SE431215B

SE431215B - Polypeptide fraction isolated from the haemolymph of the common mussel for use as an antiviral medicine

Info

Publication number: SE431215B
Application number: SE8003253A
Authority: SE
Inventors: Ulf Sven Erik Rothman
Original assignee: Ulf Sven Erik Rothman
Priority date: 1980-04-29
Filing date: 1980-04-29
Publication date: 1984-01-23
Also published as: SE8003253L

Abstract

The invention relates to certain polypeptide fractions for use as an antiviral medicine. These fractions are characterized in that they are isolated from molluscs or arthropods, such as the common mussel, and in that they are capable of binding sialic acid in a biospecific manner. The said polypeptide fractions are active against a wide spectrum of virus species. <IMAGE>

Description

15 20 25 30 35 8003253-5 2 genom sin förmåga att i närvaro av kalciumjoner biospecifikt binda sialinsyra. 800 2025 30 35 8003253-5 2 by its ability to biospecifically bind sialic acid in the presence of calcium ions.

Härmed avses att den aktuella polypeptidfraktionen skall ha förmåga att biospecifikt affinitetsbindas till åtminstone något aminosocker ur gruppen sialinsyror. Uttrycket "sialinsyror" används här i sin allmänt vedertagna betydelse, nämligen som N- och/eller O-substituerade acylderivat (t.ex. acetyl- och/eller glykocylderivat) av neuraminsyra; se t.ex. Sai-Sun Ng och Joel A. KDain, The natural occurence of sialic acids (1974) och The Merck Index, 9:e uppl., 1976.By this is meant that the polypeptide fraction in question should be capable of biospecifically affinity binding to at least some amino sugar from the group of sialic acids. The term "sialic acids" is used herein in its generally accepted meaning, namely as N- and / or O-substituted acyl derivatives (eg acetyl and / or glycocyl derivatives) of neuramic acid; see e.g. Sai-Sun Ng and Joel A. KDain, The natural occurrence of sialic acids (1974) and The Merck Index, 9th ed., 1976.

Polypeptidfraktionernas exakta kemiska uppbyggnad är inte känd. Uttrycket "polypeptidfraktion" är därför i föreliggande sammanhang inte inskränkt till polypeptider eller proteiner i strikt bemärkelse, utan uppfinningen är avsedd att omfatta varje från nämnda djur isolerad fraktion, som till övervägande delen består av polypeptidsekvenser och som har förmåga att biospecifikt affinitets- binda sialinsyra. De enligt uppfinningen använda polypeptidfraktionerna kan sålunda' exempelvis eventuellt omfatta glykoproteiner. Uppfinningen omfattar även användning av sådana fragment av nämnda polypeptidfraktioner, som har förmåga att biospecifikt binda sialinsyra i närvaro av kalciumjoner.The exact chemical structure of the polypeptide fractions is not known. The term "polypeptide fraction" is therefore in the present context not limited to polypeptides or proteins in the strict sense, but the invention is intended to comprise any fraction isolated from said animal, which consists predominantly of polypeptide sequences and which is capable of biospecifically affinity binding sialic acid. Thus, for example, the polypeptide fractions used in the invention may optionally comprise glycoproteins. The invention also encompasses the use of such fragments of said polypeptide fractions, which are capable of biospecifically binding sialic acid in the presence of calcium ions.

En råprodukt innehållande enligt uppfinningen använd polypeptidfrak- tion, tillsammans med inaktiva föroreningar, har tidigare isolerats från hemolym- fan (kroppsvätskan) hos bl.a. blåmussla (Mytilus edulis), och dess förmåga att binda sialinsyra har beskrivits (se t.ex. l-lardy et al., CA 85 (1976): 90l+66p).A crude product containing polypeptide fraction used according to the invention, together with inactive impurities, has previously been isolated from the hemolymph (body fluid) of e.g. mussel (Mytilus edulis), and its ability to bind sialic acid has been described (see, e.g., l-lardy et al., CA 85 (1976): 901 + 66p).

Denna polypeptidfraktion har emellertid vare sig använts eller föreslagits för någon praktisk användning - t.ex. såsom läkemedel - vare sig i den kända orena formen eller i någon (hittills ej beskriven) renad form. Det har enligt uppfinningen oväntat visat sig, att immunisering med de ovan definierade polypeptidfraktionerna ökar motståndskraften (immunskydd) mot angrepp från ett stort antal olika virustyper såsom olika myxovirus, speciellt olika typer av lnfluensavirus. Polypeptidfraktionerna ifråga kan därför bl.a. finna användning som ett praktiskt taget idealiskt influensa-"vaccin", eftersom en och samma produkt ger skydd mot praktiskt taget alla - kanske t.o.m. alla - typer av influensavirus, och även mot andra virustyper.However, this polypeptide fraction has neither been used nor suggested for any practical use - e.g. as a drug - either in the known impure form or in any (hitherto not described) purified form. It has unexpectedly been found according to the invention that immunization with the polypeptide fractions defined above increases the resistance (immune protection) to attacks from a large number of different virus types such as different myxoviruses, especially different types of influenza viruses. The polypeptide fractions in question can therefore e.g. find use as a practically ideal flu "vaccine", as one and the same product provides protection against virtually everyone - perhaps even all - types of influenza viruses, and also against other types of viruses.

Orsaken till att man vid immunisering med hjälp av ovan definierade polypeptidfraktioner uppnår ett verksamt skydd mot ett brett spektrum av virusinfektioner är inte helt klarlagd. Följande försök till teoretisk förklaring av mekanismen för den observerade effekten får därför inte betraktas som någon inskränkning av- uppfinningen. Mekanismbeskrivningen avser speciellt influensa- virus, men den är på analogt sätt tillämplig även på andra virustyper. lnfluensavirus kännetecknas bl.a. av förmågan att biospecifikt bindas till sialinsyra. Denna egenskap är också av betydelse för viruspartikelns förmåga 10 15 20 25 30 35 g polypeptidfraktionen. 8003253-5 3 att föröka sig vid inträngning i kroppen. Härvid kopplas det sialinsyraspecifika viruset till olika slag av kroppsceller, som har sialinsyra i sitt membran, varvid virusets hemagglutinindel kopplar med sialinsyran. Orsaken till att viruspartikeln kan tränga in i cellen och sedan börja föröka sig är att viruset innehåller enzymet neuraminídas, vilket spränger bort sialinsyragrupperna från cellmembranen under bildning av ett s.k. mycket litet hål. På grund av virusets förökning i cellen kommer patienten att få sedvanliga influensasymptom och efterföljande sjuk- domsförlopp. Samtidigt bildar kroppen också antikroppar gentemot viruset ifråga, och en del av dessa antikroppar är riktade mot hemagglutininer pâ virusytan, s.k. antihemagglutínin-antikroppar. Vid en senare influensaattack av samma virustyp kommer dessa antikroppar att korsreagera med hemagglutininet på viruset.The reason why effective immunization with the help of polypeptide fractions defined above achieves effective protection against a wide range of viral infections is not entirely clear. The following attempts to theoretically explain the mechanism of the observed effect must therefore not be considered as any limitation of the invention. The mechanism description refers specifically to influenza virus, but it is analogously also applicable to other types of virus. Influenza viruses are characterized i.a. of the ability to biospecifically bind to sialic acid. This property is also important for the ability of the virus particle 10 g of the polypeptide fraction. 8003253-5 3 to multiply upon penetration into the body. In this case, the sialic acid-specific virus is linked to different types of body cells, which have sialic acid in their membrane, the hemagglutinin part of the virus coupling with the sialic acid. The reason why the virus particle can enter the cell and then begin to multiply is that the virus contains the enzyme neuraminidase, which blows the sialic acid groups away from the cell membranes to form a so-called very small hole. Due to the multiplication of the virus in the cell, the patient will have the usual flu symptoms and subsequent course of the disease. At the same time, the body also produces antibodies against the virus in question, and some of these antibodies are directed against hemagglutinins on the virus surface, so-called antihemagglutinin antibodies. In a later influenza attack of the same virus type, these antibodies will cross-react with the hemagglutinin on the virus.

Denna korsreaktivitet leder till att virusets hemagglutinin hämmas i sina försök att koppla sig med sialinsyran på cellerna. En analog reaktionsmekanism gäller vid vaccinering mot influensa med konventionellt influensavaccin. Vid injicering av sådant vaccin bildar kroppen bl.a. antikroppar riktade mot det aktuella virusets hemagglutinin. Vid sådan vaccinering får man ett relativt gott skydd mot det aktuella viruset, dock inte lika långvarigt som vid en virusinfektion.This cross-reactivity leads to the hemagglutinin of the virus being inhibited in its attempts to bind to the sialic acid on the cells. An analogous reaction mechanism applies to vaccination against influenza with conventional influenza vaccine. When injecting such a vaccine, the body forms i.a. antibodies directed against the hemagglutinin of the virus in question. With such vaccination, you get relatively good protection against the virus in question, but not as long-lasting as with a viral infection.

Vid injektion enligt uppfinningen med en sialinsyraspecifik polypeptid- fraktion av ovan angivet slag kommer kroppen att bilda antikroppar riktade mot En del av dessa antipolypeptid-antikroppar kommer på motsvarande sätt som vid en vanlig influensaattack eller vid konventionell vaccinering, att korsreagera med hemagglutininet på det attackerande viruset och på analogt sätt hindra virushemagglutininet att bindas till de sialinsyra- grupper, som finns på olika typer av celler i kroppen. Sannolikt på grund av att polypeptidfraktionen härrör från mycket lågt stående djur blir inte de aktuella antipolypeptid-antikropparna specifika för något speciellt virus, utan de kommer att korsreagera med hemagglutininet hos ett brett spektrum av virus. Polypeptid- fraktionernas förmåga att korsreagera med vacciner mot olika typer av virus har påvisats vid djurförsök, vilka redovisas nedan. lmmuniseringsmedel enligt uppfinningen, som innehåller ovan definiera- de polypeptidfraktioner, kan användas i preventivt syfte för att förhindra uppkomst av virusinfektioner, men även kurativt under pågående sjukdomstill- stånd. Härvid kan medlet administreras som vid konventionell vaccinering, dvs. genom t.ex. parenteral, företrädesvis subkutan, injicering av polypeptidfrak- tionen tillsammans med något lämpligt inert vätskeformigt spädningsmedel, exempelvis i en fysiologisk isotonisk lösning, t.ex. 0,996 fysiologisk koksaltlös- ning, som eventuellt kan vara buffrad med exempelvis fosfatbuffert. Vid behov kan man på i och för sig känt sätt tillsätta olika tillsatsmedel till medlet, 10 15 20 25 30 35 8003253-5 4 exempelvis konserveringsmedel. Medlet kan också innehålla konventionella immunologiska adjuvanser såsom aluminiumhydroxid eller aluminiumfosfat, etc.When injected according to the invention with a sialic acid-specific polypeptide fraction of the type indicated above, the body will form antibodies directed against. Some of these antipolypeptide antibodies will, in the same way as in a normal influenza attack or conventional vaccination, cross-react with the hemagglutinin on the attacking virus. and in an analogous manner prevent the viral hemagglutinin from binding to the sialic acid groups present on various types of cells in the body. Probably because the polypeptide fraction is derived from very low-lying animals, the antipolipeptide antibodies in question will not be specific for any particular virus, but will cross-react with the hemagglutinin of a broad spectrum of viruses. The ability of the polypeptide fractions to cross-react with vaccines against different types of virus has been demonstrated in animal experiments, which are reported below. Immunizing agents according to the invention, which contain polypeptide fractions as defined above, can be used for preventive purposes to prevent the onset of viral infections, but also curatively during ongoing disease states. In this case, the agent can be administered as in conventional vaccination, ie. by e.g. parenteral, preferably subcutaneous, injection of the polypeptide fraction together with any suitable inert liquid diluent, for example in a physiological isotonic solution, e.g. 0.996 physiological saline solution, which may be buffered with, for example, phosphate buffer. If necessary, various additives can be added to the agent in a manner known per se, for example preservatives. The agent may also contain conventional immunological adjuvants such as aluminum hydroxide or aluminum phosphate, etc.

Vid parenteral injicering av polypeptidfraktionerna enligt uppfinningen är doser mellan l pg och 1 g i regel tillfredsställande. Vid behov kan injektionen upprepas med t.ex. samma dos med någon eller några veckors intervall.For parenteral injection of the polypeptide fractions of the invention, doses between 1 pg and 1 g are generally satisfactory. If necessary, the injection can be repeated with e.g. the same dose at intervals of one or a few weeks.

Det har dock enligt uppfinningen även överraskande visat sig, att de aktuella polypeptidfraktionerna också ger ett effektivt lokalt immunskydd mot virusinfektioner i de övre luft- eller slemvägarna (inklusive lungor) vid topisk applicering, exempelvis i form av en spray. Vid sådan applicering kan medlet enligt uppfinningen användas såväl preventivt som kurativt under pågående infektion. Ett föredraget administreringssätt är nasal applikation, dvs. sprayning í näs-lmunhåla, med en föredragen dosering av 1 - 1000 ng en gång om dagen i 5 - 10 dagar. Man kan härvid tänka sig att effekten uppstår genom minst två olika reaktionsmekanismer. _ , Vid preventiv behandling genom nasal applikation upprepade gånger kommer polypeptidfraktionerna enligt uppfinningen att bilda lokalt verkande antikroppar, och en del av dessa kommer att analogt med ovanstående mekanismbeskrivning korsreagera och hindra ett angripande virus att attackera de sialinsyragrupper, som är nödvändiga för att viruset skall kunna överleva och tillväxa. Under pågående virusinfektion kan applicering av medlet enligt uppfinningen också snabbt bilda dylika antikroppar och därigenom dämpa det pågående sjukdomsförloppet. En additiv effekt kan tänkas uppkomma genom en reaktionsmekanism, som innebär att den sialinsyraspecifika polypeptidfraktionen enligt uppfinningen vid lokal applicering binds till de i .luftvägarna rikt förekommande sialinsyragrupperna på cellerna i saliv och näs- och munsekret, etc. Kroppscellernas sialinsyragrupper skulle härigenom "blockeras" och därmed hindra eller minska möjligheten för hemagglutininet på viruspartiklarna att bindas till sialinsyragrupperna, vilket är en förutsättning för tillväxt av viruset.However, according to the invention, it has also surprisingly been found that the polypeptide fractions in question also provide effective local immune protection against viral infections in the upper respiratory or mucous membranes (including lungs) when applied topically, for example in the form of a spray. In such application, the agent according to the invention can be used both preventively and curatively during ongoing infection. A preferred mode of administration is nasal application, i.e. spraying into the nasal cavity, with a preferred dosage of 1 - 1000 ng once a day for 5 - 10 days. It is conceivable that the effect arises through at least two different reaction mechanisms. In preventive treatment by nasal application repeatedly, the polypeptide fractions of the invention will form locally acting antibodies, and some of these will, in analogy to the above mechanism description, cross-react and prevent an invading virus from attacking the sialic acid groups necessary for the virus to be able to survive and grow. During an ongoing viral infection, application of the agent of the invention can also rapidly form such antibodies and thereby attenuate the ongoing course of the disease. An additive effect is thought to arise through a reaction mechanism, which means that the sialic acid-specific polypeptide fraction according to the invention, when applied topically, binds to the air-rich sialic acid groups on the cells in saliva and nasal and oral secretions, etc. The body cells' sialic acid groups would be "thereby" thereby preventing or reducing the ability of the hemagglutinin on the virus particles to bind to the sialic acid groups, which is a prerequisite for the growth of the virus.

Denna mekanism är inte någon immunologisk reaktion i egentlig mening, utan innebär snarare en direkt "beläggning" av cellytan genom bindníngen till dennas sialinsyragrupper.This mechanism is not an immunological reaction in the true sense, but rather involves a direct "coating" of the cell surface by binding to its sialic acid groups.

Polypeptidfraktionen ifråga isoleras ur kroppsvätskorna hos blåmussla.The polypeptide fraction in question is isolated from the body fluids of mussels.

Med kroppsvätskor avses här samtliga system hos dessa lågt stående djur som motsvarar blod-, lymf- och körtelsystem hos högre stående djur. En oftast lämplig isoleringsmetod är att bilda ett extrakt av dessa kroppsvätskor och efter eventuell lämplig upparbetning avseparera den önskade polypeptidfraktionen genom affinititetskromatografí, t.ex. analogt med den nedan speciellt för 10 15 20 25 30 35 8003253 - 5 blâmussla redovisade isoleringsmetoden. Den renade, sialinsyraspecifika polypep- tidfraktionen förpackas lämpligen som frystorkad produkt i engångsdoser, varvid den frystorkade produkten löses i lämpligt spädningsmedel i anslutning till' administreringen.By body fluids is meant here all systems of these low-lying animals which correspond to the blood, lymph and gland systems of higher-standing animals. A most suitable isolation method is to form an extract of these body fluids and, after appropriate processing, separate the desired polypeptide fraction by affinity chromatography, e.g. analogous to the isolation method reported below specifically for the mussel report. The purified, sialic acid-specific polypeptide fraction is conveniently packaged as a single-dose lyophilized product, the lyophilized product being dissolved in a suitable diluent prior to administration.

Uppfinningen beskrivs närmare i de följande utföringsexemplen, som dock pâ intet sätt är avsedda att inskränka uppfinningens omfattning.The invention is described in more detail in the following exemplary embodiments, which, however, are in no way intended to limit the scope of the invention.

Exemæl I Levande blåmusslor (Mytilis edulis) öppnades och all vätska och muskelvävnad överfördes till ett centrifugkärl, som centrifugerades vid 4°C och 9.000 rpm under 40 minuter. Supernatanten uppsamlades och värmdes till 45°C under 30 minuter för att förstöra lytisk effekt. Den erhållna lösningen centrifu- gerades på nytt vid 4°C och 9.000 rpm under 30 minuter. Supernatanten tillvaratogs och under omrörning tillsattes mättad ammoniumsulfatlösning till en mättnadskoncentration av 65%. Den erhållna fällningen fick stå i 30 minuter vid rumstemperatur och centrifugerades därefter vid 9.000 rpm under 30 minuter.Exemæl I Live mussels (Mytilis edulis) were opened and all fluid and muscle tissue was transferred to a centrifuge vessel, which was centrifuged at 4 ° C and 9,000 rpm for 40 minutes. The supernatant was collected and heated to 45 ° C for 30 minutes to destroy lytic effect. The resulting solution was centrifuged again at 4 ° C and 9,000 rpm for 30 minutes. The supernatant was collected and with stirring saturated ammonium sulfate solution was added to a saturation concentration of 65%. The resulting precipitate was allowed to stand for 30 minutes at room temperature and then centrifuged at 9,000 rpm for 30 minutes.

Supernatanten avlägsnades och fällningen löstes i 0,05M fosfatbuffert pH 7,4, 0,05M natriumklorid (PBS) samt dialyserades mot PBS. Ett frystorkat prov av produkten var färglöst och lättlösligt i destillerat vatten. 1,0 mg bovint submaxillart mucin (som är sialinsyrahaltigt) kopplades på i och för sig känt sätt till 30 g bromcyanaktiverad Sepharose #5 (agaros, tillgänglig från Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige). Den bildade gelen packades sedan i en gelfiltreringskolonn och jämviktades med 0,05 M tris-l-ICl, O,lM natriumklorid, 0,01M kalciumdikloridbuffert, pl-l 8,5. 40 ml av den enligt ovan framställda, dialyserade polypeptidfraktionen satsades på kolonnen, som eluerades med nämnda buffert (buffert A i bifogade ritning). Eluatet från kolonnen följdes genom absorption vid 280 nm samt uppsamlades fraktionsvis.The supernatant was removed and the precipitate was dissolved in 0.05M phosphate buffer pH 7.4, 0.05M sodium chloride (PBS) and dialyzed against PBS. A lyophilized sample of the product was colorless and readily soluble in distilled water. 1.0 mg of bovine submaxillary mucin (which is sialic acid-containing) was coupled in a manner known per se to 30 g of bromocyanate-activated Sepharose # 5 (agarose, available from Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden). The resulting gel was then packed into a gel filtration column and equilibrated with 0.05 M tris-1-IC1, 0.1M sodium chloride, 0.01M calcium dichloride buffer, p1-1.5. 40 ml of the dialyzed polypeptide fraction prepared as above was charged to the column, which was eluted with said buffer (buffer A in the accompanying drawing). The eluate from the column was monitored by absorbance at 280 nm and collected fractionally.

Sedan en huvudfraktion av proteinerna eluerats (se toppen A i ritningen) byttes elueringsbufferten till 0,05M tris-I-ICl, l,0M NaCl, 0,01M kalciumdiklorid- buffert, pH 8,5 (buffert B i ritningen). Med denna buffert eluerades ett antal proteinhaltiga fraktioner - se toppen B i ritningen. Slutligen eluerades kolonnen med 0,05M tris-HCl, l,0M NaCl-buffert, pH 8,5 (buffert C i ritningen), varvid en mindre mängd protein eluerades - se toppen C i ritningen. De uppsamlade fraktionerna (A, B och C) undersöktes med avseende på hemagglutinerande effekt. Hemagglutinationstestet utfördes enligt den av Hammarström, S. och Kabat, E.A. i Biochemistry å, 2696 (1969) beskrivna metoden. Härvid användes mikrotiterplattor och en 296-13 lösning av humanerytrocyter med olika blodgruppstillhöríghet i 0,996 natriumklorid. Endast fraktionen C agglutinerade 10 15 20 25 eoozzsz-5 röda blodkroppar, dvs. var sialinsyraspecifik (se kurvan "uppsaml. aggl." i ritningen).After a major fraction of the proteins was eluted (see peak A in the drawing), the elution buffer was changed to 0.05M Tris-I-IC1, 1.0M NaCl, 0.01M calcium dichloride buffer, pH 8.5 (buffer B in the drawing). With this buffer a number of proteinaceous fractions were eluted - see peak B in the drawing. Finally, the column was eluted with 0.05M Tris-HCl, 1.0M NaCl buffer, pH 8.5 (buffer C in the drawing), eluting a small amount of protein - see peak C in the drawing. The collected fractions (A, B and C) were examined for haemagglutinating effect. The haemagglutination test was performed according to that of Hammarström, S. and Kabat, E.A. in Biochemistry å, 2696 (1969). Microtiter plates and a 296-13 solution of human erythrocytes with different blood group affiliations in 0.996 sodium chloride were used. Only fraction C agglutinated 10 15 20 25 eoozzsz-5 red blood cells, i.e. was sialic acid specific (see curve "collection aggl." in the drawing).

Den aktiva polypeptidfraktionen C koncentrerades 10 gånger genom ultrafiltrering (Amicon UM 10 filter) och dialyserades till jämvikt mot 0,05M tris-l-iCl, pI-I 8,5; 0,15M natriumklorid, 0,003M kalciumklorid-buffert. Efter frystorkning erhölls en färglös produkt, som var lättlöslig i vatten.The active polypeptide fraction C was concentrated 10 times by ultrafiltration (Amicon UM 10 filter) and dialyzed to equilibrium with 0.05M tris-1-iCl, pI-I 8.5; 0.15M sodium chloride, 0.003M calcium chloride buffer. After freeze-drying, a colorless product was obtained which was readily soluble in water.

Den isolerade sialinsyraspecifika fraktionens molekylvikt bestämdes med SDS-polyakrylamidelektrofores med användning av gradientgelen PAA 4/30 och molekylviktskalibreringskit (frân Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige). Elektroforesen gav fyra band inom molekylviktsområdet: 14.500 - 30.000. Dessa band i elektroforesen härrör troligtvis från s.k. subgrupper i ett större protein, som kan återbildas genom återkoppling av subgrupperna i närvaro av kalciumjoner.The molecular weight of the isolated sialic acid-specific fraction was determined by SDS-polyacrylamide electrophoresis using the gradient gel PAA 4/30 and molecular weight calibration kit (from Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden). The electrophoresis produced four bands in the molecular weight range: 14,500 - 30,000. These bands in the electrophoresis probably originate from the so-called subgroups of a larger protein, which can be regenerated by feedback of the subgroups in the presence of calcium ions.

Aminosyrasammansättningen undersöktes med sedvanlig aminosyraana- lys. Resultaten redovisas i nedanstående tabell. Inget aminosocker kunde påvisas: Aminosyra _9_6_ Aminosyra _96: Asp 16,5 Met 0,11- Thr 5,5 Ile 4,3 Ser 8,3 Leu 5,2 Glu 10,8 Tyr 9,6 Pro 3,3 Phe 5,6 Gly 5,1 His 3,8 Ala 2,0 Lys 7,3 Val 4,4 Arg 7,7 Polypeptidfraktionens isoelektriska punkt var 4,6.The amino acid composition was examined by conventional amino acid analysis. The results are reported in the table below. No amino sugar could be detected: Amino acid _9_6_ Amino acid _96: Asp 16.5 Met 0.11- Thr 5.5 Ile 4.3 Ser 8.3 Leu 5.2 Glu 10.8 Tyr 9.6 Pro 3.3 Phe 5, 6 Gly 5.1 His 3.8 Ala 2.0 Lys 7.3 Choice 4.4 Arg 7.7 The isoelectric point of the polypeptide fraction was 4.6.

Exempel 2 En för subkutan injicering lämpad beredning framställdes genom upplösning av i5011g frystorkad produkt enligt Exempel 1 i 0,5 ml destillerat vatten.Example 2 A preparation suitable for subcutaneous injection was prepared by dissolving 501 g of lyophilized product according to Example 1 in 0.5 ml of distilled water.

ExemEl 3 En för nasal applikation lämpad beredning kan framställas genom att 50 - 100 lig (engângsdos) frystorkad polypeptidfraktion enligt Exempel l upplöses i 1 - 1,5 ml sterilt destillerat vatten. Beredningen fylls på sprayflaska och appliceras lämpligen genom sprayning utan drivgas. Flerdosförpackningar kan framställas 10 15 20 25 30 8003253-5 genom proportionell ökning av mängden polypeptidfraktion och spädningsmedel.Example 3 A formulation suitable for nasal application can be prepared by dissolving 50-100 (single dose) lyophilized polypeptide fraction of Example 1 in 1 to 1.5 ml of sterile distilled water. The preparation is filled into a spray bottle and is suitably applied by spraying without propellant. Multi-dose packages can be prepared 8003 253 8003253-5 by proportionally increasing the amount of polypeptide fraction and diluent.

Exemæl li Den hemagglutinationshämmande effekten vid immunisering med de enligt uppfinningen använda polypeptidfraktionerna undersöktes pâ följande sätt. 2 mg frystorkad polypeptidfraktion (framställd enligt Exempel 1) suspenderades i 0,5 ml fysiologisk koksaltlösning (O,9%) plus 0,5 ml Freunds adjuvans och injicerades subkutant i multipla injektioner på ryggen av tvâ kaniner (3 kg vardera). Fjorton dagar senare injicerades på samma sätt ytterligare 2 mg i vardera kaninen, dvs. totalt limg polypeptidfraktion per kanin. Blodprov togs före den första injektionen samt 3 veckor därefter, och serumproven undersöktes på Ouchterlony-platta. Det visade sig att precipitation uppstod mellan polypep- tidfraktionen och treveckorsserumet. Däremot uppstod ingen precipitation med serum taget före immuniseringen. Varje kanin tjänstgjorde sålunda som sin egen kontroll.Example 1 The haemagglutination inhibitory effect on immunization with the polypeptide fractions used according to the invention was investigated in the following manner. 2 mg of lyophilized polypeptide fraction (prepared according to Example 1) was suspended in 0.5 ml of physiological saline (0.9%) plus 0.5 ml of Freund's adjuvant and injected subcutaneously in multiple injections on the back of two rabbits (3 kg each). Fourteen days later, an additional 2 mg was injected in the same way into each rabbit, i.e. total limg polypeptide fraction per rabbit. Blood samples were taken before the first injection and 3 weeks thereafter, and the serum samples were examined on an Ouchterlony plate. It turned out that precipitation occurred between the polypeptide fraction and the three-week serum. However, no precipitation with serum taken prior to immunization occurred. Each rabbit thus served as its own control.

Treveckorsserumet undersöktes sedan med ett konventionellt hemagglu- tinationsinhibitionstest. Härvid användes som viruskälla följande polyvalenta influensavacciner: 1) A-USSR-90,92,97-77(HlN1), 2) A-Eng1and-86lI-75Ü-I3N2), och 3) B-Hongkong-8-73. Varje milliliter vaccin innehåller 5011g hemagglutinin.The three-week serum was then examined with a conventional haemagglutination inhibition test. The following polyvalent influenza vaccines were used as the source of the virus: 1) A-USSR-90,92,97-77 (HlN1), 2) A-Eng1and-86lI-75Ü-I3N2), and 3) B-Hong Kong-8-73. Each milliliter of vaccine contains 5011g of hemagglutinin.

Testet tillgâr så att man på ett objektglas blandar dels en droppe vaccinsuspen- sion, dels en droppe treveckorsserum från de immuniserade kaninerna, dels ock en droppe (omsorgsfullt tvättade) hunderytrocyter uppslammade i fysiologisk koksaltlösníng (296 w/v suspension). Som kontroller användes en droppe 0,15 M fosfatbuffert respektive nollserum (dvs. serumprov före immuniseringen) från kaninernai stället för I droppe treveckorsserum.The test is performed by mixing on a slide a drop of vaccine suspension, a drop of three-week serum from the immunized rabbits, and a drop (carefully washed) canine erythrocytes suspended in physiological saline (296 w / v suspension). As controls, one drop of 0.15 M phosphate buffer and zero serum (ie serum sample before immunization) from the rabbits was used instead of 1 drop of three-week serum.

Ingen som helst hemagglutinering sker med treveckorsserum från de immuniserade kaninerna, medan hemagglutinering sker omedelbart (inom 1 mi- nut) vid samtliga kontroller. Ingen skillnad föreligger mellan de två kaninerna.No haemagglutination at all takes place with three-week serum from the immunized rabbits, while haemagglutination takes place immediately (within 1 minute) at all controls. There is no difference between the two rabbits.

Dessa resultat tyder entydigt på att injiceringen av polypeptidfraktionen enligt uppfinningen har medfört bildning av antikroppar, som är verksamma mot ett brett spektrum av virus.These results clearly indicate that the injection of the polypeptide fraction of the invention has led to the formation of antibodies which are active against a wide range of viruses.

Claims

1. Polypeptide Irradiation for Use as an Antiviral Drug, characterized in that it is isolated from the mussel haemolymph and has the ability to biospecifically bind at least one sialic acid in the presence of calcium ions, which polypeptide fraction can be obtained from , which has been heat-treated to destroy the lytic effect, by ﬁ entity chromatographic separation with respect to sialic acid binding capacity.

A polypeptide fraction according to claim 1 for use as a means of immunization.

Polypeptide fraction according to claim 1 for use as a vaccine against viral infections, in particular against infections caused by myxovirus, in particular influenza vaccine. l +. Polypeptide fraction according to claim 1 or 2 for use as a means for local immunization, in particular in the upper respiratory tract.