RU95663U1

RU95663U1 - DEVICE FOR CULTIVATION OF CELLS

Info

Publication number: RU95663U1
Application number: RU2009129364/22U
Authority: RU
Inventors: Игорь Викторович Запускалов; Ольга Ивановна Кривошеина; Игорь Альбертович Хлусов; Яна Александровна Мартусевич; Олег Борисович Кочмала
Original assignee: Федеральное агентство по науке и инновациям (Роснаука)
Priority date: 2009-07-29
Filing date: 2009-07-29
Publication date: 2010-07-10

Abstract

Устройство для культивирования клеток, содержащее камеру, заполненную питательной средой с полупроницаемым фильтром для размещения клеточного материала, отличающееся тем, что дополнительно содержит емкость, содержащую питательную среду, которая соединена с камерой через насос, обеспечивающий равномерное однонаправленное движение среды через фильтр со скоростью 2,1-2,4 мм/мин. A device for culturing cells containing a chamber filled with a nutrient medium with a semipermeable filter for accommodating cellular material, characterized in that it further comprises a container containing a nutrient medium, which is connected to the chamber through a pump, providing uniform unidirectional movement of the medium through the filter at a speed of 2.1 -2.4 mm / min.

Description

Полезная модель относится к области экспериментальной медицины, конкретно, к устройствам для обнаружения стволовых клеток.The utility model relates to the field of experimental medicine, specifically, to devices for detecting stem cells.

Методы культивирования клеток in vitro в настоящее время применяются для изучения биологических и структурных особенностей клеток, участвующих в различных патологических процессах, поскольку любой из них первоначально реализуется на клеточном уровне, сопровождаясь изменениями ультраструктуры и метаболизма клеток. В дальнейшем это ведет к нарушению функций тех или иных органов, тканей или систем организма. Именно через клетки, их взаимосвязи и взаимовоздействия опосредуются инициация, развитие и исход патологического процесса. Метод культуры клеток играет существенную роль в понимании единства и взаимопроникновения структуры и функций, позволяя изучать клетки в их живом состоянии, реальном действии и взаимодействии с микроокружением [1, 4]. Благодаря этому клетка в настоящее время рассматривается в качестве элементарной живой системы с собственными закономерностями организации и функционирования [5, 6].In vitro cell cultivation methods are currently used to study the biological and structural features of cells involved in various pathological processes, since any of them is initially implemented at the cellular level, accompanied by changes in the ultrastructure and metabolism of cells. In the future, this leads to disruption of the functions of certain organs, tissues or body systems. It is through the cells, their interconnections and mutual interactions, that the initiation, development and outcome of the pathological process are mediated. The cell culture method plays a significant role in understanding the unity and interpenetration of structure and functions, allowing the study of cells in their living state, real action and interaction with the microenvironment [1, 4]. Due to this, the cell is currently considered as an elementary living system with its own laws of organization and functioning [5, 6].

Наиболее близким к предлагаемой полезной модели является устройство для обнаружения стволовых клеток - чашка Петри, выполненная из стекла или пластика, состоящая из камеры заполненной питательной средой с полупроницаемым фильтром для размещения клеточного материала [1].Closest to the proposed utility model is a device for detecting stem cells - a Petri dish made of glass or plastic, consisting of a chamber filled with nutrient medium with a semi-permeable filter to accommodate cellular material [1].

Однако, известное устройство обладает следующими недостатками:However, the known device has the following disadvantages:

1. Условия культивирования недостаточно близки к естественным условиям их жизнеобеспечения.1. The cultivation conditions are not close enough to the natural conditions of their livelihoods.

2. Длительные сроки культивирования.2. Long term cultivation.

3. Невозможно получить большую численность культивируемых клеток.3. It is impossible to get a large number of cultured cells.

Новая техническая задача - повысить физиологичность условий культивирования клеток и уменьшить сроки их дифференцировки.A new technical task is to increase the physiological nature of cell culture conditions and reduce the time for their differentiation.

Для решения технической задачи в устройстве для обнаружения стволовых клеток, содержащем камеру, заполненную питательной средой с полупроницаемым фильтром для размещения клеточного материала, камера соединена с емкостью, содержащей питательную среду, через насос, обеспечивающий равномерное однонаправленное движение среды через фильтр со скоростью 2,1-2,4 мм³/мин.To solve the technical problem in a device for detecting stem cells containing a chamber filled with a nutrient medium with a semi-permeable filter to accommodate cellular material, the camera is connected to a container containing a nutrient medium through a pump that provides uniform unidirectional movement of the medium through the filter at a speed of 2.1- 2.4 mm ³ / min.

Полезная модель поясняется технологической схемой, изображенной на фигуре 1The utility model is illustrated by the technological scheme depicted in figure 1.

Устройство на фигуре 1 представляет собой замкнутую систему с камерой 1, содержащей полупроницаемый фильтр 2. Камера 1 соединяется с емкостью 3, заполненной питательной средой, через роликовый насос 4, например, аппарат «Аспиратор - 01», который снабжен поддерживающим клапаном 5 и обеспечивает равномерное однонаправленное движение среды. Камера 1 снабжена боковым клапанным отверстием 6 для введения клеточного материала, полупроницаемый фильтр 2 служит местом для его размещения.The device in figure 1 is a closed system with a chamber 1 containing a semi-permeable filter 2. The chamber 1 is connected to a tank 3 filled with a nutrient medium through a roller pump 4, for example, an aspirator-01 apparatus, which is equipped with a support valve 5 and ensures uniform unidirectional movement of the medium. The chamber 1 is provided with a lateral valve opening 6 for introducing cellular material, a semipermeable filter 2 serves as a place for its placement.

Устройство работает следующим образом. Систему устройства предварительно заполняют с помощью емкости 3 питательной средой, содержащей 80% среды McCoy 5A, 20% эмбриональной телячьей сыворотки и 4% раствор гентамицина (из расчета 0,02 мл на 10 мл среды). Для исследования работы устройства были выбраны мононуклеары крови, обладающие функциональной полипотентностью [3, 7, 9, 10]. Мононуклеары периферической крови здоровых доноров-добровольцев выделяли с помощью градиента фиколлверографин. Полученные методом фракционирования клетки доводят питательной средой до конечной концентрации 3·10⁶ нуклеаров/мл. Клеточный материал вводят в камеру 1 с помощью шприца через клапанное отверстие 6 в ее боковой части.The device operates as follows. The device system is pre-filled using a container 3 with a nutrient medium containing 80% McCoy 5A medium, 20% fetal calf serum and 4% gentamicin solution (based on 0.02 ml per 10 ml of medium). To study the operation of the device, blood mononuclear cells with functional polypotency were selected [3, 7, 9, 10]. The peripheral blood mononuclear cells of healthy volunteer donors were isolated using a ficollverographin gradient. The cells obtained by fractionation are adjusted with a nutrient medium to a final concentration of 3 · 10 ⁶ nuclears / ml. Cellular material is introduced into the chamber 1 by a syringe through the valve hole 6 in its lateral part.

После включения роликового насоса 4 в сеть в замкнутой системе устройства создается однонаправленное движение поддерживающей среды. Насос работает в постоянном режиме со скоростью 2,1-2,4 мм³/мин. Данная скорость выбрана на основании экспериментальных исследований и является оптимальной: скорость меньшей величины недостаточна для достижения поставленной цели, скорость большей величины ведет к механическому повреждению клеток. Клеточную культуру инкубируют при 37°С в водонасыщенной атмосфере при постоянном движении поддерживающей среды в течение 24, 48 и 72 часов. По окончании эксперимента фильтр извлекают из системы, клеточный материал фиксируют и исследуют с помощью цитохимических методов.After turning on the roller pump 4 in the network in a closed system of the device creates a unidirectional movement of the supporting medium. The pump operates in a constant mode with a speed of 2.1-2.4 mm ³ / min. This speed is selected on the basis of experimental studies and is optimal: a speed of a smaller value is insufficient to achieve the goal, a speed of a larger value leads to mechanical damage to the cells. The cell culture is incubated at 37 ° C in a water-saturated atmosphere with a constant movement of the supporting medium for 24, 48 and 72 hours. At the end of the experiment, the filter is removed from the system, the cellular material is fixed and examined using cytochemical methods.

В процессе культивирования in vitro мононуклеаров периферической крови в условиях направленного движения питательной среды получены следующие результаты. Через 24 ч культура мононуклеаров на фильтре была представлена прочно адгезированными к субстрату клетками округлой формы, с базофильной цитоплазмой, крупным бобовидным или круглым ядром. Цитохимически в клетках отмечали высокую активность α-нафтилацетатэстеразы, которая блокировалась фторидом натрия, что соответствует характеристике клеток моноцитарно-макрофагальной линии. Щелочная фосфатаза в культивируемых клетках не выявлялась. Через 48 ч в описываемых клетках отмечали повышение активности α-нафтилацетатэстеразы по сравнению с исходными показателями и клетками, которые культивировали в стандартных условиях (р<0,01). При проведении реакции с фторидом натрия на фильтре были обнаружены единичные элементы, в которых активность неспецифической эстеразы не подавлялась, а также выявлялась умеренная активность щелочной фосфатазы. По большинству морфологических параметров (форма клетки, форма и объем ядра, ядерно-цитоплазматическое отношение около 1) указанные клетки относятся к молодым формам фибробластической популяции. Через 72 ч культуры клеток на фильтре состояли из макрофагов и лимфоцитов, среди которых обнаруживались единичные, крупных размеров клетки неправильной, преимущественно, веретенообразной формы. Они были разобщены друг от друга по поверхности фильтра прочими клеточными элементами. Цитохимически в указанных клетках отмечали более высокую активность α-нафтилацетатэстеразы по сравнению с показателями через 48 ч культивирования и клетками, которые выращивали в стандартных условиях (р<0,01). Активность неспецифической эстеразы не подавлялась фторидом натрия. В подобных клетках отмечали также усиление активности щелочной фосфатазы по сравнению с показателем через 48 ч от начала эксперимента (р<0,01). Морфологические и цитохимические параметры указанных клеток соответствовали активно синтезирующим фибробластам.During in vitro cultivation of peripheral blood mononuclear cells under the conditions of directed motion of the nutrient medium, the following results were obtained. After 24 hours, the culture of mononuclear cells on the filter was represented by round-shaped cells firmly adhered to the substrate, with a basophilic cytoplasm, a large bean-like or round nucleus. Cytochemically in cells, a high activity of α-naphthylacetate esterase was observed, which was blocked by sodium fluoride, which corresponds to the characteristics of the cells of the monocyte-macrophage line. Alkaline phosphatase was not detected in cultured cells. After 48 h, the described cells showed an increase in the activity of α-naphthylacetate esterase as compared with the initial values and cells that were cultured under standard conditions (p <0.01). When conducting a reaction with sodium fluoride, single elements were found on the filter in which the activity of nonspecific esterase was not suppressed, and moderate alkaline phosphatase activity was detected. According to most morphological parameters (cell shape, shape and volume of the nucleus, nuclear-cytoplasmic ratio of about 1), these cells belong to young forms of the fibroblastic population. After 72 hours, the cell cultures on the filter consisted of macrophages and lymphocytes, among which there were single, large cells of an irregular, mainly spindle-shaped form. They were separated from each other along the filter surface by other cellular elements. Cytochemically in these cells, a higher activity of α-naphthylacetate esterase was noted compared with the parameters after 48 hours of cultivation and cells that were grown under standard conditions (p <0.01). Non-specific esterase activity was not inhibited by sodium fluoride. In similar cells, an increase in the activity of alkaline phosphatase was also noted as compared with the indicator 48 hours after the start of the experiment (p <0.01). Morphological and cytochemical parameters of these cells corresponded to actively synthesizing fibroblasts.

При культивировании мононуклеаров крови в стандартных (стационарных) условиях на протяжении всей серии экспериментов клеточная культура на фильтре была представлена клетками округлой формы. Цитохимически в клетках отмечали умеренную активность α-нафтилацетатэстеразы, которая постепенно повышалась в процессе культивирования (р<0,05), что связано с дифференцировкой моноцитов в макрофагальные клетки. Активность неспецифической эстеразы ингибировалась фторидом натрия. Щелочная фосфатаза в культивируемых клетках не выявлялась.During the cultivation of blood mononuclear cells under standard (stationary) conditions throughout the series of experiments, the cell culture on the filter was represented by round-shaped cells. Cytochemically in cells, moderate α-naphthylacetate esterase activity was noted, which gradually increased during cultivation (p <0.05), which is associated with the differentiation of monocytes into macrophage cells. Nonspecific esterase activity was inhibited by sodium fluoride. Alkaline phosphatase was not detected in cultured cells.

Таким образом, в предложенном устройстве реализация, преимущественно, дифференцировочных возможностей клеток-предшественников in vitro в значительной степени опосредуется не только полупроницаемым фильтром - субстратом, к которому адгезируются клетки; высокой плотностью первоначальной культуры; бедным составом питательной среды. Существенным фактором является наличие равномерного направленного движения питательной среды, что обеспечивается насосом.Thus, in the proposed device, the implementation, mainly, of the differentiating capabilities of the progenitor cells in vitro is largely mediated not only by a semipermeable filter - a substrate to which the cells adhere; high density of the original culture; poor composition of the nutrient medium. An essential factor is the presence of uniform directional movement of the nutrient medium, which is provided by the pump.

Прикрепление клеток к субстрату является необходимым условием для дальнейшего действия модулирующих факторов внеклеточной среды [2, 8]. Кроме того, обеспечивая динамическое напряжение и архитектуру цитоскелета, а также пространственно-временную ориентацию клеток, субстрат тем самым оказывает формообразующее влияние на морфофункциональные особенности культивируемых клеток. Взаимодействуя с поверхностными рецепторами клеток, элементы внеклеточного матрикса регулируют также кариотипическую структуру клеток, их подвижность, пролиферацию и дифференцировку. Возможно, адгезированные к фильтру клетки-предшественники, находясь на пути движения питательной среды, претерпевают серию модификационных трансформаций, в ходе которых проявляется активность разных ферментных систем. При постоянном модулирующем влиянии факторов микроокружения (направленный поток жидкости и наличие внеклеточного матрикса) клетки-предшественники быстрее дифференцируются в зрелые формы.Attachment of cells to the substrate is a prerequisite for the further action of modulating factors of the extracellular environment [2, 8]. In addition, providing dynamic stress and the cytoskeleton architecture, as well as the spatiotemporal orientation of cells, the substrate thereby has a shape-forming effect on the morphofunctional features of cultured cells. Interacting with surface cell receptors, the elements of the extracellular matrix also regulate the karyotypic structure of cells, their motility, proliferation and differentiation. It is possible that precursor cells adhered to the filter, being in the path of nutrient medium movement, undergo a series of modification transformations during which the activity of different enzyme systems is manifested. With a constant modulating effect of microenvironment factors (directed fluid flow and the presence of an extracellular matrix), progenitor cells differentiate more quickly into mature forms.

Таким образом, предлагаемое устройство позволяет культивировать клетки в более физиологичных условиях и обнаруживать стволовые клетки на ранних сроках, за счет возможности моделировать однонаправленное движение питательной среды со необходимой для этого процесса скоростью, что сокращает время их дифференцировки.Thus, the proposed device allows you to cultivate cells in more physiological conditions and detect stem cells in the early stages, due to the ability to simulate the unidirectional movement of the nutrient medium with the speed necessary for this process, which reduces the time of their differentiation.

Список литературыBibliography

1. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков / Пер. с англ. М.А.Попова // Под ред. В.Ю.Полякова. - М.: Мир, 1983. - 264 с.1. Adams R. Methods of cell culture for biochemists / Per. from English M.A. Popova // Ed. V.Yu. Polyakova. - M .: Mir, 1983 .-- 264 p.

2. Епифанова О.И. Покоящиеся клетки. Свойства и функции организме / О.И.Епифанова, В.В.Терских., В.А.Полуновский. - М.: Наука, 1983. - 176 с.2. Epifanova O.I. Resting cells. Properties and functions of the body / O.I. Epifanova, V.V. Terskikh., V.A. Polunovsky. - M .: Nauka, 1983 .-- 176 p.

3. Земсков В.М. Гетерогенность мононуклеарных фагоцитов / В.М.Земсков, Е.Н.Николаева, С.В.Родионов // Успехи совр. биологии. - 1993. - Т.113, вып.3. - С.336-350.3. Zemskov V.M. Heterogeneity of mononuclear phagocytes / V.M. Zemskov, E.N. Nikolaeva, S.V. Rodionov // Successes sovr. biology. - 1993. - T.113, issue 3. - S.336-350.

4. Новые методы культуры животных тканей / Пер. с англ. // Под ред. Ю.М.Оленева. - М., "Мир", 1976. - 255 с.4. New methods of culture of animal tissues / Transl. from English // Ed. Yu.M. Oleneva. - M., "Mir", 1976. - 255 p.

5. Петленко В.В. Закон сохранения структурной организации живых систем / В.В.Петленко, С.А.Симбирцев, О.К.Хмельницкий // Морфология. - 1993. - Т.105, вып.11-12. - С.131-141.5. Petlenko V.V. The law of conservation of the structural organization of living systems / V.V. Petlenko, S.A. Simbirtsev, O.K. Khmelnitsky // Morphology. - 1993. - T.105, issue 11-12. - S.131-141.

6. Свенсон К. Клетка / К.Свенсон, П.Уэбстер: Пер. с англ. - М.: Мир, 1980. - 303 с.6. Svenson K. Cell / C. Swenson, P. Webster: Transl. from English - M .: Mir, 1980 .-- 303 p.

7. Учитель И.Я. Макрофаги в иммунитете / И.Я.Учитель. - М.: Медицина, 1978. - 200 с.7. Teacher I.Ya. Macrophages in immunity / I.Ya. Teacher. - M .: Medicine, 1978. - 200 p.

8. Хрущов Н.Г. Стволовые клетки крови / Н.Г.Хрущов, В.И.Старостин, Е.И.Домарацкая // Итоги науки и техники. Морфология человека и животных. - 1988. - №13. - С.4-173.8. Khrushchov N.G. Blood stem cells / N.G. Khrushchov, V.I. Starostin, E.I. Domarackaya // Itogi Nauki i Tekhniki. Morphology of humans and animals. - 1988. - No. 13. - S. 4-173.

9. Mononuclear phagocytes: Functional aspects / Eds. R. van Furth. - New York: М. Nijholt, 1980. - 1938 р.9. Mononuclear phagocytes: Functional aspects / Eds. R. van Furth. - New York: M. Nijholt, 1980 .-- 1938 p.

10. Ryu J.Н. Monocyte heterogeneity in angiotensinconverting enzyme induction mediated by autologous T-lymphocytes / J.Н.Ryu, М.S.Rohrbach // Clin. Exp. Immunol. - 1992. - Vol.88, №2. - P.288-294.10. Ryu J.N. Monocyte heterogeneity in angiotensin converting enzyme induction mediated by autologous T-lymphocytes / J.N. Ryu, M.S. Rohrbach // Clin. Exp. Immunol. - 1992. - Vol. 88, No. 2. - P.288-294.

Claims

A device for culturing cells containing a chamber filled with a nutrient medium with a semipermeable filter for accommodating cellular material, characterized in that it further comprises a container containing a nutrient medium, which is connected to the chamber through a pump, providing uniform unidirectional movement of the medium through the filter at a speed of 2.1 -2.4 mm / min.