which allows quantification of lower concentrations of substances than is possible with the rocket method, while simultaneously consuming the amount of expensive reagents, such as grbulins, becomes smaller per sample, in which concentration of substances to be determined. It has been shown that the new procedure, which is defined in claim 1, allows the use of significantly higher field strengths, resulting in shorter electrophoresis time. The- With the new procedure, the time can be reduced to about one one-sixth of the time normally used for rocket-propelled grenades foresen. This is very valuable, e.g. when used in healthcare, where a short response time is often important. The increased sensitivity is due to that in the new procedure It is easy to apply sample volumes, which may be at least ten times larger than those used in rocket launchers lO Sat. 20 25 30 35 452 199 foresen.

Vid det nya förfarandet användes lämpligen en anordning, som åtminstone delvis är utförd i för synligt hus transpa- rent material, t.ex. glas eller plast, såsom polyeten, poly- styren eller polykarbonat. Den består bl.a. av två elektrod- kärl, i vilka finns elektroder av t.ex. platinatråd, samt av delar, som uppbär och begränsar stödsubstansen, i vilken dei elektroforetiska transporten sker av det ämne, som skall be- stämmas. Stödsubstansen kan vara en gel av agaros eller poly- akrylamid eller av cellulosaacetat och innehåller huvudsak- ligen vatten och däri lösta buffertsubstanser samt ämnen, såsom t.ex. antikroppar, som kan reagera specifikt med de äm- nen, som skall bestämmas, så att precipitat utbildas i stöd- substansen.In the new method a device is suitably used, which is at least partly made in a visible house pure material, e.g. glass or plastic, such as polyethylene, styrene or polycarbonate. It consists of i.a. of two electrodes vessels, in which there are electrodes of e.g. platinum wire, as well as by parts, which support and limit the builder, in which dei electrophoretic transport of the substance to be sued. The excipient may be a gel of agarose or poly- acrylamide or of cellulose acetate and contains mainly water and buffer substances dissolved therein as well as substances, such as e.g. antibodies, which may react specifically with the to be determined so that precipitates are formed in the the substance.

Stödsubstansen kan appliceras eller gjutas (om den utgöres av en gel) mellan tvenne närliggande väggar. I en utförings- form är huvuddelen av stödsubstansen sammanhängande och av- gränsad av tvenne mot varandra vettande väggar och är utrym- mena för prov åtskilda från varandra. Genom att anordna yt- terligare väggar mellan de motstående väggarna vid åtminstone övre delar av stödsubstansen är det möjligt att erhålla rör- formiga utrymmen med exempelvis rund, oval eller rätvinklig tvärsnittyta. Exempelvis kan anordningar iordningställas, var- igenom det erhålles avlånga gelremsor, såsom parallellepipe- diskt formade gelremsor med måtten 3 mm x l,5 mm x 60 mm. Det är även möjligt att använda stödsubstanser med krökning utmai strömriktningen, t.ex. mellan två krökta plastytor. Om plat- torna placeras vertikalt i en apparat och stödsubstansen en- dast når upp till exempelvis halva höjden av plattorna, ut- bildas ovanför stödsubstansen utrymmen, i vilka provlösningar lätt kan påsättas uppifrån genom en kapillärformad pipettqæis Pördelaktígt är även, att vid detta förfarande kommer stöd- substansernas ändstycken i direkt vätskekontakt med elektrod- kärlens buffertlösningar. Det kan även vara fördelaktigt, om de rörformiga utrymmena vidgar sig uppåt, åtminstone i den del där provlösningen är belägen vid början av elektroforesen. lO lå 20 25 30 35 452 199 f- ' 4 Härigenom koncentreras de ämnen, som skall bestämmas, allt- eftersom de vid elektroforesen transporteras nedåt mot stöd- substansen.The builder can be applied or cast (if formed) of a gel) between two adjacent walls. In an embodiment form, the major part of the excipient is coherent and bounded by two facing walls and are spacious mean for samples separated from each other. By arranging surface additional walls between the opposite walls at least upper parts of the builder, it is possible to obtain shaped spaces with, for example, round, oval or rectangular cross-sectional area. For example, devices can be prepared, where through which elongate gel strips are obtained, such as parallel disc-shaped gel strips measuring 3 mm x 1.5 mm x 60 mm. The is also possible to use builders with curvature utmai current direction, e.g. between two curved plastic surfaces. If plat- are placed vertically in an apparatus and the builder only reaches, for example, half the height of the tiles, are formed above the builder spaces, in which sample solutions can be easily applied from above through a capillary-shaped pipette It is also advantageous that this procedure will the end pieces of the substances in direct liquid contact with the electrode the buffer solutions of the vessels. It can also be beneficial, if the tubular spaces widen upwards, at least in that part where the sample solution is located at the beginning of the electrophoresis. lO lay 20 25 30 35 452 199 f- '4 This concentrates the substances to be determined, all since in the case of electrophoresis they are transported downwards towards the the substance.

Genom att använda isotachoforetisk princip eller åtminstone buffertsystem, som är diskontinuerliga med avseende på led- ningsförmåga och/eller pH, är det ävenledes möjligt att erhål- la koncentrering av de ämnen som skall bestämmas efterhand som de transporteras nedåt genom elektroforesen och före det precipitat utbildas.By using isotachophoretic principle or at least buffer systems, which are discontinuous with respect to ability and / or pH, it is also possible to obtain concentration of the substances to be determined retrospectively as they are transported downward through the electrophoresis and before precipitates are formed.

Av de motstående väggar, som begränsar stödsubstansen, är företrädesvis åtminstone en utförd i för synligt ljus trans- parent material, t.ex. glas eller lastß såêoml olystyren, polyetylen, polyvinylklorid elleg9pöl$gs%gâ, go eﬁtföres den lämpligen i ett relativt tunt material med en tjocklek mindre än omkring l millimeter. Anordningen placeras lämpligen så i en elektroforesapparat, att åtminstone de delar av väggarna, som begränsar stödsubstansen och som är belägna vid provut- rymmena, är nedsänkta i den buffertvätska som användes vid elektroforesen. Genom nedsänkning av anordningen i buffert- vätska erhålles vätskekontakt till det ena elektrodkärlet vä den nedre kanten av stödsubstansen och vid den övre kanten üa provlösningarna till bufferten i det andra elektrodkärlet.Of the opposite walls, which limit the builder, are preferably at least one performed in visible light trans- parent material, e.g. glass or loadß såêoml olystyrene, polyethylene, polyvinyl chloride elleg9pöl $ gs% gâ, go e ﬁtföres den preferably in a relatively thin material with a thickness less than about 1 millimeter. The device is suitably placed so in an electrophoresis apparatus, that at least those parts of the walls, which limit the excipient and which are located at the test the spaces, are immersed in the buffer liquid used in electrophoresis. By immersing the device in the buffer liquid, liquid contact is obtained to one of the electrode vessels the lower edge of the builder and at the upper edge üa the sample solutions to the buffer in the second electrode vessel.

Härigenom bortfaller behov av vekar för vätskekontakt mellan stödsubstansen och buffert i respektive elektrodkärl, vilket brukats i tidigare förfaranden.This eliminates the need for wicks for liquid contact between the builder and buffer in each electrode vessel, which used in previous proceedings.

Vid den elektroforetíska processen transporteras således de ämnen, som skall bestämmas, från respektive utrymmen för prov- lösningar in i stödsubstansen. Härvid reagerar det ämne som skall bestämmas med i stödsubstansen före försökets början fördelat annat ämne med hög och specifik affinitet till_det förstnämnda ämnet. Ett sådant reaktionspar kan vara antigen- antikropp, sockerhaltig protein-lektin och receptorspecifika ämnen, såsom vid affinoelektrofores. Härvid uppstår en utfäll- ning eller med andra ord ett precipitat i form av en zon som kan visualíseras genom t.ex. proteinfärgníng, t.ex. enligt lO lö 20 25 30 35 452 199 5 _ Th. Krantz, A. Trautweín och A. Sieber (2. Klin.Chem.Klin.Thus, in the electrophoretic process, they are transported substances to be determined from the respective test solutions into the builder. In this case, the substance reacts as shall be determined in the excipient before the start of the experiment distributed other substance with high and specific affinity to it the former subject. Such a pair of reactions may be antigenic. antibody, sugary protein lectin and receptor specific substances, such as in affino electrophoresis. This results in a precipitation or in other words a precipitate in the form of a zone which can be visualized by e.g. protein staining, e.g. according to lO Sat. 20 25 30 35 452 199 5 _ Th. Krantz, A. Trautweín and A. Sieber (2. Klin.Chem.Klin.

Bíochem. 12 (l974) 124 - 127), eller helt enkelt genom de- naturering. Precipitatet utbildas längre in i stödsubstansen, sett från applikationsstället, ju mer det finns av det ämne som skall bestämmas. Approximativt direkt proportíonalitet råder.Bíochem. 12 (1974) 124 - 127), or simply by de- naturalization. The precipitate is educated further into the builder, seen from the application site, the more there is of that substance to be determined. Approximate direct proportionality advises.

Genom den ringa väggtjockleken på de motstående väggarna och genom den goda vätskekontakten mellan väggar och buffert er- hålles mycket goda förutsättningar för att avleda det vid elektroforesen i stödsubstansen frigjorda Joulska värmet.Through the small wall thickness of the opposite walls and through the good liquid contact between walls and buffer very good conditions are maintained to divert it at the electrophoresis in the support substance released the Joulska heat.

Det värme som nått buffertlösningen kan lätt bortledas med t.ex. en värmeväxlare i form av rör. Genom den förbättrade kylningen och eliminering av vekar är det möjligt att öka den över stödsubstansen pålagda elektriska spänningen, varigenom den erforderliga elektroforestiden kan avkortas väsentligt i jämförelse med tidigare förfaranden, där kylning endast fanns från en sida och där värmet måste genomtränga dels den glas- platta som fanns under gelen, dels kylarens ovansida. ga Genom att i det nya förfarandet innesluta gelen mellan två motstående väggar är det således möjligt att dels applicera väsentligt större volym av varje prov, dels erhålla mycket effektivare kylning av stödsubstansen än vad som tidigare_ varit möjligt, varigenom ovan nämnda brister avhjälpas.The heat that has reached the buffer solution can be easily dissipated with for example a heat exchanger in the form of tubes. Through the improved cooling and elimination of wicks, it is possible to increase it over the excipient applied electrical voltage, whereby the required electrophoresis time can be significantly shortened in comparison with previous procedures, where cooling was only available from one side and where the heat must penetrate the glass plate that was under the gel, partly the top of the radiator. ga By enclosing the gel between two in the new procedure opposite walls, it is thus possible to partly apply significantly larger volume of each sample, partly obtain a lot more efficient cooling of the builder than before_ been possible, whereby the above-mentioned shortcomings are remedied.

Ytterligare fördelaktiga utföringsformer av uppfinningen de- finieras i kraven 2 - 5.Further advantageous embodiments of the invention defined in claims 2 - 5.

Några olika utföringsformer av det nya förfarandet skall i det följande beskrivas med hänvisning till bifogade ritningæ; vilka i väsentligen naturlig storlek visar perspektivvyer av fördelaktiga apparater för utförande av förfarandet. _ Pig. l är en sprängvy, som visar en stödplatta, en form för åstadkommande av gelremsor och en frontplatta hos ett elektnd- kärl. Pig. 2 visar en perspektivvy av ett annat utförande av en form för att åstadkomma gelremsor. Pig. 3 visar en perqnk- l0 15 20 25 30 35 452 199 Q -a tívvy av en första elektroforesapparat för utövning av upp- finningen. Pig. 4 visar en perspektivvy av en modifikation av det inre buffertkärlet.Some different embodiments of the new procedure will i the following is described with reference to the accompanying drawings; which in substantially natural size show perspective views of advantageous apparatus for carrying out the procedure. _ Pig. l is an exploded view showing a support plate, a shape for providing gel strips and a faceplate of an electrode Container. Pig. 2 shows a perspective view of another embodiment of a form for making gel strips. Pig. 3 shows a perknk- l0 15 20 25 30 35 452 199 Q -a view of a first electrophoresis apparatus for performing the finding. Pig. 4 shows a perspective view of a modification of the inner buffer vessel.

I fig. l visas en frontplatta l, som utgör del av ett inre elektrodkärl, såsom visas i fig. 3. Plattan l kan vara ut- förd i glas. En form 2, som består av en relativt tunn plat- ta av exempelvis plastmaterial, såsom styren eller PVC, har partier 3, som är förskjutna ut ur plattans plan, så att det på den motsatta flatsidan uppstår motsvarande fördjupningar, vilka kan bilda avlånga kanaler, om plattans flatsída tryckes mot en annan platta, exempelvis frontplattan l, eller genom att applicera en tunn plastfolie på motsvarande sätt mot formen. Plattan 2 kan enkelt tillverkas genom t.ex. vakuum- formning eller pressgjutning. Den horisontella delen 4 bil- dar en fördjupning, vilken vid övertäckning bildar en hori- sontell kanal, som förbinder de vertikala kanalerna. En stöd- platta 7 hålles lämpligen tryckt mot formen 2, vilken i sin I tur hålles tryckt mot frontplattan l genom att klämmare, vil- ka ej är utritade, appliceras vid sídokanterna och den undre kanten. För att täta kontaktytorna mellan gelformen 2 och plmæ torna l och 7 kan det vara ändamålsenligt att bestryka de oli- ka delarna l, 2 och 7 med fett eller limma ihop dem. Om gel- lösning hälles i en av de vertikala kanalerna, kommer den ho- risontella kanalen att tjäna som kommunicerande kärl, så att samtliga vertikala kanaler kan fyllas upp till önskad höjd i ett arbetsmoment. På så vis kan ett flertal vertikala gel- remsor erhållas, och ovanför var och en av dessa utbildas ut- rymmen, i vilka provlösningar lätt kan ifyllas uppifrån genom en smal kapillär. Vätskekontakt uppåt kan sedan erhållas till det inre elektrodkärlet 13 (fig. 3) genom påfyllning av buf- fertlösning, som även når över plattans l tröskel 5. Nedåt kan vätskekontakt erhållas genom spalten 6, vilken vid fyll- ning med gellösning emellertid är försluten genom att plat- tan 7 ligger an mot formens upphöjningar, men kan öppnas ge- nom att plattan 7 höjes så, att spalten 8'kommer mitt för spalten 6. Cm hela anordningen ställes i kärlet 13 med buf- lO 15 20 25 30 35 452 199 f _ 7 | _ x - fert, kan detta tjäna som det andra elektrodkärlet.Fig. 1 shows a front plate 1, which forms part of an interior electrode vessel, as shown in Fig. 3. The plate 1 may be brought in glass. A form 2, which consists of a relatively thin platform remove for example plastic materials, such as styrene or PVC, have portions 3, which are offset from the plane of the plate, so that on the opposite flat side, corresponding depressions occur, which can form elongate channels, if the flat side of the plate is pressed against another plate, for example the front plate 1, or through to apply a thin plastic foil in a corresponding manner to the form. The plate 2 can easily be manufactured by e.g. vacuum- forming or die casting. The horizontal part 4 car- a depression, which when covered forms a horizontal sontal channel, which connects the vertical channels. A support plate 7 is suitably kept pressed against the mold 2, which in its I is kept pressed against the front plate 1 by clamping, ka are not drawn, applied to the side edges and the lower one the edges. To seal the contact surfaces between gel form 2 and plmæ 1 and 7, it may be appropriate to coat the different glue parts 1, 2 and 7 with grease or glue them together. If gel- solution is poured into one of the vertical channels, the rational channel to serve as a communicating vessel, so that all vertical channels can be filled up to the desired height in a work step. In this way, a plurality of vertical gels strips are obtained, and above each of these are trained spaces, in which sample solutions can be easily filled from above through a narrow capillary. Liquid contact upwards can then be obtained the inner electrode vessel 13 (Fig. 3) by filling the buffer fert solution, which also reaches above the plate l threshold 5. Downwards liquid contact can be obtained through the gap 6, which at filling gel solution, however, is sealed by tan 7 abuts the elevations of the mold, but can be opened by raising the plate 7 so that the gap 8 'comes in the middle column 6. Cm the whole device is placed in the vessel 13 with buffer lO 15 20 25 30 35 452 199 f _ 7 | _ x - fourth, this can serve as the second electrode vessel.

Den elektroforetiska transporten av de ämnen som skall be~ stämmas äger sedan rum nedåt, så att dessa ämnen kommer i kontakt med andra ämnen, med vilka de kan ge precipitat och vilka på förhand inblandats i stödsubstansens vattenfas.The electrophoretic transport of the substances to be ~ sued then takes place downward, so that these substances come in contact with other substances, with which they can give precipitates and which have been mixed in advance with the aqueous phase of the excipient.

Efter fullbordad elektrofores är detmöjligt att komma åt, eller ta ur gelremsorna ur formen genom att avlägsna denna från stödplattan 7 och frontplattan l. Gelremsorna kan lätt överföras direkt från formen och läggas på t.ex. en glasplaæ taför torkning och färgning av precipitaten.After completion of electrophoresis it is possible to access, or remove the gel strips from the mold by removing it from the support plate 7 and the front plate 1. The gel strips can easily transferred directly from the mold and placed on e.g. a glass plaque performs drying and staining of the precipitates.

Pig. 2 visar en form 9 bestående av en plastskiva av t.ex. plexiglas, polystyren eller PVC, i vilken det finns ribbor lO, åtskilda av spalter ll med en bredd av l till 5 mm. Vid nedre delen av ribborna finns en urfräsning l2. När formen 9 placeras med flatsidan mot frontplattan l och den motsatta flatsidan på formen täckes av stödplattan 7, uppstår ett system av vertikala kanaler i spalterna ll och en dem samman- bindande horisontell kanal l2. Fyllning med gellösning och övrig användning sker på sätt som beskrivits med hänvisning 635 till fig; 1. .Pig. 2 shows a mold 9 consisting of a plastic sheet of e.g. plexiglass, polystyrene or PVC, in which there are ribs 10, separated by slits ll with a width of 1 to 5 mm. At lower part of the ribs there is a cut-out l2. When the mold 9 placed with the flat side facing the front plate 1 and the opposite the flat side of the mold is covered by the support plate 7, a systems of vertical channels in the columns ll and one of them binding horizontal channel l2. Filling with gel solution and other use takes place in the manner described with reference 635 to fig; 1..

Pig. 3 visar en inre låda l3 med frontplattan l, varvid lådn står i en yttre låda 14. Lådorna kan vara av glas eller plast och är försedda med var sin elektrod 15, l6, vilka kan vara w t.ex. platinatråd och är förenade med banankontakterna l7 och l8, vilka är fästade i väggen av respektive låda. I locket l9 är infästat genomgående banankontaktshonor 20 och 21, vil- ka är förenade med var sin ledare 22, 23, som är anslutna tﬂl de motsatta polerna av ett likströmsspänningsaggregat. När locket anbringas på lådan 14, erhålles elektrisk kontaktïså, att elektroderna 15 och ló kan bli strömförande. Från i lådor- na 13, l4 ifylld buffertvätska avledes joulskt värme genom kylslingor, såsom antydes vid 24, i vilken cirkuleras kylväska såsom framgår av pilarna i figuren. lO 15 20 25 30 35 452 199 _ - -a Pig. 4 visar ett kärl, vilket, om det förses med en elehzod på insidan, kan användas som ett inre elektrodkärl i analo- gi med kärlet l3 i lådan l4. Kärlet 25, som har en tätt- slutande botten 26, är på utsidan försett med spår 27, vilka sinsemellan är åtskilda av ribbor 28. Spåren mynnar nedtill i ett spår 29. Detta liksom spåren 27 kan övertäckas av en plastfolie 30, t.ex. en tejp, vilken med fördel tíllåtes nå några centimeter över den övre tröskeln 31, som nedåt be- gränsar en urfräsning ur kärlets vägg. Härigenom uppstår ett system av vertikala kanaler vid spåren 27, som kommunicerar med en horisontell kanal, som bildas av spåret 29. Det är härigenom möjligt att uppifrån via en av kanalerna fylla samtliga kanaler till önskad höjd med t.ex. en agaroslösning.Pig. 3 shows an inner box 13 with the front plate 1, the box stands in an outer drawer 14. The drawers can be made of glass or plastic and are each provided with an electrode 15, 16, which may be w for example platinum wire and are connected to the banana contacts 17 and 18, which are attached to the wall of the respective box. In the lid 19 is attached through banana contact females 20 and 21, which ka are associated with their respective conductors 22, 23, which are connected to t the opposite poles of a DC power supply. When the lid is applied to the box 14, electrical contact is obtained, that the electrodes 15 and 10 can become live. From in drawers- na 13, l4 filled buffer liquid is diverted joulic heat through cooling coils, as indicated at 24, in which coolant is circulated as shown by the arrows in the figure. lO 15 20 25 30 35 452 199 _ - -a Pig. 4 shows a vessel, which, if provided with an elehzod on the inside, can be used as an internal electrode vessel in the analogue gi with the vessel l3 in the box l4. The vessel 25, which has a closing bottom 26, is provided on the outside with grooves 27, which between them are separated by ribs 28. The grooves open at the bottom in a groove 29. This as well as the grooves 27 can be covered by a plastic film 30, e.g. a tape, which is advantageously allowed to reach a few centimeters above the upper threshold 31, which is limits a milling out of the vessel wall. This creates a system of vertical channels at the tracks 27, which communicate with a horizontal channel, formed by the groove 29. It is thereby possible to fill from above via one of the channels all channels to the desired height with e.g. an agarose solution.

När agaroslösningen stelnat under bildning av en gel, är det lätt att med t.ex. en kniv skära av och avlägsna en smal remsa av folien 30 parallellt med och några millimeter ovan- för den undre kanten av spåret 29. Härvid uppstår en spalt 32, genom vilken gelen kan få direkt kontakt med vätska i di elektrodkärl, i vilket kärlet 25 placerats. Det är möjligt att använda lådan l4 för detta ändamål, men ävenledes ända- målsenligt att placera kärlet 25 i en väsentligen rund burk innehållande elektrod och kylanordning. Provpåsättning och övrig användning sker på sätt, som beskrivits med hänvís= ning till fig. l. ÉšÉ@EÉl-å Till 10 ml av 1%-ig agaroslösning i 0,04 M veronalbuffert, innehållande 4% polyetylenglykol, med temperaturen 5500 sat- tes 10 ul serum av kanin-antihumantransferrin (Dako, Immun- globuliner, Köpenhamn), varefter lösningen snabbt hälldes i cellerna i en apparat enligt figuren l, så att gellösningen nådde ca 30 mm nedom övre kanten av främre väggen l i lådäh 13. Efter 20 minuter hälldes buffert i apparatens elektrod- kärl 13, 14, och varje cell beskickades med 20 ul av normah humanserum i spädningarna l:500 -l:l60O med jämna lOO-tals intervall i ovannämnda buffert, varvid serumlösningarna även innehöll 8% suCI05_ Därefter applkmades en spänning på ll0 lO l5 20 25 30 452 199 s volt likström mellan elektroderna. Efter 2 timmar avstäng- des strömmen och isärtogs cellen, varefter gelremsorna pla- cerades på en glasplatta, där de lufttorkades. Sedan fick de ligga under 60 minuter i ett proteinfärgningsbad inne- hållande 0,5 % Coomassie Brilliant Blue R 250 (ICI, Mancheia; England) 45 % etanol, 45 % vatten och l0 % ättiksyra. Där- efter sköljdes överskottet av färg bort í en lösning av 45 % etanol, 45 % vatten och lO % ättiksyra. I varje gelremsa uppmättes avståndet från applikationskanten till den del av precipitatet som hade vandrat längst. Denna sträcka var pro- portionell mot mängden transferrin och i typiska fall er- hölls en regressionskoefficíent av 0,97. Detta försök visar att det nya förfarandet kan användas för kvantitativ bestäm- ning av ämnen.When the agarose solution solidifies to form a gel, it is easy to with e.g. a knife cut off and remove a narrow strip of foil 30 parallel to and a few millimeters above for the lower edge of the groove 29. This creates a gap 32, through which the gel can have direct contact with liquid in di electrode vessel in which the vessel 25 is placed. It is possible to use the box 14 for this purpose, but also for expedient to place the vessel 25 in a substantially round jar containing electrode and cooling device. Test application and other use takes place in the manner described with reference = to Fig. 1. ÉšÉ @ EÉl-å To 10 ml of 1% agarose solution in 0.04 M veronal buffer, containing 4% polyethylene glycol, with a temperature of 5500 10 μl serum of rabbit antihuman transferrin (Dako, Immuno- globulins, Copenhagen), after which the solution was quickly poured into the cells in an apparatus according to Figure 1, so that the gel solution reached about 30 mm below the upper edge of the front wall l in the box 13. After 20 minutes, buffer was poured into the electrode of the apparatus. vessels 13, 14, and each cell was loaded with 20 μl of normah human serum in dilutions 1: 500 -1l: 160 ° with even 100s intervals in the above buffer, the serum solutions also contained 8% suClO5_ Then a voltage of ll0 was applied lO l5 20 25 30 452 199 s volts DC between the electrodes. After 2 hours shut down the current was discharged and the cell was disassembled, after which the gel strips were placed were placed on a glass plate, where they were air dried. Then got they lie for 60 minutes in a protein staining bath containing holding 0.5% Coomassie Brilliant Blue R 250 (ICI, Mancheia; England) 45% ethanol, 45% water and 10% acetic acid. Where- after, the excess paint was rinsed off in a solution of 45% ethanol, 45% water and 10% acetic acid. In each gel strip the distance from the application edge to that part of was measured the precipitate that had migrated the farthest. This distance was pro- proportional to the amount of transferrin and typically a regression coefficient of 0.97 was maintained. This experiment shows that the new procedure can be used for quantitative substances.

Uppfinningen avser även en apparat väsentligen enligt vad som beskrivits ovan för utövning av det nya förfarandet. Äwen modifikation av ovan beskrivna förfarande och apparat är möj- liga. Sålunda kan inom ramen för uppfinningen brukas stöd- substanser inneslutna mellan två motstående väggar, exempel- vis enligt någon av figurerna l eller 2, och i övrigt för- slutna med löstagbara organ, så att de kan förvaras åtskil- de nämnda organen,_som av tape, varefter det liga dagar. Vid användningen avlägsnas kan utgöras av plastfolie t.ex. i form är lätt att applicera stödsubstanserna i en elektroforesappa- rat, t.ex. enligt figuren 3, påsätta provlösningar och ut- föra bestämning av ämnen i proverna.The invention also relates to an apparatus substantially according to what as described above for the exercise of the new procedure. Even modification of the method and apparatus described above is possible league. Thus, within the scope of the invention, support substances enclosed between two opposite walls, e.g. according to any one of Figures 1 or 2, and otherwise enclosed with detachable bodies, so that they can be kept separately the said organs, _som of tape, after which it league days. When used, remove can consist of plastic foil e.g. in shape is easy to apply the builders in an electrophoresis apparatus rat, e.g. according to Figure 3, apply sample solutions and determine substances in the samples.

Det kan även vara ändamålsenligt om proverna före införandet i apparaten föreligger i en :garoslösning med en koncentration av omkring 0.05- 0.2 %, vilket motverkar konvektionsströmmar och kan ersätta sukros och motsvarande ämnen som nämnts i Exempel 1.It may also be appropriate if the samples before introduction into the the apparatus is present in a: garos solution with a concentration of about 0.05- 0.2%, which counteracts convection currents and can replace sucrose and the corresponding substances mentioned in Example 1.

Claims

l0 15 20 25 30 452 199 l0 PATENT REQUIREMENTS

A method for intraun electrophoretic examination in an internal but releasable builder capable of stabilizing an aqueous solution therein against convection currents. where two opposite * end regions of the excipient are connected to different buffer liquid reservoirs serving as electrode vessels, wherein in said solution contains substances which can form precipitates with the substance to be quantified and the latter substance being transported by electrophoresis into the aqueous phase in said builder to obtain precipitation in an area corresponding to the amount of the substance thereof, which procedure allows rapid determination with high accuracy and facilitated discharge; Assessment is characterized in that the support substance is in the form of vertical rods enclosed in channels formed between separable walls, the upper part of the channels from the free part of the support substance being used as sample receiving space and in which the reservoirs are substantially maintained.

2. A method according to claim 1, characterized in that a support substance is used in the form of rods, which are connected to each other near one end of them, preferably near the opposite end of their sample mounting end.

3. A method according to claim 1 or 2, characterized in that substances to be determined are applied to the support substance via the sample reception spaces, the cross-sectional area of which increases in the direction from the application area.

4. A method according to any one of claims 1-3, characterized in that - a builder is used which contains an antidote to electroendosmosis, for example polyethylene glycol.

Process according to one of Claims 1 to 4, characterized in that substances to be determined are added to a sample solution with an ionic composition and / or concentration different from that of the aqueous solution present in the builder, in order to promote a concentration. centering 'of said substances already during the initial stage of electrophoresis.